CN115820819B

CN115820819B - 一种不受pam限制的一步法核酸检测方法及其应用

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Publication number: CN115820819B
Application number: CN202211594790.1A
Authority: CN
Inventors: 林康凤; 郭祥举; 郭剑光; 李清涵; 任文静; 张睿; 李博安
Original assignee: Guangzhou Shengquan Biotechnology Co ltd; Boditai Xiamen Biotech Co ltd
Current assignee: Guangzhou Shengquan Biotechnology Co ltd; Boditai Xiamen Biotech Co ltd
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-09-19
Anticipated expiration: 2042-12-13
Also published as: CN115820819A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法及其应用。本发明提供的检测方法不需要根据靶标上5’‑TTTN‑3’序列来设计crRNA，不受PAM限制的crRNA能够进一步促进一步法反应。所述一步法是指在一个管子里两个反应体系同时进行，反应体系一用于核酸恒温扩增的RAA，反应体系二用于荧光信号检测的CRISPR/Cas12a体系。本发明提供的核酸检测方法，无需单独的预扩增和产物转移步骤，操作方便，降低了交叉污染的风险；无需额外提取核酸，反应时间短，从样本提取到结果判读时间在30min以内，敏感度达0.2拷贝/μL，准确性高，重复性好，裸眼可视化，可用于百日咳杆菌快速检测。

Description

一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法及其应用。

背景技术

百日咳杆菌（Bordetella pertussis）是一种常见的病原微生物，是人类百日咳的病原菌，百日咳的特征为阵发性痉挛咳嗽后伴有较长的鸡鸣样吸气性吼声，幼婴易发生窒息、肺炎或者脑病而导致死亡。

百日咳传染性很强，人群对百日咳普遍易感，病人是主要的传染源，主要通过飞沫经呼吸道传播，发病前1~2天至3周内传染性很强。目前，常用的百日咳诊断方法包括血常规、细菌培养分离、直接抗体检测和分子生物学PCR方法。通过培养分离百日咳杆菌是诊断百日咳的传统“金标准”，然而培养分离的方法在恢复期检测的阳性率很低，仅约为26%。并且培养分离周期长，时间为5-7天。

目前，开展的鼻咽拭子或者鼻咽吸出物的PCR检查百日咳DNA，认为是快速、敏感的诊断方法。但它不适用于简单，快速和即时的即时护理点（POC）分子诊断，因为它通常依赖于复杂和精确的仪器和经过专门培训的人员，并且涉及较长的反应时间（约2小时）。

RNA引导的2类簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白（CRISPR / Cas）系统因其单链DNA（ssDNA）的高侧支切割率而被广泛用于分子诊断，例如，基于Cas13核酸酶的具有高特异性及敏感度检测方法SHERLOCK，基于Cas12a与等温扩增的检测方法DETECTR，以及基于Cas12a与PCR预扩增结合的检测方法HOLMES。然而，这些基于CRISPR/Cas的检测策略，crRNA受原间隔相邻基序位点（PAM）序列限制，通常需要逐步进行，需要首先对核酸进行预扩增，然后将扩增的产物转移到CRISPR/Cas系统中进行核酸检测。这种多步反应方法不仅繁琐耗时，而且容易受到气溶胶污染的影响。

发明内容

本发明提供了一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法ORCD，使用不受PAM序列严格限制的crRNA，荧光探针的切割与核酸恒温扩增在单管里面同时进行，以实现百日咳杆菌的高灵敏度和特异性单管快速（30min）和视觉检测。

针对上述技术效果，本发明采用的技术方案为：

一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法，包括如下步骤：

S1、选择保守区域为靶序列，设计扩增靶序列的特异引物，同时设计不受PAM限制的crRNA；

S2、将待测样本与核酸免提取试剂混合震荡均匀，作为上样模板；

S3、将步骤S1制得的特异引物、不受PAM限制的crRNA，步骤S2制得的上样模板，CRISPR/cas12a蛋白酶，荧光淬灭探针，分子拥挤试剂混合，置于37℃扩增仪中扩增20~30min；

S4、反应结束后，置于LED蓝紫光仪或者紫外下读取荧光。

优选地，步骤S1所述PAM的序列为5’-TTTN-3’；所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUCUUUGGUCAAUCCCG-3’（SEQ ID NO.1）；

