CN113234856B - 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法 - Google Patents

一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113234856B
CN113234856B CN202110458729.3A CN202110458729A CN113234856B CN 113234856 B CN113234856 B CN 113234856B CN 202110458729 A CN202110458729 A CN 202110458729A CN 113234856 B CN113234856 B CN 113234856B
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection
crrna
rpa
nucleic acid
denv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110458729.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113234856A (zh
Inventor
黄黎珍
林采玲
武鹭婷
何昌生
莫国圣
许万青
左青霞
冯冬燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN202110458729.3A priority Critical patent/CN113234856B/zh
Publication of CN113234856A publication Critical patent/CN113234856A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113234856B publication Critical patent/CN113234856B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，属于生物技术领域。本发明设计的crRNA与DENV‑1靶序列的识别结合具有高度特异性，有效保证检测结果的准确性。本发明设计的crRNA不受PAM序列的限制，只能特异性识别剪切单链DNA，而不能剪切双链DNA，因此Cas12a蛋白不会消耗用于扩增的模板，扩增与Cas12a‑crRNA检测可在同一体系同时进行，实现了高灵敏度。本发明只需要常温下40min便可通过试纸条显色或荧光强度读取检测结果，检测时间短，不需要昂贵、复杂的控温仪器，只需要一个恒温装置和荧光检测设备便可完成检测反应，检测成本低。

Description

一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及CRISPR/Cas系统和RT-RPA恒温扩增系统，具体是一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的登革热病毒(DENV)一步法核酸检测方法。
背景技术
DENV(denguevirus，DENV)，属于黄病毒科黄病毒属，基因组为一条11kb左右的单链正义RNA，根据抗原不同可分为四种血清型(DENV1～DENV4)，而在广东，DENV-1为主要流行毒株。因此，在DENV感染早期，进行病毒诊断，对于疫情的控制和患者的治疗都具有关键的意义。
目前，对登革热进行临床诊断的方法包括DENV分离培养、DENV抗体血清学诊断或DENV特异性核酸检测。DENV的分离培养即将疑似感染者的血清进行易感细胞接种培养，通过观察细胞的病变情况进行诊断；但该方法对无菌操作要求高，培养周期长，容易导致假阳性。通过ELISA检测抗登革热免疫球蛋白M(IgM)和IgG抗体是登革热诊断最广泛的方法，但是该方法需要昂贵的实验设备和训练有素的工作人员，诊断过程存在与相关黄病毒的交叉放应，且无法判断其血清型。RT-PCR能够快速检测DENV RNA，具有高度灵敏性和特异性，并且可以进行血清型分型；然而需要特殊的仪器，操作技术难度大，检测成本过高。
为了解决以上检测技术存在的问题，人们开发了恒温扩增技术。其中，RT-RPA(recombinase polymerase amplification)技术可以在37～42℃条件下，30min内实现检测模板的高效扩增，该方法的样品准备简单，反应过程仅需要一台控温设备便可完成，大大降低了操作技术难度和成本。但是单纯的RT-RPA存在非特异性扩增和检测效果读取不便的问题。
CRISPR/Cas系统由成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)和它的辅助蛋白(CRISPRassociated proteins，Cas)构成，是一种细菌适应性免疫系统。CRISPR/Cas12a为Ⅴ型CRISPR/Cas系统，是一种由crRNA引导的具有DNA酶活性的蛋白质，可以特异性地结合和切割dsDNA或ssDNA；此外，被特异性dsDNA、ssDNA激活后的Cas12a还具有非特异性ssDNA切割酶活性。CRISPR/Cas12a的精准靶向性，为其应用于核酸检测奠定了基础；Cas12a后续激活的ssDNA非特异性切割活性为其进行检测信号的放大和可视化读取提供了有利依据。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法。具体是将RT-RPA与CRISPR/Cas12a置于同一反应体系中进行待检测核酸的扩增与检测，最后通过侧流免疫层析试纸条或荧光检测设备读取检测信号。
本发明的另一目的是提供一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法检测试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法检测试剂盒，包括：LbaCas12a、DENV-1特异性crRNA序列、针对DENV-1靶序列的特异性RT-RPA引物；
