CN104342487B

CN104342487B - 支原体核酸恒温扩增方法

Info

Publication number: CN104342487B
Application number: CN201310330643.8A
Authority: CN
Inventors: 王敏; 马道亮; 汤嘉维; 于明辉; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2018-02-02
Anticipated expiration: 2033-07-31
Also published as: CN104342487A

Abstract

本发明公开了一种支原体核酸恒温扩增方法，具体地，本发明方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物可以从极低支原体拷贝数的检测样品中扩增出对应于支原体特征性序列的扩增产物。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有支原体RNA的待测样品进行扩增，尤其适用于对含有生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP的待测样品进行扩增和检测，具有检测效率高，准确度高的特点。

Description

支原体核酸恒温扩增方法

技术领域

本发明涉及微生物的生物检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的支原体的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

支原体是一类介于细菌与病毒之间的原核细胞微生物，缺少细胞壁，能独立复制。寄生于人和其他灵长类动物的泌尿生殖道中，依靠高度特异的寄生机制包括独特的顶端细胞器移植并侵入到人类细胞。

近年来大量的流行病学资料提示，生殖支原体MG是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多非淋球菌性尿道炎(NGU)、前列腺炎和盆腔炎等都有关系，是性传播疾病的病原体之一。

目前，MG的主要检测方法有：培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足同时处理大量样本的需要。分子生物学方法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染，易受其他因素影响。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。

肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）感染不仅引起肺部病变，且能侵入心、脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。由于感染常无特异性表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆。

目前，MP的实验室诊断方法有培养法、免疫学方法和分子生物学方法等。然而，传统的MP分离培养需3周甚至更长时间；MP快速培养法是利用MP在选择性液体培养基中生长，根据其代谢产物使培养基颜色发生改变的特点来判断MP是否生长，显著缩短了MP的培养时间，一般实验室均可开展，但在判断时需要注意假阴性。

免疫学方法包括很多，其中冷凝集试验（cold agglutinin test，CAT）的敏感性及特异性均不理想。富士明胶颗粒凝集法（polystyrene latex agglutination reaction，PLA）的灵敏度和特异性均提高，操作简单，价格便宜，无需特殊仪器设备，3小时能出报告，适合临床常规检查。ELISA间接法用于检测血清中特异性的IgM和IgG抗体，但检测结果受免疫系统状况的影响。

分子生物学主要为检测DNA的PCR法和检测RNA的恒温扩增检测法。PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。从理论上PCR可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA。除了样本中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染。

最新发展RNA恒温扩增技术的是Gen-Probe公司的转录介导扩增法（TMA），其采用化学发光法进行终点检测，在检测中，需要打开反应管进行灭活，在污染控制上稍显不足。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous AMGlification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对生殖支原体(MG)及肺炎支原体(MP)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的支原体RNA检测方法。

本发明的第一方面，提供了一种支原体的扩增方法，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。

在另一优选例中，所述反应体系中还包括M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性捕获探针。

在另一优选例中，所述的待测支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。

在另一优选例中，所述反应体系还包括待测支原体的特异性检测探针。

在另一优选例中，所述的捕获探针的一端标记荧光基团，另一端标记淬灭基团。

在另一优选例中，所述的检测探针的5’端标记FAM荧光基团，且检测探针的3’端标记DABCYL淬灭基团。

在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

在另一优选例中，所述的捕获探针可与生殖支原体MG的靶标核酸(MG RNA)序列特异结合。

在另一优选例中，所述方法还包括：在另一对照反应体系中进行扩增反应。

在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MG内标(MG ICRNA)、所述捕获探针和所述检测探针。

在另一优选例中，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的MG检测探针用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述MG靶标核酸(MG RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。

在另一优选例中，所述的反应体系中生殖支原体MG或的拷贝数小于100个，较佳地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。

在另一优选例中，所述的捕获探针可与肺炎支原体MP的靶标核酸(MP RNA)序列特异结合。

在另一优选例中，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MP内标(MP ICRNA)、所述MP捕获探针和所述MP检测探针。

在另一优选例中，所述的MP检测探针用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述MP靶标核酸(MP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合。

在另一优选例中，所述的反应体系中肺炎支原体MP或的拷贝数小于100个，较佳地为1-50个拷贝，更佳地为1-10个拷贝。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。

在另一优选例中，所述方法为实时荧光核酸恒温扩增法。

在另一优选例中，所述反应体系中还含有待测的生殖支原体或衍生自所述生殖支原体核酸。

在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样品或人类泌尿生殖道分泌物的核酸。

在另一优选例中，所述的待测核酸是来自环境样本或人类泌尿生殖道或呼吸道分泌物的核酸。

本发明的第二方面，提供了一种支原体的非诊断性检测方法，所述检测方法包括：

用如本发明第一方面中所述的扩增方法扩增待测样品；和

在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性探针发出的荧光信号。

在另一优选例中，所述方法还包括设置一个或多个对照组。

在另一优选例中，所述对照组包括：阳性对照组、阴性对照组、内标对照组。

本发明的第三方面，提供了一种支原体的检测试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增生殖支原体的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示;

