CN112899385A - 鉴别布鲁氏菌s2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用，涉及细菌检测技术领域。本发明提供了包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物的引物组和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针，能够快速准确鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株。本发明还提供了利用所述引物组和探针鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的方法，该方法灵敏度高，特异性好，适合临床应用。本发明为防治筛查布鲁氏菌病提供了有效的新工具，大大提升了布病防治工作的效率，适合大规模推广实施，具有巨大的应用潜力和潜在商业价值。

Description

鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用

技术领域

本发明涉及细菌检测技术领域，特别是涉及鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用。

背景技术

布鲁氏菌病(又称布鲁氏病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌是一种革兰氏染色呈阴性的兼性厌氧菌，根据致病性和宿主选择性的差异，可将其分为至少10个种，其中以羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)和猪种布鲁氏菌(Brucella suis)的感染性最强。

布鲁氏菌病对畜牧业危害极大，其流行致使疫区肉、奶等产品存在严重的安全隐患，极大地影响牛、羊、猪等动物产品的对外贸易，并严重威胁人类的健康。目前针对布鲁氏病的防疫措施主要以疫苗预防为主，常见的布鲁氏菌病活疫苗品种主要有牛种布鲁氏菌A19(S19)株、猪种布鲁氏菌S2株、羊种布鲁氏菌M5株和M5-90株等。

《国家布鲁氏菌病防治计划(2016—2020年)》对布鲁氏菌病防治实行区域化管理，其中一类地区(15个省份和新疆生产建设兵团)采取以免疫接种为主的防控策略。而针对一类地区疫苗免疫对野毒感染检测的干扰，建立一种鉴别疫苗株与野毒株的检测方法具有非常重要的意义。目前已报道的鉴别检测疫苗株S2与野毒株的方法有基于疫苗株S2缺失的25bp碱基而建立的双重荧光PCR方法(Nan W,Tan P,Wang Y,Xu Z,Mao K,Peng D,ChenY.Duplex PCR for differentiation of the vaccine strain Brucella suis S2andB.suis biovar 1from other strains of Brucella spp.Vet J.2014Sep；201(3):427-8.doi:10.1016/j.tvjl.2014.05.033.Epub 2014May 27.PMID:25011712；谭鹏飞.基于PCR方法布鲁菌疫苗株与野生菌株鉴别诊断方法的建立[D].扬州大学,2012.)。但该方法需要双探针检测，检测分型成本较高，目前急需一种检测成本较低，更加简便的分型检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，实现布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的快速区分。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案之一，提供了一组鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组和探针，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在优选的实施方案中，所述探针核苷酸序列5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。

在优选的实施方案中，所述探针核苷酸序列5’端连接荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的一种；所述探针核苷酸序列3’端连接淬灭基团选自BHQ和TAMRA系列中的一种。

技术方案之二，提供了一种鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的试剂盒，所述试剂盒中包括所述的引物组和探针。

在优选的实施方案中，所述的试剂盒中还包括布鲁氏菌S2疫苗株阳性对照品与布鲁氏菌野毒株阳性对照品。

技术方案之三，提供了所述的引物组和探针或所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株中的应用。

技术方案之四，提供了一种鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的方法，所述方法包括如下步骤：

1)利用所述的引物组和探针，PCR扩增待测样品及阳性对照品核酸模板；

2)分别进行熔解曲线分析，判断待测样品类型。

在优选的实施方案中，所述PCR的反应体系由以下组分构成：Luna UniversalProbe qPCR Master Mix 5.0μL，上游引物0.8μL，下游引物0.4μL，探针0.4μL，模板1.0μL以及ddH₂O 2.4μL。

在优选的实施方案中，所述PCR反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火30s；循环55次。

在优选的实施方案中，所述熔解曲线分析程序为：95℃变性10秒；37℃到97℃以0.13℃/s的速率，5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析

本发明公开了以下技术效果：

1)本发明针对布鲁氏菌S2疫苗株，设计筛选了一组能够快速鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组及探针，其操作简单，仅需一条探针即可实现布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的鉴别检测，突破了现有技术中需采用双探针检测的技术限制；检测速度快且高通量，仅需一次PCR且无需测序操作，2小时内即可得到检测结果，且无需进行布鲁氏杆菌的纯培养，极大缩短了布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株鉴别检测所需时间；

2)本发明的PCR引物对F/R，对布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株可特异性扩增，有助于提高PCR的效率，减少布鲁氏菌检测的时间；探针P可特异性与布鲁氏菌S2疫苗株核酸位点杂交，特异性较好；本发明所建立的检测方法具有较好的特异性，检测结果精确，可信度高；