为了更好的实现本发明，所述试剂盒还包括NEB Buffer 2.1、RNase Inhibitor、冻干RPA反应微球、Reverse Transcriptase XL、Rehydration Buffer、MgOAc、报告单链DNA分子；
所述的DENV-1特异性crRNA序列为DENV-1target crRNA(SEQ ID NO：1)；见表1；
所述的针对DENV-1靶序列的特异性RT-RPA引物为DENV-1target F/R引物组(SEQID NO：3、4)；见表2；
所述的DENV-1特异性crRNA序列中，DENV-1target crRNA用于检测1型DENV，即DENV-1；
所述的DENV-1target F/R引物组用于扩增含有与DENV-1target crRNA互补的核酸片段；
所述的报告单链DNA分子为SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6。
一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)根据DENV-1筛选其保守特异性核酸序列作为靶序列，选择的保守特异性核酸序列中非靶向链的5′侧翼区不含“TTTN”；
(2)根据步骤(1)所述的DENV-1的靶序列设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；
(3)针对步骤(1)所述的DENV-1的靶序列设计RT-RPA上、下游引物，靠近靶序列一端的引物与crRNA序列方向相反，设计的RT-RPA引物如序列表中SEQ ID NO：3、4所示；
(4)将步骤(2)中纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、LbaCas12a、报告单链DNA分子、RT-RPA上下游引物、冻干RPA反应微球、Reverse Transcriptase XL、MgOAc、Rehydration Buffer与待测核酸样品以适当比例混合于适当体系中进行反应；
(5)反应产物通过侧流免疫层析试纸或荧光检测获得检测结果。
优选的，步骤(1)中所述的DENV-1对应的NCBI登录号为：NC_001477.1。
优选的，步骤(4)中所述的待测核酸样品可以为从临床样本中抽提的核酸，或者以其他核酸检测手段中样本处理方法处理过的样品。
优选的，步骤(4)中所述的Lba Cas12a可以由重组表达和纯化获得或使用NEBLbaCas12a产品；
优选的，步骤(4)中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有FAM和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：5)，但不限于此。
用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：6)，但不限于此；
优选的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(4)中所述的反应体系为20μL体系中，200～800nM LbaCas12a、400～1600nM crRNA、500～1000nM报告单链DNA分子、1U/μLRNase Inhibitor(TaKaRa)、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μM RT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2U/μL Reverse TranscriptaseXL、10mM MgOAc、1×Rehydration Buffer；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2；
进一步的，用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤(4)中所述的反应体系为20μL体系中，200nM LbaCas12a、400nM crRNA、1000nM报告单链DNA分子、1U/μL RNase Inhibitor(TaKaRa)、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μMRT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2U/μL Reverse Transcriptase XL、10mMMgOAc、1×Rehydration Buffer；
优选的，用于荧光检测时，步骤(4)中所述的反应体系为20μL体系中，200～800nMLbaCas12a、400～1600nM crRNA、500～1000nM报告单链DNA分子、1U/μL RNase Inhibitor(TaKaRa)、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μMRT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2U/μL Reverse Transcriptase XL、10mMMgOAc、1×Rehydration Buffer；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2；
进一步的，用于荧光检测时，步骤(4)中所述的反应体系为20μL体系中，200nMLbaCas12a、400nM crRNA、500nM报告单链DNA分子、1U/μL RNase Inhibitor(TaKaRa)、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μM RT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2U/μL Reverse Transcriptase XL、10mM MgOAc、1×Rehydration Buffer；