以及使用说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒用于检测含有生殖支原体(MG)和/或肺炎支原体(MP)的待测样品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的一种或多种组分：

(b)捕获探针；

(c)检测探针；

(d)待测序列的内标序列；和/或

(e)内标检测探针。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。

在另一优选例中，所述的酶是M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和MG检测探针存在于一检测液中。

在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和MP检测探针存在于一检测液中。

在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于MG检测液中。

在另一优选例中，所述的内标检测探针存在于MP检测液中。

在另一优选例中，所述MG内标为竞争性内标，并与MG靶标核苷酸(MG RNA)使用同一对引物(T7和nT7)。

在另一优选例中，所述MP内标为竞争性内标，并与MP靶标核苷酸(MP RNA)使用同一对引物(T7和nT7)。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括阳性对照和/或阴性对照。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括MG阳性对照和/或MG阴性对照。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括MP阳性对照和/或MP阴性对照。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一个或多个特征：

所述捕获探针是与生殖支原体的靶标核酸(MG RNA)序列特异结合的捕获探针；和/或

所述检测探针是与根据所述MG靶标核酸(MG RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MG检测探针；和/或

所述的待测序列的内标序列是MG的内标序列。

所述捕获探针是与肺炎支原体的靶标核酸(MP RNA)序列特异结合的捕获探针；和/或

所述检测探针是与根据所述MP靶标核酸(MP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MP检测探针；和/或

所述的待测序列的内标序列是MP的内标序列。

在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的MG检测探针还可与生殖支原体MG的靶标核酸(MG RNA)序列特异结合。

在另一优选例中，所述的捕获探针和/或所述的MP检测探针还可与肺炎支原体MP的靶标核酸(MP RNA)序列特异结合。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、MG反应液、MG检测液、SAT酶液、MG阳性对照、MG阴性对照和MG内标；

其中，

所述裂解液包括硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

所述MG反应液包括dNTP和NTP；

所述MG检测液包括T7引物、nT7引物、MG检测探针和内标检测探针；

所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述MG阳性对照包括含生殖支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

所述的MG阴性对照是不含有生殖支原体靶标核酸(MG RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；

MG内标：含MG内标RNA(MG IC RNA，序列如SEQ ID NO:7所示)稀释物。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、MP反应液、MP检测液、SAT酶液、MP阳性对照、MP阴性对照和MP内标；

其中，

所述裂解液包括硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

所述MP反应液包括dNTP和NTP；

所述MP检测液包括T7引物、nT7引物、MP检测探针和内标检测探针；

所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述MP阳性对照包括含肺炎支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

所述的MP阴性对照是不含有肺炎支原体靶标核酸(MP RNA)序列或不含有肺炎支原体的溶液，较佳地，所述的阴性对照是生理盐水；

MP内标：含MP内标RNA(MP IC RNA，序列如SEQ ID NO:14所示)稀释物。

在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

A盒为标本处理单元，包括所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液；

B盒为核酸扩增检测单元，包括所述MG反应液、MG检测液、SAT酶液、MG阳性对照、MG阴性对照及MG内标。

在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

B盒为核酸扩增检测单元，包括所述MP反应液、MP检测液、SAT酶液、MP阳性对照、MP阴性对照及MP内标。

所述检测探针包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；和/或

所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或

所述的待测序列的内标序列包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；和/或

所述的内标检测探针包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

或所述的试剂盒包括选自下组的一个或多个特征：

所述检测探针包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；和/或

所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；和/或所述的待测序列的内标序列包括如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；和/或

所述的内标检测探针包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的支原体优选为生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。

本发明的第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的试剂盒或本发明第四方面所述的引物对的用途，其特征在于，用于检测在环境微生物样品或人类泌尿生殖道分泌物或人类呼吸道分泌物样品中是否存在支原体。

在另一优选例中，所述的环境微生物样品包括：水源、贝类等水产品、水果和蔬菜等即食性食品、色拉，或其组合。

在另一优选例中，所述的人类泌尿生殖道分泌物样本包括尿液、男性尿道分泌物、前列腺液、精液、尿液离心沉淀物，宫颈和阴道分泌物；所述的人类呼吸道分泌物样本包括痰液、胸膜积液、支气管肺泡灌洗物、气管吸液。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为比对组MG的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图2为本发明组MG的引物对序列的荧光检测结果；

图3为比对组MP的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图4为本发明组MP的引物对序列的荧光检测结果；