3)本发明一种快速区分布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的荧光检测方法的最低检测限可达到10拷贝，灵敏度较高；

4)本发明为临床上防治筛查布鲁氏菌病提供了有效的新工具，大大提升了布病防治工作的效率，适合大规模推广实施，具有巨大的应用潜力和潜在的商业价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株探针区SNP位点，名称编号依次为NCBI登录号-种型-毒株名称；

图2为标准化样品荧光检测方法熔解曲线图，其中pS2、pW为阳性标准品，水为阴性对照；

图3为荧光检测方法特异性试验熔解曲线图，布鲁氏菌疫苗S2株、牛型布鲁氏菌544A株、猪型布鲁氏菌1330S株、羊型布鲁氏菌16M株、猪大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、绿脓杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌作为特异性对照，pS2、pW为阳性对照，水为阴性对照；

图4为荧光检测方法灵敏度试验熔解曲线图，分别以pS2、pW标准质粒做1.0×10⁸-1.0×10⁰copies/μL的10倍倍比稀释，保证1.0×10⁸-1.0×10⁰copy/反应(copies/reaction)和分析灵敏度；

图5为荧光检测方法临床样本检测熔解曲线图，临床样本为牛血清5份，牛乳4份，共9份，以pS2、pW为阳性对照，水为阴性对照；

图6为阳性样品测序探针区比对结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。

实施例中所使用的材料、试剂与仪器如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。

本发明所用到布鲁氏菌S2疫苗和野毒株代表株544A、1330S、16M的基因组核酸为中国兽医药品监察所惠赠。

实施例1

引物和探针的设计筛选

经过对针对布鲁氏菌S2疫苗株所设计的大量引物和探针进行筛选后发现，根据布鲁氏菌BSS2_I0227(CP006961.1)的SNP位点A290C设计的引物对F、R，及探针P荧光法能够最有效的区分布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株，引物对F、R和探针P的核苷酸序列如下所示。

引物F：5'-GCTCGACAAGGAAATCAAG-3'(SEQ ID NO：1)；

引物R：5'-TCAGGTCCGTGTAAAGATC-3'(SEQ ID NO：2)，

探针P：5'-CCAACCATTATTCTTTCGCGCCGCAATA-3'(SEQ ID NO：3)。

在探针P的5'端标记荧光基团Texas Red，在其3'端标记淬灭基团BHQ1。但本领域常规的其他荧光基团和淬灭基团均能够实现相同效果。

检测结果如图1所示，在探针P位置，布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株仅存在一个SNP位点。

实施例2荧光PCR检测方法及熔解曲线分析方法的建立

1)阳性对照品制备

根据图1探针序列比对分析结果，探针P对应布鲁氏菌S2疫苗株序列为一组，其它野毒株为另一组。分别以S2疫苗核酸和野毒株1330S为模板，引物对DF：5’-TTATCCTGTCACGCCTACATCCG-3’(SEQ ID NO：4)和DR：5’-TTCACCACCCTCGGCAACC-3’(SEQ IDNO：5)为引物，Premix Ex-Taq分别扩增大小为1590bp的核酸片段，克隆至PMD18T Vector中，依次命名为pS2和pW，分别作为S2疫苗株阳性对照品和布鲁氏菌野毒株阳性对照品。

2)PCR体系的建立

以步骤1)得到的两种阳性对照品为模板分别进行荧光PCR扩增和熔解曲线分析。

PCR反应体系为10μL反应体系，具体由以下成分组成：Luna Universal ProbeqPCR Master Mix 5.0μL，1μM引物F 0.8μL，10μM引物R 0.4μL，10μM探针P 0.4μL，模板1.0μL，ddH₂O 2.4μL。

PCR反应程序如下：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火30s；循环55次。

3)熔解曲线分析

步骤2)获得的PCR扩增产物用LightCycler 96分析仪分别进行分析。熔解曲线分析程序为：95℃变性10sec；37℃到97℃以0.13℃/s的速率，5次/℃连续采集Texas RedFAM荧光信号，进行熔解曲线分析。熔解曲线分析结果如图2所示，可以看出pS2和pW阳性对照品的熔解曲线相互分开，表明所设计引物F、R及探针P适合用于布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的熔解曲线分析。两种阳性对照品熔解温度(Tm)不同，pS2为71.88±0.29℃，pW为69.26±0.4℃。

实施例3特异性检测

分别选取布鲁氏菌疫苗S2株、牛型布鲁氏菌544A株、猪型布鲁氏菌1330S株、羊型布鲁氏菌16M株基因组核酸，及实验室保存并提取的猪大肠杆菌(E.coli)、巴氏杆菌(Pasteurella)、猪链球菌(S.suis)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、猪胸膜肺炎放线杆菌(App)等常见猪病原基因组核酸，以上述核酸及水(阴性对照)分别作为PCR模板，采用实施例2中建立的PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，并与阳性标准样品pS2和pW的分析结果进行比对，熔解曲线峰型化图如图3所示。