优选的，步骤(4)中的反应体系可以进行冻干，冻干方法为将配制好的反应体系(不含待测核酸样品)置于-80℃冰箱冷冻2h后，-50℃真空干燥12h；冻干后的反应体系使用方法为用18～19.6μL无RNAase水溶解冻干反应体系，加入0.4～2μL待测核酸抽提产物进行反应；
优选的，步骤(4)中所述的反应的条件为37℃反应40～60min；进一步为37℃反应40min。
优选的，步骤(5)中侧流免疫层析试纸的设计：侧流免疫层析试纸采用商业化Milenia Hybridetect 1(TwistDx，Cambridge，UK)试纸，在侧流免疫层析试纸上依次有上样区，Gold-NP抗FITC抗体区，strepavidin条带(即control条带)，抗抗体条带(即检测条带)；
优选的，步骤(5)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将步骤(4)检测反应体系按体积比1：5稀释于HybriDetect assay buffer，将试纸上样区浸泡至上述稀释后的样本中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行。
优选的，步骤(5)中的荧光检测所用的检测装置可以为常用的酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置；
更优选的，步骤(5)中的荧光检测采用的检测条件是使用波长为492nm的激发光波长，检测波长为522nm处的放射荧光强度。
本发明的机理是：LbaCas12a蛋白来自Lachnospiraceae bacterium ND2006细菌CRISPR系统，具有DNase活性。LbaCas12a在crRNA引导下可以特异性识别靶序列，同时激活产生非特异性单链DNA酶切活性。双链靶序列中的非靶向链5′端TTTN对于LbaCas12a-crRNA识别结合双链靶序列是关键的，而LbaCas12a-crRNA对单链靶序列的识别不需要5′端TTTN的辅助。RT-RPA过程中的链置换反应可以不断暴露出单链靶序列，利于LbaCas12a-crRNA与靶序列的结合。基于GenBank上公布的DENV-1病毒株基因组中的对应的保守序列，利用CRISPR/Cas12a的ssDNA酶切活性和报告分子检测DENV-1靶序列。
本发明通过设计不受PAM(TTTN)序列限制的DENV-1特异性crRNA，结合LbaCas12a蛋白可以实现在缺乏实验条件的情况下，对DENV-1特异性核酸进行快速的检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明设计的crRNA与DENV-1靶序列的识别结合具有高度特异性，与传统检测方法相比，本检测方法有效保证检测结果的准确性。所设计的crRNA不受PAM序列的限制，只能特异性识别剪切单链DNA，而不能剪切双链DNA，因此本发明中Cas12a蛋白不会消耗用于扩增的模板，扩增与Cas12a-crRNA检测可以在同一体系同时进行，实现了高灵敏度。本发明只需要常温下40min便可通过试纸条显色或荧光强度读取检测结果，检测时间短，不需要昂贵、复杂的控温仪器，只需要一个恒温装置和荧光检测设备便可完成检测反应，检测成本低。本发明可以形成RT-RPA·Cas12a-crRNA冻干粉检测试剂盒，检测过程中只需进行一次加样，无需进行反应溶液的转移，降低了污染风险，配合试纸条显色情况便可诊断感染情况，操作简便，能够实现现场快速特异性检测。
附图说明
图1是实施例1中一步法对DENV-1的有效性检测。
图2是实施例1中荧光法检测DENV-1的结果。
图3是实施例2中侧流试纸法检测DENV-1的结果。
图4是实施例3中一步法和两步法对DENV-1的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
下列实施例中涉及的待测核酸样品为合成的包含设计的靶序列的双链DNA分子，具体如NCBI登录号NC_001477.1中的第5227～5730位碱基所示。
实施例1：
本发明实施例中，一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)对公布在GenBank上的DENV-1的病毒株对应基因组(NCBI登录号为：NC_001477.1)的保守区域设计不受PAM序列限制的crRNA，并进行脱靶分析，筛选一条特异性好，低脱靶的crRNA，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化。设计的crRNA序列(SEQ ID NO：1)如表1所示。
表1特异性crRNA序列
名称 特异性crRNA序列(5'-3') 基因组位置
DENV-1 target crRNA GCAGUUAUCCAAGAUGAG(SEQ ID NO：1) NS3
DENV-1 target crRNA’ CACAGAGCAAUGCAGUUA(SEQ ID NO：2) NS3
(2)针对靶点设计特异性RT-RPA引物(SEQ ID NO：3、4)，靠近靶序列一端的引物与crRNA序列方向相反，引物序列见表2。
表2特异性RT-RPA引物序列
名称 特异性RT-RPA引物序列(5'-3')
DENV-1 target-F CAACCCGAGTGGGTATGGGTGAAGCAGCTG(SEQ ID NO：3)
DENV-1 target-R GTTCCATGATCTTTCAGGAATGTCTCTTTC(SEQ ID NO：4)
(3)crRNA体外转录的方法为：配制体外转录反应体系中，体系中含有0.75μLreacting buffer、7.5mM ATP、7.5mM GTP、7.5mM UTP、7.5mM CTP、1μg DNA模板、1.5μL T7RNA polymerase mix；以上体系在37℃条件中反应16h。
(4)crRNA纯化方法：20μL体外转录产物与160μL nuclease-free water及20μL 3M醋酸铵混合，使用1：1苯酚氯仿混合液萃取，去除有机相，用氯仿重复萃取两次，收集水相至新的无酶1.5mL离心管，加入两倍体积(400μL)无水乙醇混合均匀，-20℃保温30分钟以沉淀RNA，10000g离心10min收集RNA沉淀，弃去上清，用冷的75％乙醇漂洗沉淀两次，离心收集沉淀，弃去上清，用50μL 0.1mM EDTA溶液溶解RNA沉淀获得RNA溶液。