图5为MG临床拭子样本SAT检测的靶标荧光检测结果；

图6为MG临床拭子样本SAT检测的内标荧光检测结果；

图7为MG临床拭子样本SAT检测的熔解曲线图；

图8为MP临床咽拭子样本SAT检测的靶标荧光检测结果；

图9为MP临床咽拭子样本SAT检测的内标荧光检测结果；

图10为MP临床咽拭子样本SAT检测的熔解曲线图。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，经过大量筛选和验证，开发了一种高特异性，高灵敏度，且能够用于多种支原体核酸扩增的引物对。使用该特定的引物序列对支原体的核酸进行扩增，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测一系列支原体。基于上述发现，发明人完成了本发明。

引物

如本文所用，术语“扩增支原体的特异性引物”指这样的引物(对)，它扩增出的扩增产物具有支原体的互补链序列。优选的引物序列包括如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成的引物对，所述的引物对可以用于扩增支原体的RNA序列，较佳地可以用于扩增生殖支原体和/或肺炎支原体的靶标核酸序列，可以用于单一支原体的检测或多种支原体的总量检测。

本发明的引物序列设计包括使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计，得到支原体通用的引物序列。

在引物设计过程中，产生了诸多对支原体通用引物序列，比如T7-2引物序列：5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTTCCTTCATATATCTACGCAT3’(SEQ ID NO:11)，nT7-2引物序列：5’CGCAGGCGGATTGAAAAGTCT3’(SEQ ID NO:12)，以及SEQ ID NO：3、SEQ ID NO:4等。将上述各序列用专利CN201110071284.X中所述的反应体系进行扩增，比对灵敏度检测并选取较优者。

结果如图1，图2(图1为比对组，图2为本发明组)。比对组的灵敏度可检测出10²copies/反应，而本发明组的灵敏度可达10copies/反应，因此筛选得到引物对：SEQ IDNO：3、SEQ ID NO:4。

探针

在本发明的扩增方法中，除引物外，反应体系中还可以包括一个或多个探针，如检测探针，捕获探针等。所述的各探针可以根据不同的目标核酸序列进行设计。

如本文所用，术语“生殖支原体MG的捕获探针”指可与生殖支原体MG的靶标核酸(MG RNA)序列特异结合的核苷酸序列。本发明的一种优选的捕获探针具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕获探针特异结合于生殖支原体MG的靶标核酸(MGRNA)序列。在另一优选例中，当所述生殖支原体MG含有MG内标(MG IC RNA)时，所述捕获探针还可以与所述MG内标序列特异结合，用于设计阴性对照组。

如本文所用，术语“肺炎支原体MP的捕获探针”指可与肺炎支原体MP的靶标核酸(MP RNA)序列特异结合的核苷酸序列。本发明的一种优选的捕获探针具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。更佳地，所述的捕获探针特异结合于肺炎支原体MP的靶标核酸(MPRNA)序列。在另一优选例中，当所述肺炎支原体MP含有MP内标(MP IC RNA)时，所述捕获探针还可以与所述MP内标序列特异结合，用于设计阴性对照组。

支原体检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。本发明的优选的检测探针具有如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。

如本文所用，术语“内标探针”和“内标检测探针”可互换使用，均指本发明的试剂盒中，用于检测内标序列的探针序列。本发明中，优选的内标探针具有如SEQ ID NO:6所示的序列。

对照物

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。

所述的对照物可以是通用对照物，如支原体通用对照物；也可以是根据各检测对象针对性地设计的特异对照物。

本发明中，可以设置的参照物包括：阳性对照、阴性对照和内标中的一个或多个对照物。

阳性对照可以是为体外转录的RNA，不具有生物学活性。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。

此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1:1混合成为稀释液，稀释阳性对照100倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。

内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。内标作为待测支原体RNA的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。

阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

在另一优选例中，所述体外转录的靶标RNA通过下述方法制备：

(1)用化学合成法合成待测支原体的基因片段，例如，在本发明的优选例中，所示的基因片段可以是SEQ ID NO:8所示的MG阳性片断，或SEQ ID NO:15所示的MP阳性片段；

(2)将所得到的待测支原体基因片段插入到-T载体中，构建阳性对照质粒；

(3)将上述的阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，贮存于-70℃；

(4)从菌株中提取阳性对照质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

在另一优选例中，所述内标中的体外转录的内标RNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同待测支原体的靶标序列区域；如，在本发明的优选例中，所述的序列可以是SEQ ID NO:9所示的MG内标片断，或如SEQ ID NO:16所示的MP内标片断；