由图3可以看出，本发明检测方法只能特异性扩增出布鲁氏杆菌阳性标准样品并形成熔解峰，而其它猪病相关细菌均不能扩增出特异熔解峰。表明引物F、R及探针P特异性较好，可以用于布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的分型荧光检测。

实施例4灵敏度检测

将实施例2中制备的阳性对照品pS2和pW做10倍梯度稀释，形成1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰copies/μL共9个梯度，按实施例2中建立的荧光PCR扩增反应和熔解曲线分析方法进行分析，熔解曲线峰型化图如图4所示。

由图4从中可以看出该检测方法随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，质粒个数低至10copy/μL，Texas RedFAM通道还可以检测到相应荧光信号，证明本发明建立的检测方法具有较高的灵敏度。

实施例5临床样品检测

1)样本选择：临床随机收集的牛血清样本5份，奶样品4份，商品化试剂盒提取基因组DNA；

2)样品检测：按照实施例2中建立的荧光PCR扩增方法和熔解曲线分析方法，扩增样本并分析熔解曲线；

3)结果判定：以pS2标准样品熔解曲线作为对照时，待检样品和阳性对照pS2之间熔解峰ΔTm值的绝对值小于1.0℃时判定为布鲁氏菌S2疫苗株；待检样品和阳性对照pS2熔解温度的ΔTm值的绝对值为2.61±1℃，则判定为布鲁氏杆菌野毒株。熔解曲线分析结果如图5所示，可以看出，结果9份临床样本为布鲁氏杆菌阴性。

对比例1临床检测验证

将实施例4和5中检测样品采用普通PCR试验，其中引物为：

DF：5’-TTATCCTGTCACGCCTACATCCG-3’(SEQ ID NO：4)；

DR：5’-TTCACCACCCTCGGCAACC-3’(SEQ ID NO：5)。

PCR体系为20μL的反应体系，具体包括以下成分：ddH₂O 6.4μL，Premix Ex-Taq10.0μL，10μM引物ASwaiF 0.8μL，10μM引物ASwaiR0.8μL，模板2.0μL。

PCR程序包括：95℃预变性3min；95℃变性40s，53℃退火1.5min，72℃延伸7min；循环35次。

目标PCR产物大小为1590bp，进行电泳凝胶回收，并送测序公司测序。

阳性样本为布鲁氏菌疫苗S2株、牛型布鲁氏菌544A株、猪型布鲁氏菌1330S株、羊型布鲁氏菌16M株基因组核酸，临床采集的5份血清和4份奶样均为布鲁氏杆菌阴性。测序结果如图6所示，显示布鲁氏菌疫苗S2株探针区与探针一致，其它阳性样本探针区存在SNP位点A10C，结果与本研究建立检测方法分型结果一致。但两者相比，测序方法耗时更长，检测程序更复杂，无法做到高通量。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心

<120> 鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组、探针及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcgacaag gaaatcaag 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaggtccgt gtaaagatc 19

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaaccatta ttctttcgcg ccgcaata 28

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttatcctgtc acgcctacat ccg 23

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcaccaccc tcggcaacc 19

Claims (10)

1.一组鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组和探针，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组和探针，其特征在于，所述探针核苷酸序列5’端连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的引物组和探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中的一种；所述淬灭基团选自BHQ和TAMRA系列中的一种。

4.一种鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-3任一项所述的引物组和探针。

5.根据权利要求4所述的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括布鲁氏菌S2疫苗株阳性对照品与布鲁氏菌野毒株阳性对照品。

6.一种权利要求1-3任一项所述的引物组和探针或权利要求4-5任一项所述的试剂盒在鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株中的应用。

7.一种鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)利用权利要求1-3任一项所述的引物组和探针，PCR扩增待测样品及阳性对照品核酸模板；

2)分别进行熔解曲线分析，判断待测样品类型。

8.根据权利要求7所述的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系由以下组分构成：Luna UniversalProbe qPCR Master Mix 5.0μL，上游引物0.8μL，下游引物0.4μL，探针0.4μL，模板1.0μL以及ddH₂O 2.4μL。

9.根据权利要求7所述的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火30s；循环55次。

10.根据权利要求7所述的鉴别布鲁氏菌S2疫苗株与野毒株的方法，其特征在于，所述熔解曲线分析程序为：95℃变性10秒；37℃到97℃以0.13℃/s的速率，5次/℃连续采集荧光信号，进行熔解曲线分析。

Images