(5)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：6)。
(6)反应体系的配制：RT-RPA体系中，RT-RPA上游引物为0.2μM，RT-RPA下游引物为0.2μM，8.8μL 1×Rehydration Buffer，10mM MgOAc，1×冻干RPA反应微球、0.2U/μLReverse Transcriptase XL。CRISPR/Cas12a体系中，1×NEB Buffer 2.1，200nMLbaCas12a，400nM crRNA，500nM报告单链DNA分子，1U/μL RNase Inhibitor(TaKaRa)，补ddH2O至10μL；CRSPR/Cas12a体系在室温下静置10min。
(7)将上述的RT-RPA体系与CRISPR/Cas12a体系混合均匀，加入待测核酸样品0.4μL，并混合均匀；得到的总反应体系为20μL；反应体系在37℃中反应40min。
(8)将反应产物置于荧光检测装置中，使用波长492nm的激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度以获得检测结果。
(9)结果如图1、图2所示。图1，DENV：待测核酸样品，DENV指DENV-1；human genome：以293T细胞基因组为检测物；BC：以DEPC处理水为检测物；结果表明本发明可以实现对DENV-1的有效性检测。图2，检测靶点浓度分别为10-14M、10-15M、10-16M；BC为不含待测核酸样品的空白对照组；结果表明，本方法的检测限为10-16M。
实施例2：
本发明实施例中，一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)对公布在GenBank上的DENV-1病毒株的保守区域设计不受PAM序列限制的crRNA，并进行脱靶分析，筛选一条特异性好，低脱靶的crRNA，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化。设计的crRNA序列(SEQ ID NO：1)如表1所示。同时，针对二步法设计的crRNA’序列(SEQ ID NO：2)如表1所示。
(2)针对靶点设计特异性RT-RPA引物(SEQ ID NO：3、4)，靠近靶序列一端的引物与crRNA序列方向相反，引物序列见表2。
(3)crRNA体外转录的方法为：配制体外转录反应体系中，体系中含有0.75μLreacting buffer、7.5mM ATP、7.5mM GTP、7.5mM UTP、7.5mM CTP、1μg DNA模板、1.5μL T7RNA polymerase mix；以上体系在37℃条件中反应16h。
(4)crRNA纯化方法：20μL体外转录产物与160μL nuclease-freewater及20μL 3M醋酸铵混合，使用1：1苯酚氯仿混合液萃取，去除有机相，用氯仿重复萃取两次，收集水相至新的无酶1.5mL离心管，加入两倍体积(400μL)无水乙醇混合均匀，-20℃保温30分钟以沉淀RNA，10000g离心10分钟收集RNA沉淀，弃去上清，用冷的75％乙醇漂洗沉淀两次，离心收集沉淀，弃去上清，用50μL 0.1mM EDTA溶液溶解RNA沉淀获得RNA溶液。
(5)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和Biotin基团的12碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′(SEQ ID NO：5)。
(6)反应体系的配制：RT-RPA体系中，RT-RPA上游引物分别为0.2μM，RT-RPA下游引物分别为0.2μM，8.8μL 1×Rehydration Buffer，10mM MgOAc，1×冻干RPA反应微球、0.2U/μL Reverse Transcriptase XL。CRISPR/Cas12a体系中，1×NEB Buffer 2.1，200nMLbaCas12a，400nM crRNA，1000nM报告单链DNA分子，1U/μL RNase Inhibitor(TaKaRa)，补ddH2O至10μL；CRSPR/Cas12a体系在室温下静置10min。
(7)将上述的RT-RPA体系与CRISPR/Cas12a体系混合均匀，加入经过待测核酸样品0.4μL，并混合均匀；得到的总反应体系为20μL；反应体系在37℃中反应40min。
(8)反应产物通侧流免疫层析试纸测获得检测结果：将检测反应体系20μL与100μLHybriDetect1 assay buffer充分混匀，将HybriDetect1试纸上样区浸泡至上述混合液中室温孵育5min，肉眼读取试纸条带以获得检测结果。
(9)结果如图3所示。检测靶点浓度分别为10-10M、10-12M、10-14M、10-16M、10-18M；BC为不含待测核酸样品的空白对照组；结果表明，本方法的检测限为10-14M。
实施例3：
本发明实施例中，一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，通过设计位于RT-RPA扩增子内的不受PAM序列限制的crRNA，实现RT-RPA扩增与CRISPR/Cas靶向性识别同步进行，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
(1)对公布在GenBank上的DENV-1的病毒株保守区域设计不受PAM序列限制的crRNA，同时设计受PAM序列限制的crRNA，并进行脱靶分析，分别筛选一条特异性好，低脱靶的crRNA，再构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化。设计的crRNA序列(SEQ IDNO：1)如表1所示。