(2)将片段克隆到-T载体中，构建待测支原体的内标质粒；

(3)将所制备的内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，贮存于-70℃；

(4)从所述的菌株中提取内标质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

检测方法

本发明还提供了支原体的通用检测方法，包括用本发明所述的特异性引物对待测样品进行扩增；和

在扩增反应过程中或之后，检测待测支原体的扩增产物，例如通过检测特异性探针发出的荧光信号。

所述方法还可以任选地包括设置一个或多个对照组，如阳性对照组、阴性对照组、内标组等。

在本发明中，检测方法可以用常规的PCR方法，也可用实时荧光检测法等不同的方法。一种特别优选的方法是实时荧光核酸恒温扩增法。

实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)

核酸恒温扩增实时荧光检测技术，其原理是将RNA恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术。首先通过M-MLV反转录酶、T7RNA多聚酶和优化探针(optimalprobe,patent pending)技术来同时实现。反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和这些RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。检验结果根据实时荧光信号的出现时间和强度，结合阳性对照、阴性对照、内标信号和溶解曲线对检验结果进行判定。

在本发明中，支原体通用型检测技术通过使用高特异性和高灵敏度的专用引物对，并配合使用专用的捕获探针，可高效、特异性捕获支原体的RNA。核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。

支原体检测试剂盒

本发明提供了一种支原体的检测试剂盒，包括：

(a)扩增支原体的特异性引物对，所述引物扩增出的扩增产物具有支原体的互补链序列；

(b)捕获探针；和

(c)检测探针。

所述的引物对是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生待测支原体序列靶标核酸的DNA拷贝的支原体扩增引物，在本发明中，所述的扩增引物可以是：SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4。

所述的捕获探针是与支原体的靶标核酸序列特异结合的捕获探针；如与生殖支原体的靶标核酸(MG RNA)序列特异结合，或与肺炎支原体的靶标核酸(MP RNA)序列特异结合的捕获探针；所述的检测探针是与根据所述靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，如与根据所述MG靶标核酸(MG RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MG检测探针，或与根据所述MP靶标核酸(MP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MP检测探针。

所述的待测支原体还可以被设计为含有内标(MG IC RNA)或含有内标(MP ICRNA)，较佳地，当待测支原体含有内标时，所述捕获探针和检测探针被设计为还可以与所述内标序列特异结合，形成内标对照组。在另一优选例中，所述内标为竞争性内标，并与靶标核苷酸使用同一对引物(T7和nT7)。

所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和支原体检测探针存在于一检测液中。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、反应液、检测液、SAT酶液、阳性对照、阴性对照和内标；其中，所述裂解液包括硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

在另一优选例中，当所述的试剂盒用于检测MG时：

所述MG反应液包括dNTP和NTP；

所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述MG阳性对照包括生殖支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

MG内标：含MG内标RNA(MG IC RNA，序列如SEQ ID NO:7所示)稀释物。

在另一优选例中，当所述的试剂盒用于检测MP时：

所述MP反应液包括dNTP和NTP；

所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述MP阳性对照包括肺炎支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

MP内标：含MP内标RNA(MP IC RNA，序列如SEQ ID NO:14所示)稀释物。

在另一优选例中，所述试剂盒的一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM；

(2)核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM，捕获探针1-50μΜ(优选为5-25μΜ)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

(4)MG反应液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP401-10%，KCl5-40mM；

(5)MG检测液：将MG扩增引物和MG检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，MG检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1%(v/v)Triton X-100和20-50%(v/v)glycerol；

(7)MG阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL生殖支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

(8)MG阴性对照：不含有生殖支原体靶标核酸(MG RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液；

(9)MG内标：含10⁵拷贝/mL MG IC RNA(序列如SEQ ID NO:7所示)稀释物。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一个或多个容器，且上述的各个组分可分别位于一个或多个容器中，在另一优选例中，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

在另一优选例中，所述的检测探针包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，和/或所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

利用以上试剂盒对生殖支原体进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：

1)用裂解液裂解待测样品中的生殖支原体，得到含有生殖支原体核酸的裂解液；

2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和和MG IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到生殖支原体的核酸(RNA)和MG IC RNA；

3)将步骤2)提取的生殖支原体的核酸(RNA)和MG IC RNA加入由MG反应液和MG检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；

4)根据荧光信号产生的时间和强度参照MG阳性对照、MG阴性对照和MG内标检测结果对待测样品进行定性检测。

在上述检测操作中，所述步骤1)中的待测样品为环境微生物样本，或者宫颈拭子、阴道拭子、男性尿道拭子、前列腺液、精液、尿液或尿液离心沉淀物。

(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM；

(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

(4)MP反应液：Tris10-50mM，MPCl210-40mM，dNTP0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP401-10%，KCl5-40mM；

(5)MP检测液：将MP扩增引物和MP检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，MP检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-乙酰-L-半胱氨酸、0.04-0.4mM醋酸锌、10-100mM海藻糖、40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1%(v/v)Triton X-100和20-50%(v/v)丙三醇；

