CN111944923A

CN111944923A - 一种检测呼吸道病原体多重荧光pcr试剂盒、方法和应用

Info

Publication number: CN111944923A
Application number: CN202010682458.5A
Authority: CN
Inventors: 应斌武; 李为民; 宋兴勃; 柯博文; 陆小军; 陈豪; 吴涛
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-07-15
Also published as: CN111944923B

Abstract

本发明涉及一种检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒、方法和应用，所述试剂盒包括用于检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的试剂，所述试剂包括用于检测上述病毒的探针和特异性扩增相应病毒靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照；所述腺病毒的检测通道为FAM，所述巨细胞病毒的检测通道为VIC，所述博卡病毒的检测通道为Texas Red，所述肺炎支原体的检测通道为Cy5。本发明所述试剂盒可以同时检测上述四种病毒，且在具有高灵敏性和特异性的同时，还简化了操作过程、缩短了检测时间、提高了检测通量、降低了检测成本，并且能够在多种荧光定量PCR仪普遍适用。

Description

一种检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒、方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒、方法和应用。

背景技术

目前临床对呼吸道病原体的诊断主要依赖传统的分离培养法，培养法虽然是临床病原诊断的金标准，但是仍存在一定的局限性，包括：(1)大量病原体培养难度高或无法进行体外培养：如病毒、厌氧菌、苛养菌等；(2)阳性率低，假阴性率高(经常高达50％以上)；(3)检测耗时长：常规检测需要1-4天，某些慢生长型病原体需要3-4周才能获得培养结果；(4)操作繁琐：对操作者要求高，结果重复性不佳。

除了传统的分离培养法，目前市场上针对呼吸道病原体的检测方案多以核酸检测为目的，这些检测方案依赖不同的技术原理。例如：(1)梅里埃的FilmArray RP panel，通过巢式PCR扩增样本的核酸，产物进行溶解曲线分析，根据不同产物的溶解峰(Tm值)不同从而鉴定病原；(2)海尔施的呼吸道病原体多重检测试剂盒，先对样本核酸进行多重PCR扩增，然后扩增产物通过毛细管电泳分析，根据产物片段的大小鉴别不同的病原体；(3)博奥的呼吸道病毒核酸检测试剂盒，该试剂以环介导等温扩增+芯片检测技术为基础，可以快速检测6种呼吸道常见病毒。但是梅里埃的FilmArray RP panel虽然操作简单、快速且高度自动化，不过必须借助FilmArray自动化分析平台才能实施，使用范围受限。海尔施的呼吸道病原体多重检测试剂盒虽然可以实现一管反应多重检测，但除依赖PCR仪之外还需要专门的毛细管电泳仪才能对产物进行分析，不仅毛细管电泳分析过程会延长检测周期，并且扩增产物开盖还容易引起实验室气溶胶污染。博奥的呼吸道病毒核酸检测试剂盒测范围较窄，并且必须借助配套的恒温扩增微流控核酸分析仪才能实施，此外检测通量受仪器限制，最高可达十六通道。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明旨在开发一种能够鉴定数种呼吸道常见病原体的多重检测试剂盒，力求在保证高灵敏性和特异性的同时，尽量简化操作过程、缩短检测时间、提高检测通量、降低检测成本，并且能够在多种荧光定量PCR仪普遍适用。

本方案以Real-time PCR(Taqman探针)技术为原理，针对每一种检测靶标分别设计一对特异性引物和一条Taqman探针，Taqman探针为一段与靶序列互补并且高度特异的寡核苷酸序列，其5’端标记一个荧光报告基团，3’端标记一个荧光淬灭基团，在PCR扩增过程中，当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，不发出荧光信号；当引物延伸时，与模板结合的荧光探针被Taq酶(5’→3’外切酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号。在多重qPCR中，每一个靶标都被一套不同的引物扩增，且每一个靶标的特异性探针分别标记不同光谱范围的荧光基团，荧光定量PCR仪可根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线，最终通过检测到的荧光信号来判定不同的扩增产物。

本发明采用的技术方案为：

一种检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒，包括用于检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的试剂。

进一步地，所述试剂包括用于检测腺病毒的探针和特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、用于检测巨细胞病毒的探针和特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、用于检测博卡病毒的探针和特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对、用于检测肺炎支原体的探针和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对。

进一步地，所述检测腺病毒的探针的核苷酸FluA-P序列如SEQ ID NO:1所示，所述特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对FluA-F和FluA-R序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示；

所述检测巨细胞病毒的探针的核苷酸FluB-P序列如SEQ ID NO:4所示，所述特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对FluB-F和FluB-R序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

所述检测博卡病毒的探针的核苷酸HRV-P序列如SEQ ID NO:7所示，所述特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对HRV-F和HRV-R序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；

所述检测肺炎支原体的探针的核苷酸HMPV-P序列如SEQ ID NO:10所示，所述特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对HMPV-F和HMPV-R序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12基因序列如下所示：

进一步地，所述试剂盒还包括反应混合液、阳性对照和阴性对照。

进一步地，所述反应混合液包含MgCl₂、dNTPs Mixture、Taq DNA聚合酶，所述阳性对照为含目的基因的质粒混合物，所述阴性对照为无核酸酶水(Nuclease-free Water)。

进一步地，所述反应缓冲液中MgCl₂的工作浓度为2-4mM，dNTPs Mixture的工作浓度各为350-450μM，Taq DNA聚合酶的工作浓度为4-6U/μL。

进一步地，所述阳性对照含目的基因的质粒混合物的制备方法包括：

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成4个重组质粒，每个重组质粒分别包含1个扩增子序列，载体选择PUC57，质粒进行浓度定量后，根据下列换算公式转换成拷贝数浓度：

copies/μL＝(6.02x10^23)x(ng/μLx10^-9)/(DNA length x 660)

将各病原重组质粒进行等量混合，使用无菌、无核酸酶的双蒸水稀释，使得4种重组质粒的终浓度均为1000拷贝。

进一步地，所述腺病毒的检测通道为FAM，所述巨细胞病毒的检测通道为VIC，所述博卡病毒的检测通道为Texas Red，所述肺炎支原体的检测通道为Cy5。

本试剂盒不包含核酸提取试剂，采集的临床样本需要经过微生物(细菌、病毒)核酸提取纯化后才能用于检测。

一种同时检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的方法，包括以下步骤：

将采集到的临床样本进行微生物核酸提取并纯化，得到待测样品；采用所述检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒对待测样品进行检测，得到检测数据；以及对检测数据进行读取，得到检测结果。

进一步地，所述临床样本包括人体的鼻咽拭子、痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液中的任一种。

进一步地，所述试剂盒包括用于检测腺病毒的探针和特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、用于检测巨细胞病毒的探针和特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、用于检测博卡病毒的探针和特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对、用于检测肺炎支原体的探针和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照。

进一步地，采用所述试剂盒，利用real-time PCR方法对临床样本中腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体进行同时检测，得到检测数据的步骤包括：

将采集到的临床样本进行微生物核酸提取并纯化，得到待测样品；将待测样品、阳性对照或阴性对照分别与等量的用于检测腺病毒的探针和特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、用于检测巨细胞病毒的探针和特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、用于检测博卡病毒的探针和特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对、用于检测肺炎支原体的探针和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对混合，分别得到待测样品混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物；利用real-time PCR方法对所述待测样品混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物进行检测，得到检测数据；

优选的，所述待测样品的最低检测限为10拷贝/反应；

优选的，所述特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物的工作浓度均为0.1-1.0μM，更优选的为0.2μM；

优选的，用于检测腺病毒的探针、用于检测巨细胞病毒的探针、用于检测博卡病毒的探针和用于检测肺炎支原体的探针的工作浓度均为50-250nM，更优选的为100nM。

进一步地，所述real-time PCR的方法依次包括预变性、变性并延伸两个步骤，所述预变性步骤中的预变性温度为93-97℃，预变性时间为3-7min，循环数为1个；所述变性并延伸的循环数为42-48个，其中所述变性步骤中温度为92-98℃，所述变性时间为8-12s，所述延伸的温度为55-61℃，所述延伸的时间为30-40s。

所述的试剂盒在荧光PCR法检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体中的应用。

所述应用为非诊断目的的应用。

本发明所述技术方案的有益效果：

本发明所述试剂盒包括用于检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的试剂，所述试剂包括用于检测上述病毒的探针和特异性扩增相应病毒靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照；所述腺病毒的检测通道为FAM，所述巨细胞病毒的检测通道为VIC，所述博卡病毒的检测通道为Texas Red，所述肺炎支原体的检测通道为Cy5。本发明通过各个通道检测到的荧光信号来判断不同的扩增产物，且在具有高灵敏性和特异性的同时，还简化了操作过程、缩短了检测时间、提高了检测通量、降低了检测成本，具有检测范围广、快速简便、通量高且对多个品牌/型号的荧光定量PCR仪均适用的优点。