(2)针对靶点设计特异性RT-RPA引物(SEQ ID NO：3、4)，靠近靶序列一端的引物与crRNA序列方向相反，引物序列见表2。
(3)crRNA体外转录的方法为：配制体外转录反应体系中，体系中含有0.75μLreacting buffer、7.5mM ATP、7.5mM GTP、7.5mM UTP、7.5mM CTP、1μg DNA模板、1.5μL T7RNA polymerase mix；以上体系在37℃条件中反应16h。
(4)crRNA纯化方法：20μL体外转录产物与160μL nuclease-free water及20μL 3M醋酸铵混合，使用1：1苯酚氯仿混合液萃取，去除有机相，用氯仿重复萃取两次，收集水相至新的无酶1.5mL离心管，加入两倍体积(400μL)()无水乙醇混合均匀，-20℃保温30分钟以沉淀RNA，10000g离心10min收集RNA沉淀，弃去上清，用冷的75％乙醇漂洗沉淀两次，离心收集沉淀，弃去上清，用50μL 0.1mM EDTA溶液溶解RNA沉淀获得RNA溶液。
(5)报告单链DNA分子的设计：两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′(SEQ ID NO：6)。
(6)一步法反应体系的配制：RT-RPA体系中，RT-RPA上游引物为0.2μM，RT-RPA下游引物为0.2μM，8.8μL 1×Rehydration Buffer，10mM MgOAc，1×冻干RPA反应微球、0.2U/μLReverse Transcriptase XL。CRISPR/Cas12a体系中，1×NEB Buffer 2.1，200nMLbaCas12a，400nM crRNA，500nM报告单链DNA分子，1U/μL RNase Inhibitor(TaKaRa)，补ddH2O至10μL；CRSPR/Cas12a体系在室温下静置10min。
将上述的RT-RPA体系与CRISPR/Cas12a体系混合均匀，加入经过待测核酸样品0.4μL，并混合均匀，得到的总反应体系为20μL。
(7)两步法反应体系的配制：首先配制RT-RPA扩增体系，RT-RPA上游引物为0.2μM、RT-RPA下游引物为0.2μM、8.8μL 1×Rehydration Buffer、10mM MgOAc、1×冻干RPA反应微球、0.2U/μL Reverse Transcriptase XL、0.4μL的待测核酸样品，RT-RPA体系于37℃反应30min。配制CRISPR/Cas12a检测体系，1×NEB Buffer 2.1，50nM LbaCas12a，100nM crRNA’(即SEQ ID NO：2所示的DENV-1target crRNA’)，500nM报告单链DNA分子，1U/μL RNaseInhibitor(TaKaRa)，补ddH2O至17.5μL。取2.5μL RT-RPA扩增产物添加到CRISPR/Cas12a检测体系中。
(8)将上述反应体系置于荧光检测装置中，使用激发荧光波长为492nm，发射光波长为522nm，37℃孵育期间，每隔5min检测一次荧光强度。
(9)结果如图4所示。图4，G1：一步法，不含待测核酸样品的空白组；G2：一步法，检测靶点浓度为10-13M的实验组；G3：两步法，不含待测核酸样品的空白组；G4：两步法，检测靶点浓度为10-13M的实验组；结果表明，RT-RPA与CRISPR/Cas同一体系同时反应的一步法核酸检测方法在孵育55min时可以达到和传统两步法相同的荧光强度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DENV-1 target crRNA
<400> 1
gcaguuaucc aagaugag 18
<210> 2
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DENV-1 target crRNA’
<400> 2
cacagagcaa ugcaguua 18
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DENV-1 target-F
<400> 3
caacccgagt gggtatgggt gaagcagctg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DENV-1 target-R
<400> 4
gttccatgat ctttcaggaa tgtctctttc 30
<210> 5
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> Biotin修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 5
nnnnnnnnnn nn 12
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(1)
<223> FAM修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> BHQ1修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 6
nnnnnnnnnn nn 12

Claims (5)

1.一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，其特征在于：该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：
（1）根据DENV-1筛选其保守特异性核酸序列作为靶序列，选择的保守特异性核酸序列中非靶向链的5′侧翼区不含“TTTN”；
（2）根据步骤（1）所述的DENV-1的靶序列设计靶点特异性的crRNA，设计的crRNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，构建crRNA体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；