(7)MP阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL肺炎支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

(8)MP阴性对照：不含有肺炎支原体靶标核酸(MP RNA)序列或不含有肺炎支原体的溶液；

(9)MP内标：含10⁵拷贝/mL MP IC RNA(序列如SEQ ID NO:14所示)稀释物。

在另一优选例中，所述的检测探针包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，和/或所述的捕获探针包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

利用以上试剂盒对肺炎支原体进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：

1)用裂解液裂解待测样品中的肺炎支原体，得到含有肺炎支原体核酸的裂解液；

2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和和MP IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到肺炎支原体的核酸(RNA)和MP IC RNA；

3)将步骤2)提取的肺炎支原体的核酸(RNA)和MP IC RNA加入由MP反应液和MP检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育40分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3：1；

4)根据荧光信号产生的时间和强度参照MP阳性对照、MP阴性对照和MP内标检测结果对待测样品进行定性检测。

在上述检测操作中，所述步骤1)中的待测样品为：人类呼吸道分泌物样本包括痰液、胸膜积液、支气管肺泡灌洗物、气管吸液等。

与现有的支原体检测方法相比，本发明具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对支原体靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获支原体的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要90分钟(40分钟扩增，50分钟熔解曲线检测)

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

(5)高准确度：利用熔解曲线根据序列中G-C含量的不同引起溶解温度Tm不同的特点，结合阳性、阴性对照和内标对照，可区分扩增产物是否为目标RNA，提高检测准确度。

综上所述，本发明试剂盒能够检测环境微生物及人类泌尿生殖道分泌物样本中的支原体RNA，所述的样本包括(但并不限于)：尿液、男性尿道分泌物、前列腺液、精液、尿液离心沉淀物，宫颈和阴道分泌物；人类呼吸道分泌物样本包括痰液、胸膜积液、支气管肺泡灌洗物、气管吸液，具有特异性高、灵敏度高(可达100拷贝/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(90分钟完成扩增检测和熔解曲线)的特点，将在生殖支原体早期感染的诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国 RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1用于实时荧光核酸恒温扩增检测生殖支原体(MG)的专用引物和探针的设计

本发明选择MG病毒16SRNA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测生殖支原体(MG)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一条可与生殖支原体(MG)的靶标核酸(MG RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为:5’TGCACACCGGATGGCCAATCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA3’(SEQ ID No.:2)；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生MG靶标核酸(MG RNA)的DNA拷贝的MG扩增引物，所述MG扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为：5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACACCGCTCCACATGAAATT CCAAAACTCCC3’(SEQ ID No.:3)，nT7引物序列为5’CGGTAATACATAGGT CGCAAGC3’(SEQ ID NO:4)；

(3)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述MG靶标核酸(MG RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MG检测探针，所述MG检测探针的核苷酸序列为5’CGGACUAUCAGUCUAGAGUGUGUCCG3’(SEQ ID NO:5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

在引物设计过程中，产生了诸多对引物序列，比如：T7引物序列：5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTTCCTTCATATATCTACGCAT3’，nT7引物序列：5’CGCAGGCGGATTGAAAAGTCT3’。

与本发明序列3,4,5比对灵敏度检测，选取较优者。反应体系参考专利201110071284.X中所述，结果如图1，图2(图1为比对组，图2为本发明组)。从结果可看出，从结果可看出，比对组的灵敏度可检测出10²copies/反应，本发明组可检测出10copies/反应，明显本发明组优于比对组。

通过筛选、比对各设计引物对、探针序列，可挑选出检测灵敏度高的最佳引物、探针序列作为本发明相应序列。

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的MG内标(SEQ ID NO:7)，设计了内标检测探针，MG内标与MG靶标核苷酸(MG RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述MG内标可通过MG靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与MG检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’CCGACAGUACAGCUGAGACCACUUUGAUAGUCGG3’(SEQ ID NO:6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2用于实时荧光核酸恒温扩增检测肺炎支原体(MP)的专用引物和探针的设计

本发明选择MP病毒16SRNA基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)，根据引物探针设计原理，使用DNAStar、DNAMAN软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测肺炎支原体(MP)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列：

(1)一条可与肺炎支原体(MP)的靶标核酸(MP RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为:5’TGCACACCGGATGGCCAATCCAATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAA3’(SEQ ID No.:2)；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生MP靶标核酸(MP RNA)的DNA拷贝的MP扩增引物，所述MP扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为：5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACACCGCTCCACATGAAATT CCAAAACTCCC3’(SEQ ID No.:3)，nT7引物序列为5’CGGTAATACATAGGT CGCAAGC3’(SEQ ID NO:4)；