本发明的具体优点说明：(1)在检测范围上包括数种呼吸道感染常见的病原微生物，检测范围更加广泛；(2)采用多重real-time PCR技术，不同于产物终端分析，可以根据扩增曲线实时观测扩增过程，整个检测过程在1.5小时内即可完成，简单快速；(3)使用Taqman探针，可以确保检测的高特异性；(4)产物无需开盖进行额外的分析，可以尽量减少实验室污染；(5)探针标记采用了市面上绝大多数荧光定量PCR仪都配备的通道，适用于ABI7500、上海宏石SLAN-96P、Roche LightCycler480、Bio-Rad CFX96等所有具备FAM、VIC、Texas Red、Cy5、Cy3通道的荧光定量PCR仪；(6)每管试剂独立包装，可根据不同的临床需求自由组合，不仅灵活度高，并且可以最大程度地提高通量，降低成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1所述试剂盒检测结果扩增曲线图；

图2是本发明实施例1所述试剂盒灵敏度测试结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

以下实施例所述试剂盒中包含的引物和探针序列如下所示：

由生工生物工程(上海)股份有限公司根据下述序列合成各病原微生物的引物和探针序列，置于-20℃下保存备用。

以下实施例中涉及到的阳性对照即含目的基因的质粒混合物的制备方法包括：

copies/μL＝(6.02x10^23)x(ng/μLx10^-9)/(DNAlengthx660)

将各病原重组质粒进行等量混合，使用无菌、无核酸酶的双蒸水稀释，使得4种病原微生物的重组质粒的终浓度均为1000拷贝。

实施例1

本实施例提供一种用于检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的多重real-time PCR检测试剂盒，包含用于检测腺病毒的探针和特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、用于检测巨细胞病毒的探针和特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、用于检测博卡病毒的探针和特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对、用于检测肺炎支原体的探针和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对、MgCl₂、dNTPs Mixture、Taq DNA聚合酶、含目的基因的质粒混合物和无核酸酶水；

本实施例提供一种使用上述试剂盒检测支气管灌洗液的方法：

1、提取临床样本支气管灌洗液的核酸，纯化后得到待测样本；

2、配制反应体系

将试剂盒中所需组分解冻，颠倒混匀并短暂离心后备用；用无菌、无核酸酶的双蒸水将各病原体对应的引物和探针进行混合，根据所需检测的反应管数(样本数量+2)×1.1，按照下表配制检测反应液，

其中，各病原微生物的引物的终浓度均为0.2μM，探针的终浓度均为100nM，

其中，MgCl₂的工作浓度为3mM、dNTPs Mixture的工作浓度为400μM、Taq DNA聚合酶的工作浓度为5U/μL。

3、反应

将配制好的反应体系混匀后，按12μL的量分装到光学平盖PCR反应管中，转移至样本处理室，向各反应管中分别加入8μL待测样本，阳性对照管加入8μL含目的基因的质粒混合物，阴性对照管加入8μL无核酸酶水，终体积为20μL/管，盖紧反应管，瞬时低速离心，转移至检测区；使用ABI7500进行检测，所述腺病毒的检测通道为FAM，所述巨细胞病毒的检测通道为VIC，所述博卡病毒的检测通道为Texas Red，所述肺炎支原体的检测通道为Cy5；将各反应管按顺序放入real-time PCR仪，按照如下反应条件进行扩增反应：

将仪器的荧光内参设置为“None”，然后按照仪器操作规程编辑各反应孔的样本信息并选择相应的检测目标。

4、结果分析(参照仪器使用说明书进行)

应结束后自动保存结果，根据分析后图像调整Baseline的Start值、End值以及Threshold值(一般Start值可以在3～15、End值可设在5～20，在Log图谱窗口设置Threshold的Value值，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果，扩增曲线图如图1所示，在图中也可以看出反应体系中四种病原模板同时存在时，多重扩增无干扰，所有信号均可检出；

检验结果判断标准：阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30；阴性对照各个通道检测目标无CT值或CT值>40则视为合格；样本中各个检测目标CT值≤40为阳性，无CT值或CT值>40为阴性；

本实施例腺病毒的CT值≤40，阴性对照、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的检测结果均无CT值，阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30。

实施例2

本实施例与实施例1相同，不同之处在于临床样本、各个病原微生物扩增的引物和探针浓度、扩增反应的体系组份浓度和扩增反应的条件与实施例1不同：本实施例取用的临床样本为痰液，各个病原微生物扩增的引物浓度为0.1μM，探针浓度为50nM；扩增反应的体系中所述反应缓冲液中MgCl₂的工作浓度为2mM，dNTPs Mixture的工作浓度各为350μM，TaqDNA聚合酶的工作浓度为4U/μL，扩增条件如下表所示：

本实施例巨细胞病毒的CT值≤40，阴性对照、腺病毒、博卡病毒和肺炎支原体的检测结果均无CT值，阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30。

实施例3

本实施例与实施例1相同，不同之处在于临床样本、各个病原微生物扩增的引物和探针浓度、扩增反应体系中组份浓度和扩增反应的条件与实施例1不同：本实施例取用的临床样本为肺泡灌洗液，各个病原微生物扩增的引物浓度为1.0μM，探针浓度为250nM；所述反应缓冲液中MgCl₂的工作浓度为4mM，dNTPs Mixture的工作浓度各为450μM，Taq DNA聚合酶的工作浓度为6U/μL；扩增条件如下表所示：

本实施例博卡病毒的CT值≤40，阴性对照、腺病毒、博卡病毒和肺炎支原体的检测结果均无CT值，阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30。

实验例

实施例1所述试剂盒灵敏度测试

将阳性对照从高浓度往下分别10倍梯度稀释，制备一系列不同浓度的模板，浓度依次为：10^1拷贝/μL、10^2拷贝/μL、10^3拷贝/μL、10^4拷贝/μL、10^5拷贝/μL、10^6拷贝/μL，按照实施例1所述方法配制反应体系，反应模板为6个梯度浓度的阳性对照，按照相应的反应条件设置反应参数并进行结果分析，具体结果如图2所示，图中线条从左向右对应的模板拷贝数依次为10^6拷贝/μL、10^5拷贝/μL、10^4拷贝/μL、10^3拷贝/μL、10^2拷贝/μL、10^1拷贝/μL，由结果可以得到本方法的检测下限可达到10拷贝/反应。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒、方法和应用

<130> 2010

<141> 2020-07-15

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

caccatcacc accgtcagtg 20

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acccacgtct tcaacc 16

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ggtagcgtcc cgtgatc 17

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aaacgccaac tccgtgcca 19

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aggaaatgat tgcatgaa 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

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<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tcactgctac tgagattgca gctctt 26

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

acaacttcct caaacattt 19

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

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<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

attcaacgcg tttggttaat tgat 24

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ccgatgttta tcgcattatt a 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

cgacaaattt aaacagcaac ac 22

Claims

1.一种检测呼吸道病原体多重荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括用于检测腺病毒的探针和特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、用于检测巨细胞病毒的探针和特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、用于检测博卡病毒的探针和特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对、用于检测肺炎支原体的探针和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测腺病毒的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示；

所述检测巨细胞病毒的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

所述检测博卡病毒的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；

所述检测肺炎支原体的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应混合液、阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述反应混合液包含MgCl₂、dNTPsMixture、Taq DNA聚合酶，所述阳性对照为含目的基因的质粒混合物，所述阴性对照为无核酸酶水。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述腺病毒的检测通道为FAM，所述巨细胞病毒的检测通道为VIC，所述博卡病毒的检测通道为Texas Red，所述肺炎支原体的检测通道为Cy5。

7.一种同时检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述临床样本包括人体的鼻咽拭子、痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液中的任一种；所述试剂盒包括用于检测腺病毒的探针和特异性扩增腺病毒靶标基因的引物对、用于检测巨细胞病毒的探针和特异性扩增巨细胞病毒靶标基因的引物对、用于检测博卡病毒的探针和特异性扩增博卡病毒靶标基因的引物对、用于检测肺炎支原体的探针和特异性扩增肺炎支原体靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照；采用所述试剂盒，利用real-time PCR方法对临床样本中腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体进行同时检测，得到检测数据的步骤包括：

优选的，所述待测样品的最低检测限为10拷贝/反应；

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述real-time PCR的方法依次包括预变性、变性并延伸两个步骤，所述预变性步骤中的预变性温度为93-97℃，预变性时间为3-7min，循环数为1个；所述变性并延伸的循环数为42-48个，其中所述变性中温度为92-98℃，所述变性时间为8-12s，所述延伸的温度为55-61℃，所述延伸的时间为30-40s。

10.一种权利要求1-6任一项所述的试剂盒在荧光PCR法检测腺病毒、巨细胞病毒、博卡病毒和肺炎支原体中的应用。