（3）针对步骤（1）所述的DENV-1的靶序列设计RT-RPA上、下游引物，靠近靶序列一端的引物与crRNA序列方向相反，设计的RT-RPA引物如序列表中SEQ ID NO：3、4所示；
（4）将步骤（2）中纯化后的crRNA体外转录产物或合成的crRNA分子、LbaCas12a、报告单链DNA分子、RT-RPA上下游引物、冻干RPA反应微球、Reverse Transcriptase XL、MgOAc、Rehydration Buffer与待测核酸样品以适当比例混合于适当体系中进行反应；所述的反应的条件为37℃反应40～60 min；
（5）反应产物通过侧流免疫层析试纸或荧光检测获得检测结果
步骤（4）中的报告单链DNA分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有FAM和Biotin基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-Biotin-3′，见SEQ IDNO：5；
用于荧光检测时，两端分别带有FAM和BHQ1基团的12碱基随机序列单链DNA分子5′-FAM-NNNNNNNNNNNN-BHQ1-3′，见SEQ ID NO：6；
用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤（4）中所述的反应体系为20μL体系中，200～800nM LbaCas12a、400～1600 nM crRNA、500～1000 nM报告单链DNA分子、1 U/μL RNaseInhibitor、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μMRT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2 U/μL Reverse Transcriptase XL、10 mMMgOAc、1×Rehydration Buffer；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2；
用于荧光检测时，步骤（4）中所述的反应体系为20μL体系中，200～800 nM LbaCas12a、400～1600 nM crRNA、500～1000 nM报告单链DNA分子、1 U/μL RNase Inhibitor、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μM RT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2 U/μL Reverse Transcriptase XL、10 mM MgOAc、1×RehydrationBuffer；其中，LbaCas12a与crRNA的摩尔比为1：2。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，其特征在于：
用于侧流免疫层析试纸检测时，步骤（4）中所述的反应体系为20μL体系中，200 nMLbaCas12a、400 nM crRNA、1000 nM报告单链DNA分子、1 U/μL RNase Inhibitor、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μM RT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2 U/μL Reverse Transcriptase XL、10 mM MgOAc、1×RehydrationBuffer；
用于荧光检测时，步骤（4）中所述的反应体系为20μL体系中，200 nM LbaCas12a、400nM crRNA、500 nM报告单链DNA分子、1 U/μL RNase Inhibitor、0.4～2μL待测核酸样品、1×NEB buffer 2.1、0.2μM RT-RPA上游引物、0.2μM RT-RPA下游引物、1×冻干RPA反应微球、0.2 U/μL Reverse Transcriptase XL、10 mM MgOAc、1×Rehydration Buffer。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，其特征在于：
步骤（4）中的反应体系进行冻干，冻干方法为将配制好的不含待测核酸样品的反应体系置于-80℃冰箱冷冻2h后，-50℃真空干燥12h；冻干后的反应体系使用方法为用18～19.6μL无RNAase水溶解冻干反应体系，加入0.4～2μL待测核酸抽提产物进行反应。
4.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，其特征在于：
步骤（5）中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将步骤（4）检测反应体系按体积比1：5稀释于HybriDetect assay buffer，将试纸上样区浸泡至上述稀释后的样本中，室温孵育5min后肉眼读取检测条带强度；或者其他侧流试纸按照对应的显色方法进行；
步骤（5）中的荧光检测所用的检测装置为酶标仪或任何能在FAM荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法，其特征在于：
步骤（5）中的荧光检测采用的检测条件是使用波长为492nm的激发光波长，检测波长为522nm处的放射荧光强度。
CN202110458729.3A 2021-04-27 2021-04-27 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法 Active CN113234856B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110458729.3A CN113234856B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110458729.3A CN113234856B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113234856A CN113234856A (zh) 2021-08-10