优选地，步骤S3所述CRISPR/cas12a蛋白酶与不受PAM限制的crRNA的质量比为1:1。

优选地，所述荧光淬灭探针的5’端带有带有荧光基团FAM，3’端带有淬灭基团BHQ1；所述荧光淬灭探针序列为5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’。

优选地，步骤S3所述分子拥挤试剂为浓度为7%的PEG20000。

优选地，步骤S3所述扩增仪为PCR仪器，具有读取荧光信号的恒温加热器，恒温核酸扩增仪，恒温加热器中的一种。

本发明还提供了一种所述的检测方法在制备百日咳杆菌检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种检测的试剂盒，所述试剂盒中含有特异引物、不受PAM限制的crRNA，CRISPR/cas12a蛋白酶，荧光淬灭探针，分子拥挤试剂，并且所述试剂盒采用所述的检测方法对待测样品进行检测。

本发明中的PAM序列用于crRNA和cas12a组成的复合物识别，从而快速激活cas12a对荧光探针的附属切割。本发明用于crRNA与cas12a组成的复合物识别的非PAM序列为5’-TCCG-3’（位于靶向crRNA模板序列的前面）。本发明使用该不受PAM限制的crRNA，能实现恒温扩增和荧光信号检测在单管里同时进行反应，缩短了检测时间，提高了检测的便利性。本发明所述不受PAM限制的crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例为1：1。具体地，所述crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的浓度分别为0.46μM，较低浓度的CRISPR/cas12a蛋白酶会极大的促进反应速率，缩短了反应时间。

本发明所述的荧光探针5’端带有带有荧光基团，可以但不仅限于FAM，3’端带有淬灭基团，可以但不仅限于BHQ1。进一步的，最优的可视化荧光探针为：5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’。现有的Cas12a通用荧光探针为5个碱基的5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’或者5’-FAM-TCCCT -BHQ1-3’。出人预料的，本发明使用的由碱基T、C、A随机组成的10个碱基荧光探针切割效果更好，具有远优于5个碱基探针的检测效果；现有的恒温扩增RAA体系常用的分子拥挤剂浓度为5%。本发明使用的7%分子拥挤剂在一步法中具有更好的检测效果和更高的稳定性。而且，本发明所述一步法是指在一个管子里两个反应体系同时进行，所述两个反应体系包括：反应体系一用于核酸恒温扩增的RAA体系，反应体系二用于荧光信号检测的CRISPR/Cas12a体系。本发明所述的一步法核酸检测方法对于核酸样品的纯度要求较低，有助于减少提取样品核酸的质量门槛，从而进一步缩短整个检测时间。

将本发明的不受PAM限制的一步法核酸检测方法ORCD应用于百日咳杆菌核酸检测试剂盒，使用核酸免提取试剂处理样本（处理过程5秒），便于对百日咳病原菌进行快速诊断。包括：RAA扩增体系：其包括上游引物、下游引物、分子拥挤试剂、反应干粉酶制剂和核酸扩增启动剂；CRISPR/Cas12a体系：其包括不受PAM限制的crRNA、CRISPR/cas12a蛋白酶、荧光淬灭探针；核酸免提取试剂。

本发明所述试剂盒的检测方法具体步骤如下：将20μL鼻咽拭子样本与20μL核酸免提取试剂振荡混匀5s，即可获得粗提核酸样本；在PCR反应管中同时加入含有针对百日咳杆菌靶标的设计的引物的RAA体系，含有针对百日咳杆菌靶标设计的不受PAM限制的crRNA的CRISPR/Cas12a体系；将5μL上述粗提核酸样本加入上述反应体系中，涡旋震荡，短暂离心（于掌心离心机中瞬时离心）；将上述混合好的一步法反应体系放入PCR仪器，反应温度为37°C，每1分钟测量一次荧光强度，持续30min。根据荧光信号进行结果判读。

所述的一步法核酸检测具体步骤方法，其与反应体系配套的设备不仅限于PCR仪器，还包括具有读取荧光信号的恒温加热器或恒温核酸扩增仪，或放入恒温加热器37°C 30min后在LED蓝光或紫外灯下进行终点荧光判读。

本发明提供了一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法ORCD，使用不受PAM序列严格限制的crRNA，荧光探针的切割与核酸恒温扩增在单管里面同时进行，无需额外的产物转移步骤，提高了诊断的便利性；同时实现了百日咳杆菌的高灵敏度和特异性单管快速（30min）和视觉检测。

与现有技术相比，本发明所带来的有益效果是：

（1）本发明提供的不受PAM限制的一步法核酸检测方法ORCD，使crRNA的设计不受PAM的限制，进一步提高一步法检测的敏感度，达到0.2 copies/μL，不需要额外的无需单独的预扩增和产物转移步骤，操作方便，降低了交叉污染的风险；

（2）本发明提供的不受PAM限制的一步法核酸检测方法ORCD，无需额外核酸提取步骤，反应时间短，从样本提取到结果判读时间在30 min以内；

（3）本发明提供的不受PAM限制的一步法核酸检测方法ORCD，不需要精密的仪器，重复性好，裸眼可视化，适合现场快速检测。

附图说明

图1为本发明一步法核酸检测方法的操作流程示意图；

图2为本发明的crRNA受PAM限制和不受PAM限制的一步法检测结果图；

图3为本发明一步法核酸检测方法的crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例优化的检测结果图；

图4为本发明一步法核酸检测方法的荧光探针优化的检测结果图；

图5为本发明一步法核酸检测方法的分子拥挤剂优化的检测结果图；

图6为本发明一步法核酸检测方法检测的最低检测限结果图；

图7为采用本发明一步法核酸检测方法检测21例百日咳临床样本结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1 一步法核酸检测流程

本发明提供的一步法核酸检测过程是将2个体系同时进行反应：RAA扩增体系和CRISPR/Cas12a体系，还包括核酸免提取试剂。如图1所示，在同一反应体系中包括上游引物、下游引物、分子拥挤试剂（可以但不仅限于20，000聚乙二醇）、反应干粉酶制剂（购自杭州众测生物科技有限公司，RAA冻干试剂酶）和核酸扩增启动剂（可以但不仅限于：280mM醋酸镁）、不受PAM限制的crRNA、CRISPR/cas12a蛋白酶、荧光淬灭探针和免提取的核酸样本。具体过程如下：

S1、选择保守区域为靶序列，设计扩增靶序列的特异引物，同时设计不受PAM限制的crRNA；所述的PAM为5’-TTTN-3’序列

采用百日咳杆菌的IS1663基因（基因ID号为CP046995.1）（该基因序列本身可以作为保守序列）为靶序列，同时设计不受PAM限制的crRNA序列为：本发明选择的非PAM序列为5’-TCCG-3’。

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGGUCUCUUUGGUCAAUCCCG-3’（SEQ ID NO.1）；

扩增靶序列的特异性引物为：

上游引物（FP）：5’-CCTACGGGTCTGTATCACGAGCAAGCGGC-3’（SEQ ID NO.2）；

下游引物（RP）：5’-CGTAGCTGTCGAGCGCATCATTTTTGGAG-3’（SEQ ID NO.3）；

非特异性荧光探针P：5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’。

以鼻咽拭子为待测样本，将其与等体积的核酸免提取试剂震荡混匀5s即可作为上样模板。

核酸免提取试剂按照下列配方物质进行添加：2M的NaOH 5mL；1M、pH8.0的Tris-乙酸5mL；质量浓度为20%的葡聚糖2.5mL；质量浓度为12.5% 的甘露醇5mL；质量浓度为20%的蔗糖2.5mL；加水补齐至50mL，混匀常温保存备用。

先将鼻咽拭子置于1mL、0.9%生理盐水进行洗脱，再取洗脱液与等体积核酸免提取试剂混合。

向PCR反应管中一次加入含有针对百日咳杆菌靶标的设计的引物的RAA体系（包括FP、FR、浓度为7%的分子拥挤试剂、反应干粉酶制剂和核酸扩增启动剂），含有针对百日咳杆菌靶标设计的不受PAM限制的crRNA的CRISPR/Cas12a体系（包括不受PAM限制的crRNA、CRISPR/cas12a蛋白酶、荧光淬灭探针），共20μL；然后将步骤S2中的5μL上述粗提核酸样本加入上述反应体系中，总反应体积为25μL，涡旋震荡，短暂离心（于掌上离心机内瞬时离心）；

单个反应管中各物质的量如下：10μM的FP0.8μL；10μM的RP0.8μL；浓度为7%的分子拥挤试剂20，000的聚乙二醇7μL；核酸扩增启动剂280mM醋酸镁1.25μL；11.5μM的crRNA 1μL；11.5μM的cas12a 1μL；50μM的荧光淬灭探针1μL。

具体配制过程：先将两倍体积的下列物质混合，具体为：1.6μL FP、1.6μL RP、2μLcrRNA、2μL Cas12a酶、2μL荧光探针P、14μL分子拥挤试剂和14.3μL水混合，共37.5μL，震荡混匀，再将其（37.5μL）加入到反应干粉酶制剂（将整管酶制剂加入，后来均分，即半管粉末一个反应）进行复溶，震荡混匀，平均分到两管中，每管18.75μL，再将1.25μL核酸扩增启动剂加到向各管中的侧壁，加入模板后离心下来启动反应。

将上述混合好的一步法反应体系放入PCR仪器，反应温度为37℃，每1min测量一次荧光强度，持续30min。

S4、反应结束后，置于LED蓝紫光仪或者紫外下读取荧光。

可以在反应的PCR仪器上进行实时荧光读取，或用裸眼在LED蓝光或紫外灯下进行终点荧光判读，根据荧光信号进行结果判读。

实施例2 crRNA受PAM限制和不受PAM限制的一步法检测

本实施例中，采用同一条crRNA分别识别浓度为104copies/μL受PAM限制的靶标和不受PAM限制的双链DNA靶标，按照上述实施例1中的一步法核酸扩增及检测进行反应，检测其效果。其靶标部分序列为：

受PAM限制的靶标：

5’-TTTGGGTCTCTTTGGTCAATCCCG-3’（SEQ ID NO.4），

其中，5’-TTTG为PAM序列，5’-GGTCTCTTTGGTCAATCCCG-3’为crRNA靶向序列；

不受PAM限制的靶标：

5’-TCCGGGTCTCTTTGGTCAATCCCG-3’（SEQ ID NO.5）；

其中5’-TCCG为不受PAM限制的序列，5’-GGTCTCTTTGGTCAATCCCG-3’为crRNA靶向序列。其他条件与实施例1相同。

结果如图2所示，图2a为30min内实时监测的荧光信号，图2b为反应30min后通过LED蓝光照射或紫外线照射进行终点荧光拍摄的结果。图2中，R1~R12代表整个反应体系分别缺少一些组分（-表示无，+表示有），R1~R4指在PAM模板下，R1无扩增RAA体系，R2无crRNA，R3无cas12a，R4正常反应。R5~R8指在不受PAM限制模板下，R5无扩增RAA体系，R6无crRNA，R7无cas12a，R8正常反应。R9~R11分别为扩增RAA体系，无crRNA，无cas12a的阴性对照，R12为无模板阴性对照。结果显示，不受PAM限制的crRNA反应体系（图中R8）显示出强烈的荧光信号，而受PAM限制的crRNA反应体系（图中R4）在孵育30min后没有观察明显的荧光信号，说明本发明中提供的不受PAM限制的crRNA能实现恒温扩增和荧光信号检测在单管里同时进行反应。

实施例3 一步法核酸检测体系优化

不受PAM限制的一步法核酸检测方法的反应速率与多个反应条件有关，包括crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例、荧光探针、分子拥挤剂浓度等因素，因此可以通过多方面条件的调整以获得更高的反应速率。本实施例对实施例1中建立的一步法核酸检测进行反应条件优化，分别对crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例、荧光探针长度和分子拥挤剂的浓度进行优化。

1.crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例优化

以0.46μM的crRNA浓度为基础，分别配制比例为2:1、1:1、1:2和1:3的crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例（浓度比），用于一步法核酸检测体系检测相同浓度的百日咳IS1663质粒（即将含有百日咳杆菌IS1663序列的pUC57-IS1663质粒用作靶序列），结果如图3所示，当crRNA与CRISPR/cas12a蛋白酶的比例为1:1时，检测效果最优，达到荧光峰值的时间最短。

2.荧光探针长度的优化

分别设计碱基数目为5、7、10、12的荧光探针，序列分别为：

5bp探针：5’- FAM-TCCCT- BHQ1-3’；

7bp探针：5’-FAM-TCCCTTC-BHQ1-3’；

10bp探针：5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’；

12bp探针：5’-FAM-TCCCTTCTACTC-BHQ1-3’；

采用与上述相同的一步法检测体系进行测试，检测结果如图4所示，10个碱基数目的荧光探针信号更优，序列为5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’。

3.分子拥挤剂的浓度优化

本实施例中使用的分子拥挤剂为PEG20000，分别配制浓度为4%、5%、6%、7%、8%、9%，采用与上述相同的一步法检测体系进行测试，检测结果如图5所示，浓度为7%的分子拥挤剂检测效果最优。

实施例4 不受PAM限制的一步法核酸检测方法的最低检测限

本实施例在上述最优的条件下，对实施例1的一步法核酸检测体系进行测定。采用百日咳杆菌IS-1663质粒（pUC57-IS1663）作为模板，用TE缓冲液进行浓度梯度稀释后进行测定，每个梯度进行5次重复测定。目标序列模板的浓度分别为2×10⁵copies/μL、2×10⁴copies/μL、2×10³copies/μL、2×10²copies/μL、2×10¹copies/μL、2×10⁰copies/μL、2×10^-1copies/μL和阴性对照NTC，结果如图6所示，图6a为反应30min内实时监测的荧光信号，图6b为反应30min后进行终点荧光检测，图6c为反应30min后通过LED蓝光照射或紫外线照射进行终点荧光拍摄。结果显示，本发明提供的不受PAM限制的一步法核酸检测体系的最低检测限为0.2copies/μL，同时，与PAM限制的一步法相比（图6d-f，最低检测限为2×104copies/μL），本发明提供的不受PAM限制的一步法核酸检测体系在低浓度样本检测具有很大的优势。

实施例5一步法核酸检测方法对百日咳临床样本的检测

本实施例对实施例1中建立的一步法核酸检测方法进行临床样本的验证，使用的样本来源于首都医科大学附属北京儿童医院。按照实施例1步骤S2采用核酸免提取试剂提取鼻咽拭子样本，得到实际样本DNA。一步法核酸扩增及检测按照实施例1步骤S3进行，为了确保检测结果的可靠性，每个样品都用两个独立的检测重复测试。同时用百日咳杆菌核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）进行检测；所述试剂盒可购自深圳市亿立方生物技术有限公司，生产许可证编号为粤食药监械生产许20142667号，国械注准号为20203400152，说明书最新核准日期为2020年2月14日，实时PCR试验过程按照最新核准的说明书进行操作。

检测结果如图7所示，图7a为30min内实时监测的荧光信号，图7b为反应30 min后通过LED蓝光照射或紫外线照射进行终点荧光拍摄。结果显示，本方法两次独立实验均检测10例百日咳阳性样本，同临床PCR方法相比，敏感度和特异性均达到100%（表1）。

表1本发明检测方法与实时PCR检测结果对比

最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种不受PAM限制的一步法核酸检测方法，其特征在于，该方

法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

S3、将步骤S1制得的特异引物、不受PAM限制的crRNA，步骤S2制得的上样模板，CRISPR/cas12a蛋白酶，荧光淬灭探针，分子拥挤试剂混合，置于扩增仪中扩增20~30min；

S4、反应结束后，置于LED蓝紫光仪或者紫外下读取荧光；步骤S1所述PAM位于crRNA靶向序列的前面，序列为5’-TCCG-3’；所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；步骤S3所述CRISPR/cas12a蛋白酶与不受PAM限制的crRNA的质量比为1:1；所述荧光淬灭探针序列为5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’；步骤S3所述分子拥挤试剂为浓度为7%的PEG20000。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤S3所述扩增仪为PCR仪器，具有读取荧光信号的恒温加热器，恒温核酸扩增仪，恒温加热器中的一种。

3.根据权利要求1-2任一项所述的检测方法在制备百日咳杆菌检测试剂盒中的应用。

4. 一种检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有特异引物、不受PAM限制的crRNA，CRISPR/cas12a蛋白酶，荧光淬灭探针，分子拥挤试剂；所述PAM位于crRNA靶向序列的前面，序列为5’-TCCG-3’；所述crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示；所述CRISPR/cas12a蛋白酶与不受PAM限制的crRNA的质量比为1:1；所述荧光淬灭探针序列为5’-FAM-TCCCTTCTAC-BHQ1-3’；所述分子拥挤试剂为浓度为7%的PEG20000。