(3)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述MP靶标核酸(MP RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的MP检测探针，所述MP检测探针的核苷酸序列为5’CGGACUAUUAAUCUAGAGUGUGUCCG3’(SEQ ID NO:13)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

在引物设计过程中，产生了诸多对引物序列，比如：T7-2引物序列：5’AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTTCCTTCATATATCTACGCAT’3，nT7-2引物序列：5’CGCAGGCGGATTGAAAAGTCT’3。

与本发明SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4比对灵敏度检测，选取较优者。反应体系参考专利201110071284.X中所述，结果如图3，图4(图3为比对组，图4为本发明组)。从结果可看出，从结果可看出，比对组的灵敏度可检测出10²copies/反应，本发明组可检测出10copies/反应，明显本发明组优于比对组。

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的MP内标(SEQ ID NO:14)，设计了内标检测探针，MP内标与MP靶标核苷酸(MP RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述MP内标可通过MP靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与MP检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’CCGACAGUACAGCUGAGACCACUUUGAUAGUCGG3’(SEQ ID NO:6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例3生殖支原体(MG)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明生殖支原体(MG)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、MG检测探针、内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等组分。

所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和MG检测探针、内标检测探针存在于MG检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15--35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括MG反应液、MG检测液、SAT酶液、MG阳性对照、MG阴性对照和MG内标，主要成分如下：

A盒(标本处理单元)组成为：

裂解液；含硫酸铵((NH4)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

洗涤液：主要含1%(V/V)SDS。

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

MG反应液：含dNTP0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)；

MG检测液：含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，MG检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

MG阳性对照；含10⁶-10⁸拷贝/mL生殖支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

MG阴性对照：不含有生殖支原体靶标核酸(MG RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液，如生理盐水；

MG内标：含10⁵拷贝/mL MG内标RNA稀释物(SEQ ID NO:7)。

试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。

具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：

(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH4)2SO45-50mM；

(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

(4)MG反应液：Tris10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP401-10%，KCl5-40mM；

(7)MG阳性对照；含10⁶-10⁸拷贝/mL生殖支原体(MG)16SRNA的体外转录RNA稀释物；

(8)MG阴性对照：不含有生殖支原体(MG)靶标核酸(MG RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液；

(9)MG内标：含10⁵拷贝/mL MG内标RNA(SEQ ID NO:7)稀释物。

MG阳性对照中的体外转录的MG RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成MG基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)；

(2)将MG基因片段插入到-T载体中，构建MG阳性对照质粒；

(3)MG阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-MG菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-MG菌株中提取-T-MG质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

MG内标中的体外转录的MG IC RNA，可以通过多种方法制备所得。其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同MG靶标序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)；

(2)将片段克隆到-T载体中，构建MG内标质粒；

(3)MG内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-MG IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-MG IC菌株中提取-T-MG IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA

实施例4、临床样本拭子的MG实时荧光核酸恒温扩增检测

用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测临床样本拭子中的生殖支原体，具体方法包括以下步骤：

1、样本采集、运输及保存

由实验者根据实际情况进行标本采集，检测标本为拭子，采集方法为：用医用棉拭子伸入男性尿道口、女性宫颈口或女性阴道约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后取出后，将拭子头放入1ml生理盐水浸泡贴管壁挤干，取0.5ml加入0.5ml尿样保存液混合，该样品即为待测样本。

2、核酸提取

2.1在样品处理管(1.5mL离心管)中加入200μl裂解液(HEPES50mM，(NH₄)₂SO₄35mM)和200μl拭子洗液(用生理盐水洗涤下的样本溶液，不足以生理盐水补足)，用裂解液裂解待测样品中的生殖支原体，得到含有生殖支原体核酸的裂解液。

2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100μl核酸提取液(HEPES200mM，EDTA100mM，LiCl800mM，捕获探针15μΜ，磁珠150mg/L)和10μl内标溶液(含10⁵拷贝/mL MG内标RNA)，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。

2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(HEPES25mM，NaCl150mM，1%SDS，EDTA2.5mM；)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。

2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

3、SAT核酸扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl反应检测液(40μl MG反应液＋2.5μl MG检测液)洗涤磁珠。MG反应液具体包含Tris15mM，MgCl₂15mM，dNTP2.5mM，NTP3mM，PVP401%，KCl10mM；MG检测液中T7引物浓度为7.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，MG检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7RNA聚合酶1000U/反应、10mM HEPES pH7.5、15mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mM zinc acetate(乙酸锌)、20mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH8.0、80mMKCl、0.25mM EDTA、0.5%(v/v)Triton X-100和30%(v/v)glycerol(丙三醇)。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品)，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(内标信号检测，F2)；之后加上40℃-80℃的熔解曲线。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

①阳性结果判断：

F1通道：dt≤35且熔解曲线在68±5℃区间有吸收峰的样本为阳性，35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40且熔解曲线在68±5℃区间有吸收峰的样本为阳性。

②阴性结果判定：

a、F2通道：dt≤35，且F1通道：dt无数值或为40，同时熔解曲线在68±5℃区间有或者无吸收峰，均为阴性；

b、F1通道：dt≤35但熔解曲线在68±5℃区间没有吸收峰，则为阴性。

注：如果标本F1通道为dt无数值或为40，F2通道也为dt无数值或为40，则说明反应可能受到抑制，此标本检测结果无效，建议重新检测。

5、结果

生殖支原体拭子临床样本编号为MG拭子标本，编号1-5，另设MP拭子标本(编号6)，阴性对照(不含有生殖支原体靶标核酸(MG RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液)、阳性对照(含10⁷拷贝/mL生殖支原体基因的体外转录RNA稀释物) 各一个。结果如图5(F1荧光通道)、图6(F2荧光通道)和图7(溶解曲线图)所示，根据F1通道、F2通道的dt值和溶解曲线温度的情况，判定样本1、2、4为阳性，样本3、5、6为阴性(MG阴性)。其中样本6用MG试剂盒进行检测，其靶标、内标的扩增曲线与其他MG阳性样本无差别，但通过熔解曲线明显区分出MG、MP阳性样本，最终确定MG阳性样本。本结果与金标准病毒培养结果完全相同，表明本发明试剂盒用于检测临床样本拭子中的生殖支原体准确性高，但上机扩增检测时间仅需90分钟(40分钟检测，50分钟熔解曲线)具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

实施例5、肺炎支原体(MP)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

本检测模式为本发明的另一个应用：运用MP试剂盒对咽拭子临床样本进行检测。

1.MP试剂盒的组成：

A盒组成同实施例2，B盒组成如下：

MP反应液：含dNTP0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)；

MP检测液：含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，MP检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

MP阳性对照；含10⁶-10⁸拷贝/mL肺炎支原体16SRNA的体外转录RNA稀释物；

MP阴性对照：不含有肺炎支原体靶标核酸(MP RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液，如生理盐水；

MP内标：含10⁵拷贝/mL MP内标RNA稀释物(SEQ ID NO:14)。

(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH4)₂SO₄5-50mM；

(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1%SDS，EDTA1-10mM；

(4)MP反应液：Tris10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP0.1-10mM(优选为 0.5-5mM)，NTP1-20mM(优选为1-10mM)，PVP401-10%，KCl5-40mM；

(7)MP阳性对照；含10⁶-10⁸拷贝/mL肺炎支原体(MP)16S RNA的体外转录RNA稀释物；

(8)MG阴性对照：不含有肺炎支原体(MP)靶标核酸(MP RNA)序列或不含有生殖支原体的溶液；

(9)MP内标：含10⁵拷贝/mL MP内标RNA(SEQ ID NO:14)稀释物。

MP阳性对照中的体外转录的MG RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种优选的制备方法如下：

(1)用化学合成法合成MP基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)；

(2)将MP基因片段插入到-T载体中，构建MP阳性对照质粒；

(3)MP阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-MP菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-MG菌株中提取-T-MP质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

MP内标中的体外转录的MP IC RNA，可以通过多种方法制备所得。其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同MP靶标序列区域(其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)；

(2)将片段克隆到-T载体中，构建MP内标质粒；

(3)MP内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-MP IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-MP IC菌株中提取-T-MP IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA

实施例6、临床样本咽拭子的MP实时荧光核酸恒温扩增检测

用本发明试剂盒(组成见实施例4)检测临床样本拭子中的生殖支原体，具体方法包括以下步骤：

1、采样

由临床医师根据实际情况进行标本采集，采集方法为：用医用棉拭子取咽部分泌物，将拭子头放入1ml生理盐水浸泡贴管壁挤干，取500μl加入到500μl裂解液中备用，该样品即为待测样本。肺炎支原体咽拭子临床样本编号为MP咽拭子标本1-3，取MG阳性剩余样本一个，编号4，另设阴性对照、阳性对照各一个。

2、实验操作

核酸提取、扩增过程基本同实施例3，结果判定按如下操作：

阳性结果判断：

F1通道dt≤35且熔解曲线在64±5℃区间有吸收峰，F2通道有或者无数值的样本为阳性；

F1通道35＜dt＜40，F2通道有或者无数值的样本建议重新检测，检测结果dt＜40且熔解曲线在64±5℃区间有吸收峰的样本为阳性。

阴性结果判断：

F2通道dt≤35，且F1通道dt无数值或为40，同时熔解曲线在64±5℃区间有或者无吸收峰，均为阴性；

F1通道：dt≤35但熔解曲线在64±5℃区间没有吸收峰，同时F2通道有或者无数值，则为阴性。

使用本发明MP试剂盒的检测结果如图8(F1荧光通道)、图9(F2荧光通道)和图10(溶解曲线)所示，

根据F1通道、F2通道的dt值和溶解曲线温度的情况，判定样本2、3为阳性，样本1、4为阴性(MP阴性)。其中样本4用MP试剂盒进行检测，其靶标、内标的扩增曲线与其他MP阳性样本无差别，但通过熔解曲线明显区分出MG、MP阳性样本，最终确定MP阳性样本。本结果与金标准病毒培养结果完全相同，表明本发明试剂盒用于检测临床样本拭子中的肺炎支原体准确性高，但上机扩增检测时间仅需90分钟(40分钟检测，50分钟熔解曲线)具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的支原体通用型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种非诊断且非治疗性的支原体的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包括步骤：在反应体系中进行扩增，所述的反应体系中含有扩增支原体的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

且所述反应体系还包括待测支原体的特异性检测探针，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13所示；所述反应体系还包括待测支原体的特异性捕获探针，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的支原体是生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕获探针可与肺炎支原体MP的靶标核酸MP RNA序列特异结合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕获探针可与生殖支原体MG的靶标核酸MG RNA序列特异结合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在另一对照反应体系中进行扩增反应。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MP内标MP IC RNA、捕获探针和检测探针，所述引物对包括：T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的MP IC RNA，序列如SEQ ID NO:14所示；

所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的对照反应体系中含有所述特异性引物对、MG内标MG IC RNA、捕获探针和检测探针，所述引物对包括：T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的MG IC RNA，序列如SEQ ID NO:7所示；

所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

8.如权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：在扩增反应过程之中或之后，检测待测支原体的特异性检测探针发出的荧光信号。

9.一种支原体的非诊断性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

用如权利要求1中所述的扩增方法扩增待测样品；和

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括设置一个或多个对照组。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述对照组包括：阳性对照组、阴性对照组、内标对照组。

12.一种支原体的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于所述容器内的扩增生殖支原体MG和/或肺炎支原体MP的特异性引物对，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

以及使用说明书；

且所述检测试剂盒中还包括待测支原体的特异性检测探针，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13所示，其中SEQ ID NO:5为MG的检测探针，SEQ ID NO:13为MP的检测探针；所述反应体系还包括待测支原体的特异性捕获探针，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的一种或多种组分：

(b)待测序列的内标序列；和/或

(c)内标检测探针。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括一种或多种酶。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶是M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。

16.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测序列的内标序列是MG的内标序列。

17.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的待测序列的内标序列是MP的内标序列。

18.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一酶液中，捕获探针存在于一核酸提取液中，T7引物、nT7引物和MG检测探针存在于一检测液中。

19.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述MG内标序列为竞争性内标，并与MG靶标核苷酸使用同一对引物。

20.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述MP内标序列为竞争性内标，并与MP靶标核苷酸使用同一对引物。

21.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照和/或阴性对照。

22.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、MG反应液、MG检测液、SAT酶液、MG阳性对照、MG阴性对照和MG内标；

其中，

所述裂解液包括硫酸铵和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

所述MG反应液包括dNTP和NTP；

所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述的MG阴性对照是不含有生殖支原体靶标核酸序列或不含有生殖支原体的溶液；

MG内标：含MG内标RNA，序列如SEQ ID NO:7所示稀释物。

23.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含以下组分：裂解液、核酸提取液、洗涤液、MP反应液、MP检测液、SAT酶液、MP阳性对照、MP阴性对照和MP内标；

其中，

所述裂解液包括硫酸铵和HEPES；

所述核酸提取液包括捕获探针和磁珠；

所述洗涤液包括NaCl和SDS；

所述MP反应液包括dNTP和NTP；

所述SAT酶液包括M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

所述的MP阴性对照是不含有肺炎支原体靶标核酸序列或不含有肺炎支原体的溶液；

MP内标：含MP内标RNA，序列如SEQ ID NO:14所示稀释物。

24.如权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

25.如权利要求23所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括A盒和B盒，其中，

26.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：

所述的内标检测探针包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；

或所述的试剂盒包括选自下组的一个或多个特征：

所述检测探针包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；和/或

所述的内标检测探针包括如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。

27.一种扩增支原体的特异性引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对包括：

T7引物：序列如SEQ ID NO:3所示；和

nT7引物：序列如SEQ ID NO:4所示；

且所述组合还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13所示的检测探针；和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的捕获探针。

28.如权利要求12所述的试剂盒或权利要求27所述的引物对和探针组合的用途，其特征在于，用于非诊断且非治疗性地检测在环境微生物样品或人类泌尿生殖道分泌物或人类呼吸道分泌物样品中是否存在生殖支原体和/或肺炎支原体。