CN113234856B true CN113234856B (zh) 2024-02-20

Family

ID=77129399

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110458729.3A Active CN113234856B (zh) 2021-04-27 2021-04-27 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113234856B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113584134B (zh) * 2021-09-06 2024-01-30 青岛金斯达生物技术有限公司 一种基于CRISPR-Cas9的等温核酸检测系统及其方法和应用
CN114045354A (zh) * 2021-11-15 2022-02-15 上海博满生物科技有限公司 一种直扩ERA偶联CRISPR/cas12a的核酸一步实时检测方法
CN114410752A (zh) * 2022-01-24 2022-04-29 华南师范大学 一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法
CN115820819B (zh) * 2022-12-13 2023-09-19 博迪泰（厦门）生物科技有限公司 一种不受pam限制的一步法核酸检测方法及其应用
CN116083655B (zh) * 2023-02-23 2024-03-01 南方医科大学 一种用于I-IV型登革病毒检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用
CN117025807B (zh) * 2023-10-07 2024-02-02 广东省农业科学院动物卫生研究所 RPA-CRISPR/Cas12a引物组、gRNA和探针、试剂盒和检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110106290A (zh) * 2019-05-31 2019-08-09 华南理工大学 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒
CN110184329A (zh) * 2019-05-31 2019-08-30 华南理工大学 一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒
CN110184389A (zh) * 2019-06-04 2019-08-30 中国人民解放军疾病预防控制中心 crRNA靶向的PCR-CRISPR系统在检测HBV DNA中的应用
CN111254223A (zh) * 2020-03-21 2020-06-09 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系、试剂盒及其应用
CN111394430A (zh) * 2020-03-30 2020-07-10 重庆大学 一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用
CN111662968A (zh) * 2020-06-23 2020-09-15 南方科技大学 一种基于crispr的无pam序列dna的检测方法及其应用
CN111778357A (zh) * 2020-07-13 2020-10-16 国家卫生健康委科学技术研究所 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法
WO2020253537A1 (zh) * 2019-06-21 2020-12-24 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种检测非洲猪瘟病毒的方法和试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11021740B2 (en) * 2017-03-15 2021-06-01 The Broad Institute, Inc. Devices for CRISPR effector system based diagnostics
JP2021508460A (ja) * 2017-12-22 2021-03-11 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド Ｃｒｉｓｐｒエフェクター系に基づくマルチプレックス診断

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110106290A (zh) * 2019-05-31 2019-08-09 华南理工大学 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒
CN110184329A (zh) * 2019-05-31 2019-08-30 华南理工大学 一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒
CN110184389A (zh) * 2019-06-04 2019-08-30 中国人民解放军疾病预防控制中心 crRNA靶向的PCR-CRISPR系统在检测HBV DNA中的应用
WO2020253537A1 (zh) * 2019-06-21 2020-12-24 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种检测非洲猪瘟病毒的方法和试剂盒
CN111254223A (zh) * 2020-03-21 2020-06-09 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心 一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系、试剂盒及其应用
CN111394430A (zh) * 2020-03-30 2020-07-10 重庆大学 一种基于CRISPR-Cas12a耦合增强型链置换扩增的检测系统及其应用
CN111662968A (zh) * 2020-06-23 2020-09-15 南方科技大学 一种基于crispr的无pam序列dna的检测方法及其应用
CN111778357A (zh) * 2020-07-13 2020-10-16 国家卫生健康委科学技术研究所 基于CRISPR/Cas12a的呼吸道合胞病毒核酸快速检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease;Daphne Collias 等;Nat Commun .;第12卷(第1期);第1-11页 *
CRISPR-based platform for carbapenemases and emerging viruses detection using Cas12a (Cpf1) effector nuclease;Lucia Ana Curti等;《Emerging Microbes & Infections》;20200602;第9卷(第1期);第1140页摘要，1141-1142页材料与方法、图1,1143页右栏末段，1144-1146页，图6-图9 *
Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13;Cameron Myhrvold等;《SCIENCE》;20180427;第360卷;第444-448页 *
Lucia Ana Curti等.CRISPR-based platform for carbapenemases and emerging viruses detection using Cas12a (Cpf1) effector nuclease.《Emerging Microbes & Infections》.2020,第9卷(第1期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113234856A (zh) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113234856B (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a和恒温扩增的DENV一步法核酸检测方法
CN110106290B (zh) 一种基于CRISPR/Cas系统用于检测ASFV的现场快速检测方法及试剂盒
CN111187804A (zh) 一种基于CRISPR/Cas12a的肺炎支原体核酸快速检测试剂盒及其检测方法
CN109207567B (zh) 一种基于适配体和链置换扩增反应对金黄色葡萄球菌的测定方法
CN110791578B (zh) 用于百日咳博德特氏杆菌的crispr检测引物组及其用途
CN113403424B (zh) 基于CRISPR/Cas12a技术快速检测新冠病毒和突变株的方法及试剂盒
CN112538550B (zh) 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用
CN110804669A (zh) 用于肺炎支原体的crispr检测引物组及其用途
CN111521781B (zh) 一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法
CN113652505A (zh) 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒
CN112961943A (zh) 用于检测SARS-CoV-2的引物探针组合产品
CN111471797A (zh) 用于检测猫冠状病毒的rt-rpa引物对、探针、试剂盒及检测方法
Li et al. Development of a recombinase-aided amplification combined with lateral flow dipstick assay for the rapid detection of the African swine fever virus
CN106967839A (zh) B族链球菌荧光定量pcr检测的引物、探针、试剂盒和方法
CN113718045A (zh) 用于检测4种鲍特菌和特异性检测百日咳鲍特菌的dna片段、引物、探针和试剂盒及应用
CN104342487B (zh) 支原体核酸恒温扩增方法
CN110923363A (zh) 一种检测手足口病病原体核酸的试剂盒及其应用
CN110904194A (zh) 一种肺炎支原体和肺炎衣原体核酸联合检测试剂盒及其应用
CN116356079A (zh) 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用
CN116121413A (zh) B群链球菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN113667668B (zh) 基于CRISPR/Cas系统的HBV检测
CN115838834A (zh) 一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的人鼻病毒A型和C型检测体系
CN115992273A (zh) 用于检测肺炎链球菌的核酸分子、试剂盒及检测方法
CN115029345A (zh) 基于crispr的核酸检测试剂盒及其应用
CN114410799A (zh) 一种基于PCR-CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant