CN116694816A

CN116694816A - SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法

Info

Publication number: CN116694816A
Application number: CN202210179759.5A
Authority: CN
Inventors: 冯雁; 叶星宇; 刘倩; 李忠磊; 胡语歆; 孙君卫
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2022-02-25
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-09-05

Abstract

本发明提供了一种SARS‑CoV‑2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法。本发明的检测方法包括：经特别设计优化的等温扩增引物，与酶切试剂进行偶联，从而建立一种检测试剂及检测方法。本发明具有多重、快速、便携的优势，弥补了等温检测特异性不高、多重检测困难的缺陷，可准确区分鉴别症状相似的SARS‑CoV‑2、甲型流感病毒和乙型流感病毒感染病例，为精准防控疫情提供有力支持。

Description

SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，具体地说，本发明涉及SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法。

背景技术

等温扩增技术弥补了PCR需要变温温控仪器设备的不足，等温温控设备可以更加小型化、便携化，因此更适合于即时诊断(POCT)。等温扩增技术在医学检验、畜牧水产、宠物医疗中均具有应用。

一般地，等温扩增技术主要依靠链置换DNA聚合酶，以LAMP等温扩增为例，其主要依靠Bst链置换DNA聚合酶，该酶除了具有互补ssDNA的聚合活性，同时也具有强烈的链置换能力，即在延伸的时候将dsDNA中的另一条链完整的置换下来，这也使得该技术不需要循环的变温过程，即在同一个温度下(60-65℃)即可短时间内(30-60分钟)完成10¹¹倍的靶标扩增。

等温扩增可使用非特异性荧光染料(如SYBR Green)对产物进行实时荧光检测。此外，等温扩增还可以和多种指示剂兼容，实现可视化检测，比如金属指示剂羟基萘酚蓝(HNB)可随着反应过程中镁离子浓度的变化发生变色反应。

不过，目前的等温扩增仍有大量的非特异性扩增，存在假阳性的可能，并且难以实现多重检测。

基于CRISPR基因编辑酶的检测技术作为目前最为热点的检测技术，其解决了现有技术中的多种问题，比如实现等温扩增的多重性、高特异性，同时也为免扩增检测技术等提供了可能。不过CRISPR也具有自身的一些不足，比如PAM/PFS序列限制、gRNA合成成本高、多重检测体系复杂(一种酶仅对应单重靶标)等。

本发明涉及的基因编辑酶Argonaute(Ago)蛋白可依赖5'-磷酸化修饰的gDNA或gRNA完成对ssDNA或RNA的靶向顺式剪切。经研究发现，一些源自极端环境中的耐高温古菌Ago，可在高温(95℃)下，完成对dsDNA解链的两条ssDNA的靶向剪切。这种以gDNA指导的特异性DNA靶向剪切能力在体外诊断当中，特别是多重靶向检测中，相比于Cas蛋白无选择的反式剪切具有更大的应用潜力。

SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒是目前全球流行的呼吸道传染病病原，这三种病毒感染引起的症状十分相似，但治疗方案与防控措施有所不同，因此可用于快速区分鉴别的多重核酸检测技术十分重要。

然而，目前尚缺乏令人满意的，高效灵敏地同时检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒三种病毒的多重检测试剂和检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供高效灵敏地同时检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒三种病毒的多重检测试剂和检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂包括向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：

(Z1)针对SARS-CoV-2的第一gDNA对：

其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；

P-TTGATGAGGTTCCACC SEQ ID No:19

P-TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:20

(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：

其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和

P-TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:21

P-TGTCACCTCTGACTAA SEQ ID No:22

(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：

其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示:

P-TATTTTATTGCCTCAA SEQ ID No:23

P-TAGGTGTGGTGCGCAA SEQ ID No:24。

在另一优选例中，所述多重检测试剂还包括荧光报告核酸集，所述荧光报告核酸集包括：

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸：

其中，第一荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:25所示；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸：

其中，荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:26所示；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸：

其中，第三荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:27所示。

在另一优选例中，第一荧光报告核酸、第二荧光报告核酸和第三荧光报告核酸的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。

在另一优选例中，所述的荧光基团选自下组：FAM、ROX、VIC、HEX、Cy5、Cy3、TAMRA、NED、JOE、TET。

在另一优选例中，所述的淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、TAMRA。

在另一优选例中，所述探针SARS-CoV-2 Reporter的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针Influenza A Reporter的5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭基团BHQ2；所述探针Influenza B Reporter的5'端标记有报告荧光染料VIC，3'端标记有淬灭基团BHQ1。

在另一优选例中，所述多重检测试剂还包括LAMP引物组的集，所述LAMP引物组的集包括：

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组：

其中，第一LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:1～6所示的6种引物；(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组：

其中，LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:7～12所示的6种引物；和

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组：

其中，第三LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:13～18所示的6种引物。

在另一优选例中，所述的第一LAMP引物组的扩增产物含有针对SARS-CoV-2的第一gDNA对的结合位点。

在另一优选例中，所述的第二LAMP引物组的扩增产物含有针对甲型流感病毒的第二gDNA对的结合位点。

在另一优选例中，所述的第三LAMP引物组的扩增产物含有针对乙型流感病毒的第三gDNA对的结合位点。

在另一优选例中，所述基因编辑酶(Ago)基于所述第一gDNA对，对SARS-CoV-2的扩增产物进行核酸切割后，形成用于靶向切割第一荧光报告核酸的第一次级gDNA。

在另一优选例中，所述基因编辑酶(Ago)基于所述第二gDNA对，对甲型流感病毒的扩增产物进行核酸切割后，形成用于靶向切割第二荧光报告核酸的第二次级gDNA。

在另一优选例中，所述基因编辑酶(Ago)基于所述第三gDNA对，对乙型流感病毒的扩增产物进行核酸切割后，形成用于靶向切割第三荧光报告核酸的第三次级gDNA。

在另一优选例中，所述的多重检测试剂还包括：基因编辑酶(Ago)。

在另一优选例中，所述Ago选自下组：PfAgo(Pyrococcus furiosus Ago)、MfAgo(Methanocaldococcus fervens Ago)、TcAgo(Thermogladius calderae Ago)、TfAgo(Thermus filiformis Ago)、AaAgo(Aquifex aeolicus Ago)、TpAgo(Thermusparvatiensis Ago)、FpAgo(Ferroglobus placidus Ago)或其组合，更佳地，选用PfAgo。

本发明的第二方面，提供了一种用于检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸的反应体系，其特征在于，所述的反应体系含有：

(Z)用于检测核酸的向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：

(Z1)针对SARS-CoV-2的第一gDNA对：

其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；

(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：

其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和

(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：

其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示；

(Y)用于产生检测信号的荧光报告核酸集，所述荧光报告核酸集包括：

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸；

其中，第一、第二、和第三荧光报告核酸产生不同的可检测信号；

(W)用于等温扩增SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸的LAMP引物组的集，所述LAMP引物组的集包括：

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组；

(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组；和

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组。

在另一优选例中，所述的反应体系还包括：基因编辑酶(Ago)。

在另一优选例中，所述的荧光报告核酸集包括：

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸：

其中，第一荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:25所示；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸：

其中，荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:26所示；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸：

其中，第三荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:27所示。

在另一优选例中，所述的LAMP引物组的集包括：

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组：

其中，第一LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:1～6所示的6种引物；

(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组：

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组：

在另一优选例中，对于针对同一病毒的LAMP引物组中的F3/B3、LF/LB、和/或FIP/BIP引物对，F3引物和B3引物的浓度相同或基本相同；LF引物和LB引物的浓度相同或基本相同；FIP引物和BIP引物的浓度相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的“浓度相同或基本相同”指一个引物的浓度A1与另一个引物的浓度A2之比为0.8-1.2，较佳地0.9-1.1。

在另一优选例中，对于针对同一病毒的LAMP引物组中的F3/B3、LF/LB、和/或FIP/BIP引物对，F3引物和B3引物的浓度C1、LF引物和LB引物的浓度C2；FIP引物和BIP引物的浓度C3满足：C1：C2：C3＝(0.8-1.2)：(1.5-3)：(5-12)，较佳地(0.9-1.1):(1.8-2.5):(6-10)，更佳地为约1：2：8。

在另一优选例中，对于针对两个或三个所述病毒的LAMP引物组中的F3/B3、LF/LB、和/或FIP/BIP引物对，其浓度之比满足：

针对SARS-CoV-2的引物浓度V1：针对甲型流感病毒的引物浓度V2＝1：0.4～0.6；

针对SARS-CoV-2的引物浓度V1：针对乙型流感病毒的引物浓度V3＝1：0.8～1.2；和

针对甲型流感病毒的引物浓度V2：针对乙型流感病毒的引物浓度V3＝0.4～0.6：1。

针对SARS-CoV-2的引物浓度V1：针对甲型流感病毒的引物浓度V2：针对乙型流感病毒的引物浓度V3＝1：0.4～0.6：0.8～1.5；

较佳地，V1：V2：V3＝1：(0.5±0.1)：(1.0±0.2)。

在另一优选例中，所述的反应体系中，针对SARS-CoV-2的引物浓度包括：

SARS-CoV-2的F3/B3引物对，各0.08μM；

LF/LB引物对，各0.16μM；

FIP/BIP引物对，各0.64μM。

在另一优选例中，所述引物组合中，SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒之间的引物浓度比为2：1：2，其中SARS-CoV-2引物体系摩尔浓度分别为FIP、BIP各0.64μM、F3和B3各0.08μM、LF和LB各0.16μM，甲型流感病毒引物体系摩尔浓度分别为FIP、BIP各0.32μM、F3和B3各0.04μM、LF和LB各0.08μM，甲型流感病毒引物摩尔浓度分别为FIP、BIP各0.64μM、F3和B3各0.08μM、LF和LB各0.16μM。

本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：

(Z)用于检测核酸的向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：

(Z1)针对SARS-CoV-2的第一gDNA对：

其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；

(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：

其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和

(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：

其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示；

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸；

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组；

(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组；和

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组；

基因编辑酶(Ago)。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种试剂：

一步法RT-LAMP反应液、阳性对照品和阴性对照品；其中，所述一步法RT-LAMP反应液包括10x缓冲液、Mg²⁺、DTT、dNTPs、Bst DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、反转录酶；所述阳性对照品为携带SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒靶标序列的质粒标准品，所述阴性对照品为无DNase/RNase水。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶切反应液；其中，所述酶切反应液包括10x酶切缓冲液、Mn²⁺。

在另一优选例中，所述一步法RT-LAMP反应液包括1x缓冲液、100μM Mg²⁺、1.4mMdNTPs、8U Bst DNA聚合酶、8U RNA酶抑制剂、20U反转录酶。

在另一优选例中，所述酶切反应液包括1x酶切缓冲液、0.4mM Mn²⁺、2.5μM gDNA、0.5μM探针、10μM Ago。

本发明的第四方面，提供了一种SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测方法，其特征在于，包括步骤：采用本发明第一方面和第二发明中任一项所述的SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸等温多重检测试剂，进行检测。

在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：

以提取的待测核酸样本为模板，同时使用阳性对照品、阴性对照品以及针对SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸分别设计的特异性引物进行RT-LAMP扩增，随后加入酶切反应液进行多重荧光检测；检测结束后，根据实际情况分别调节FAM、ROX和VIC通道的基线的Start值、End值以及阈值线的值，基于分析结果，得到FAM、ROX和VIC通道的Ct值；根据各通道的Ct值或终点荧光值进行有效性判读以及结果判读。

在另一优选例中，RT-LAMP扩增体积为25μl，RT-LAMP扩增结束后加入25μL酶切反应液，总酶切反应体积为50μl，具体包括：一步法RT-LAMP反应液12.5μl、引物混合液1μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl和无DNase/RNase水6.5μl；RT-LAMP反应条件为：65℃，30-40min。RT-LAMP扩增结束后加入25μL酶切反应液，酶切反应条件为：95℃，1min/循环，每循环收集荧光，20-30个循环。

在另一优选例中，所述荧光检测的Start值设置为1～2，所述End值设置为3～5，同时调整阴性对照品的扩增曲线平直或低于阈值线；进行有效性判读时，判为有效的标准为：阴性对照品无Ct值或终点荧光值不超过阈值，阳性对照品各通道Ct≤25或终点荧光值高于阈值3倍以上。阳性判读：FAM通道CT≤27或重点荧光值高于阈值2倍以上或重点荧光值高于阈值2倍以上为SARS-CoV-2阳性；ROX通道CT≤27或重点荧光值高于阈值2倍以上为甲型流感病毒阳性；VIC通道CT≤27或重点荧光值高于阈值2倍以上为乙型流感病毒阳性。

在另一优选例中，所述检测方法对于SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸敏感性达到1.5拷贝/反应。

在另一优选例中，所述方法是非诊断和非治疗的。

在另一优选例中，所述提取的待测核酸样本，其来源包括，人鼻咽拭子、唾液、痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、下呼吸道分泌物、粪便样本或环境样本；

其中，提取样品中的病毒RNA，可以采用任何一种已知的提取方法，作为优选，病毒RNA提取方法为：Qiagen试剂盒提取法，Trizol LS有机溶剂提取法，磁珠提取法，样本裂解法。

在另一优选例中，所述的方法是体外方法。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法含有以下优选的试剂组合：

针对SARS-CoV-2：

引物对:SEQ ID No:1-6；

荧光报告核酸：SEQ ID No:25；

ssDNA：SEQ ID No:19和20；

针对甲型流感病毒：

引物对:SEQ ID No:7-12；

荧光报告核酸：SEQ ID No:26；

ssDNA：SEQ ID No:21和22；

针对乙型流感病毒：

引物对:SEQ ID No:13-18；

荧光报告核酸：SEQ ID No:27；

ssDNA：SEQ ID No:23和24。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明检测原理示意图；

图2显示了不同比例引物组合检测多靶标混合样本的结果；

图3显示了SARS-CoV-2病毒的三重检测灵敏度；

图4显示了甲型流感病毒的三重检测灵敏度；

图5显示了乙型流感病毒的三重检测灵敏度；

图6显示了本发明和RT-PCR在SARS-CoV-2假病毒检测中的比较；

图7显示了RNA标准品便携式检测结果；

图8显示了本发明和RT-PCR在流感病毒临床标本检测中的比较；

图9显示了参照最优引物比例所做的混合样本的检测图，热图中的红色深度代表三个重复的平均荧光强度。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种针对多个靶标核酸分子的灵敏度高、操作简便、检测成本低、耗时短、准确性高的核酸检测方法。本发明对靶标核酸分子进行逆转录环介导等温扩增反应(逆转LAMP)，然后利用Ago酶的特性，即在首次由2个邻近且无间隔序列的初级向导ssDNA(guide ssDNA)介导剪切后，在合适的反应温度(如约90-98度)下，断裂的5'核酸片段可再次被Ago酶利用去剪切与之互补的荧光报告核酸链，从而根据荧光来判断样本中是否含有靶标核酸分子。结果表明，本发明方法可以对靶标核酸分子进行快速且高灵敏度、高准确度的检测，从而为病原体检测、基因分型、病程监测等提供帮助。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人基于高温Argonaute核酸酶的研究，提出一种新型等温多重核酸快速检测技术-MULAN(MULtiplex Argonaute-based Nucleic acid detection)。本发明人利用了新发现的Ago“次级剪切”机制，即Ago在初级导向DNA介导下剪切靶标核酸，其产物可作为新生“次级”导向DNA，与设计的特异性荧光报告分子作用，从而释放对应靶标的荧光信号，实现了单核酸酶对多个靶标序列的识别检测。在本发明中，将Ago“次级剪切”机制与等温扩增技术耦合，并通过优化特定的检测试剂，从而显著降低了多重检测试剂之间的交叉干扰，从而首次实现了高灵敏度的、针对新冠病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒的三重快速核酸检测方法，灵敏度可达到1.5拷贝/反应。在新冠假病毒、甲型流感、乙型流感临床样本测试中，MULAN也达到了100％的符合率，并且无信号交叉。

下表显示了本发明与现有技术的比较：

术语

术语“LAMP”是环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification),是一种适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。

术语“PCR”是聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction)，是一种适用于靶标核酸扩增的技术。

如本文所用，术语“二次切割”指在本发明检测方法中，在初级向导ssDNAs存在下，本发明Ago酶对目标核酸序列进行剪切，形成新的5'磷酸化的核酸序列(次级向导ssDNAs)；然后，次级向导ssDNA继续在PfAgo酶的作用下，引导PfAgo酶对与次级向导ssDNAs互补的荧光报告核酸进行剪切。这种先针对目标核酸序列进行特异性切割(第一次切割)，后对荧光报告核酸进行特异性切割(第二次切割)，被定义为“二次切割”。在本发明中，第一次切割和第二次切割都是特异性切割。

如本文所用，术语“集(set)”、“组(group)”、或“组合(combination)”可互换使用，指由二个或两个以上的元素构成的集合或组合。例如，由第一荧光报告核酸、第二荧光报告核酸和第三荧光报告核酸这三种荧光报告核酸构成的荧光报告核酸组合或荧光报告核酸集；由第一gDNA对、第二gDNA对和第三gDNA对这三组gDNA对构成的gDNA对的组合或gDNA对的集。

LAMP引物

在另一优选例中，所述SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒引物序列如下：

Ago酶

在本发明和检测方法中，一个核心成分是基因编辑酶，例如Ago酶。

在本发明中，优选的Ago酶是PfAgo酶，其来自于古菌Pyrococcus furiosus，基因长度2313bp，氨基酸序列由770个氨基酸组成。

PfAgo酶的酶切特性为：该酶可利用5'磷酸化的寡聚核苷酸作为向导ssDNA指导该酶对目标核酸序列的精确剪切；剪切位点位于与向导ssDNA的第10与11位核苷酸对应的目标核酸(ssDNA)之间的磷酸二酯键。

通常，PfAgo酶的优选工作温度为95±2度。

向导ssDNA

在本发明的检测方法中，一个核心成分是向导ssDNA，尤其是2个ssDNA，并且彼此之间邻近，且彼此之间无间隔碱基或间隔序列。

在本发明中，优选的向导ssDNAs均为长度为10-60nt，较佳地，10-40nt，更佳地，13-20nt的寡聚核苷酸，其5'第一个核苷酸均为胸腺嘧啶(T)，可被磷酸化修饰。

在另一优选例中，所述各靶标两条向导ssDNA距离15-30nt，其引导的酶切产物与本发明第一方面所述的探针反向互补。

在另一优选例中，所述各向导ssDNA中的5'端的第一位核苷酸为T，其余位核苷酸序列与各靶标内引物FIP、BIP之间的扩增序列互补。

在另一优选例中，所述各向导ssDNA长度各自独立地为10-30nt，更佳地，13-20nt。

在另一优选例中，所述各向导ssDNA为5'端化学修饰的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述向导ssDNA序列如下：

*:“P-”表示磷酸化。

报告核酸分子

在本发明的检测方法中，一个核心成分是携带报告分子的报告核酸。

在另一优选实施方式中，本发明的报告核酸分子是分别携带荧光基团和淬灭基团的核酸分子。例如，在5'端标记荧光基团(F)，3'端标记淬灭基团(Q)。

在本发明中，荧光报告核酸分子是根据次级向导ssDNAs的产生位置所决定的；由初级向导ssDNAs对目标核酸序列进行剪切，形成新的5'磷酸化的核酸序列，称之为次级向导ssDNAs，荧光报告核酸覆盖次级向导ssDNAs的所有位置。

探针两端标记的报告荧光染料基团可选自常规的基团种类，作为优选，所述探针SARS-CoV-2 Reporter的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针Influenza A Reporter的5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭基团BHQ2；所述探针Influenza B Reporter的5'端标记有报告荧光染料VIC，3'端标记有淬灭基团BHQ1。

在另一优选例中，所述探针序列如下：

基本原理

在本发明还提供了基于基因编辑酶Ago，比如Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)的核酸检测方法。

在本发明方法中，基于PfAgo酶的剪切活性，可根据靶标核酸分子(比如单链DNA，优选经扩增后的靶标核酸分子)设计出3对向导ssDNA，这3对向导ssDNA靶向于不同靶标核酸分子并介导PfAgo酶对靶标核酸分子进行剪切以形成新的次级向导ssDNA。次级向导ssDNA继续在PfAgo酶的作用下，引导PfAgo酶对与次级向导ssDNAs互补的荧光报告核酸进行剪切，从而达到对荧光报告核酸对应的靶标核酸分子的检测。本发明的方法可大幅度提高靶标核酸检测的灵敏度和多重性。

在本发明中，根据向导ssDNAs的设计要求，可通过特殊设计使PfAgo酶可以选择性地对存在部分位点存在差异的核酸序列进行选择性剪切，从而实现分型检测。

在本发明中，可以在PfAgo酶的剪切体系中同时加入多种靶标核酸分子和向导ssDNAs，结合带有不同荧光基团的报告核酸，能达到对目的核酸的多重检测。

本发明方法非常适合用于检测痕量核酸。通过结合逆转录LAMP以及具有特定序列的向导ssDNA，本发明可以检测核酸模板浓度低至(100拷贝/毫升)的靶标核酸分子，可稳定检出低浓度核酸模板(1000拷贝/毫升)的靶标核酸分子。

在本发明中，所用于扩增反应的扩增引物，其Tm值通常65±10度左右，扩增片段大小约为90-200bp。优选地，扩增引物设计时应避开待检测区段。

试剂

本发明还提供了一种用于靶标核酸分子的检测方法。

在一优选实施方式中，本发明的方法包括：

(a)用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂，所述扩增试剂包括：用于扩增靶标核酸分子的引物对，所述引物对用于进行基于所述靶核酸分子的特异性扩增反应，从而产生特异的核酸扩增产物；

(b)酶切试剂或含所述酶切试剂的酶切缓冲液，其中所述的酶切试剂包括：3对向导ssDNA、基因编辑酶(Ago)、和第一报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团，并且，所述的3对向导ssDNA靶向3种不同靶标核酸分子。

在一优选实施方式中，本发明的试剂包括：

(a)所述向导ssDNA为3对，并且所述的3对向导ssDNA无间隔序列限制；(基因编辑酶(Ago)；

(b)3个报告核酸，所述3个报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；

(c)用于扩增靶标核酸分子的扩增试剂；和

(d)扩增和酶切缓冲液。

应用

本发明特别适合检测微量靶标核酸分子，以及多重检测，具有广泛的应用性。

在本发明中，靶标核酸分子可以是DNA，也可以是RNA。当靶标核酸分子是RNA时，可通过逆转录转变为cDNA再进行检测。

本发明在疾病监控方面，可对疾病做到预测、预防等积极主动管理，做到早期发现早期治疗，或提早预测提早预防。由于本发明的检测灵敏度和准确性非常高，且具有多重检测优势，适合进行早期诊断与病原区分鉴定，对症下药，节省患者治疗时间，提高治疗成功率。本发明减少高额医疗成本浪费，和争取治疗黄金时机。

在环境监控方面，本发明可便捷、快速的对环境污染物中的核酸分子进行准确鉴定，提供有效的环境检测数据。

本发明的主要优点包括：

(1)多重检测：本发明还可在单管反应体系中实现多重检测，显著降低体系复杂性和使用成本。

(2)灵敏度高：灵敏度可达1.5拷贝/反应；

(3)时间短：40-60分钟内即可实现目标基因的检测；

(4)可靠性高：本发明避免了等温扩增技术中非特异性配对导致的假阳性，提高检测准确性；

(5)POCT系统：可应用便携式等温荧光系统，符合POCT理念；

(6)多重检测：本发明还可在单管反应体系中实现多重检测，显著降低体系复杂性和使用成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1检测试剂的制备和检测方法

在本实施例中，提供了本发明SARS-CoV-2病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸多重等温快速检测方法的及其使用方法。

1.1检测试剂的制备

基于本发明方法，相应的检测试剂包括：

(1)、扩增引物，具体序列如下：

(2)、特异性guide ssDNA(gDNA)，具体序列如下：

(3)、与特异性guide ssDNA(gDNA)相应的荧光报告核酸，具体序列如下：

(4)引物混合液：25μl RT-LAMP体系中加入1μl引物混合液，SARS-CoV-2引物体系摩尔浓度分别为FIP、BIP各0.64μM、F3和B3各0.08μM、LF和LB各0.16μM，甲型流感病毒引物体系摩尔浓度分别为FIP、BIP各0.32μM、F3和B3各0.04μM、LF和LB各0.08μM，甲型流感病毒引物摩尔浓度分别为FIP、BIP各0.64μM、F3和B3各0.08μM、LF和LB各0.16μM。

(5)一步法RT-LAMP反应液、阳性对照品和阴性对照品；

一步法RT-LAMP反应液包括1x缓冲液、100μM Mg²⁺、1.4mM dNTPs、8U Bst DNA聚合酶、8U RNA酶抑制剂、20U反转录酶。阳性对照品为携带SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒靶标序列的质粒标准品，所述阴性对照品为无DNase/RNase水。

(6)酶切反应液：包括1x酶切缓冲液、0.4mM Mn²⁺、2.5μM gDNA、0.5μM探针、10μMPfAgo。

1.2检测方法

RT-LAMP扩增体积为25μl，RT-LAMP扩增结束后加入25μl酶切反应液，总酶切反应体积为50μl，具体包括：一步法RT-LAMP反应液12.5μl、引物混合液1μl、模板/阳性对照品/阴性对照品5μl和无DNase/RNase水6.5μl。

RT-LAMP反应条件为：65℃，30-40min。RT-LAMP扩增结束后加入25μL酶切反应液，酶切反应条件为：95℃，1min/循环，每循环收集荧光，20-30个循环。

荧光检测的Start值设置为1～2，所述End值设置为3～5，同时调整阴性对照品的扩增曲线平直或低于阈值线。

有效标准：阴性对照品无Ct值或终点荧光值不超过阈值，阳性对照品各通道Ct≤25或终点荧光值高于阈值3倍以上。

阳性判读标准：FAM通道CT≤27或重点荧光值高于阈值2倍以上或重点荧光值高于阈值2倍以上为SARS-CoV-2阳性；ROX通道CT≤27或重点荧光值高于阈值2倍以上为甲型流感病毒阳性；VIC通道CT≤27或重点荧光值高于阈值2倍以上为乙型流感病毒阳性。

实施例2不同引物比例组合检测多靶标混合样本

将实施例1中的SARS-CoV-2病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒引物按照4：4：4、4：3；4、4：2：4进行混合，分别对不同靶标混合的质粒样本进行检测，除引物外，其余试剂和方法按实施例1进行操作。

混合样本各靶标质粒浓度为1500拷贝/反应、150拷贝/反应。

结果如图2、图9所示，结果表明，4：2：4的引物比例检出效果最好。

实施例3针对不同浓度的SARS-CoV-2病毒质粒样本进行检测

在本实施例中，SARS-CoV-2病毒的特异性目标核酸序列为：

5'-ATGCACTTTTCGCATATACAAAACGTAATGTCATCCCTACTATAACTCAAATGAATCTTAAGTATGCCATTAGTGCAAAGAATAGAGCTCGCACCGTAGCTGGTGTCTCTATCTGTAGTACTATGACCAATAGACAGTTTCATCAAAAATTATTGAAATCAATAGCCGCCACTAGAGGAGCTACTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGGCACAACATGTTAAAAACTGTTTATAGTGATGTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCATGCCTAACATGCTTAGAATTATGGCCTCACTTGTTCTTGCTCGCAAACATACAACGTGTTGTAGCTTGTCACACCGTTTCTATAGATTAGCTAATGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAAATGGTCATGTGTGGCGGTTCACTATATGTTAAACCAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAACATTTGTCAAGCTGTCACGGCCAATGTTAATGCACTTTTATCTACTGATGGTAACAAAATTGCCGATAAGTATGTCCGCAATTTACAACACAGACTTTATGAGTGTCTCTATAGAAATAGAGATGTTGACACAGACTTTGTGAATGAGTTTTACGCATATTTGCGTAAACATTTCTCAATGATGATACTCTCTGACGATGCTGTTGTGTGTTTCAATAGCACTTATGCATCTCAAGGTCTAGTGGCTAGCATAAAGAACTTTAAGTCAGTTCTTTATTATCAAAACAATGTTTTTATGTCTGAAGCAAAATGTTGGACTGAGACTGACCTTACTAAAGGACCTCATGAATTTTGCTCTCAACATACAATGCTAGTTAAACAGGGTGATGATTATGTGTACCTTCCTTACCCAGATCCATCAAGAATCCTAGGGGCCGGCTGTTTTGTAGATGATATCGTAAAAACAGATGGTACACTTATGATTGAACG-3'，SEQ ID No:28。

按10倍倍比稀释的原则对待检质粒(SEQ ID No:28)进行稀释，分别稀释成15000拷贝/反应，1500拷贝/反应，150拷贝/反应，15拷贝/反应，1.5拷贝/反应的标准品稀释液。将质粒样本和阴性对照(H2O)加入到实施例1中的扩增体系中，按实施例1步骤进行操作。

结果如图3所示，最低可检测出1.5拷贝/反应的样本，阴性对照(0拷贝/反应)成立。

结果表明，本发明SARS-CoV-2病毒最低检测限可达1.5拷贝/反应。

实施例4针对不同浓度的甲型流感病毒质粒样本进行检测

本实施例中，甲型流感病毒相应的特异性目标核酸序列为：

5'-AGCGAAAGCAGGTAGATATTGAAAGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTACGTTCTCTCTATCATCCCGTCAGGCCCCCTCAAAGCCGAGATCGCACAGAGACTTGAAGATGTCTTTGCAGGGAAGAACACCGATCTTGAGGTTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGATTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAACGGGGATCCAAATAACATGGACAAAGCAGTTAAACTGTATAGGAAGCTCAAGAGGGAGATAACATTCCATGGGGCCAAAGAAATCTCACTCAGTTATTCTGCTGGTGCACTTGCCAGTTGTATGGGCCTCATATACAACAGGATGGGGGCTGTGACCACTGAAGTGGCATTTGGCCTGGTATGTGCAACCTGTGAACAGATTGCTGACTCCCAGCATCGGTCTCATAGGCAAATGGTGACAACAACCAACCCACTAATCAGACATGAGAACAGAATGGTTTTAGCCAGCACTACAGCTAAGGCTATGGAGCAAATGGCTGGATCGAGTGAGCAAGCAGCAGAGGCCATGGAGGTTGCTAGTCAGGCTAGGCAAATGGTGCAAGCGATGAGAACCATTGGGACTCATCCTAGCTCCAGTGCTGGTCTGAAAAATGATCTTCTTGAAAATTTGCAGGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGTTCAAGTGATCCTCTCGCTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATAGAGCTGGAGTAAAAAACTACCTTGTTTCTACT-3'，SEQ ID No:29

按10倍倍比稀释的原则对待检质粒(SEQ ID No:29)进行稀释，分别稀释成15000拷贝/反应，1500拷贝/反应，150拷贝/反应，15拷贝/反应，1.5拷贝/反应的标准品稀释液。将质粒样本和阴性对照(H2O)加入到实施例1中的扩增体系中，按实施例1步骤进行操作。

结果如图4所示，最低可检测出1.5拷贝/反应的样本，阴性对照(0拷贝/反应)成立。

实施例5针对不同浓度的乙型流感病毒质粒样本进行检测

本实施例中，乙型流感病毒相应的特异性目标核酸序列为：

5'-AGCAGAAGCGTTGCATTTTCTAATATCCACAAAATGAAGGCAATAATTGTACTACTCATGGTAGTAACATCCAATGCAGATCGAATCTGCACTGGGATAACATCGTCAAACTCACCTCATGTGGTTAAAACTGCCACTCAAGGGGAAGTCAATGTGACTGGTGTGATACCACTAACAACAACACCTACCAAATCTCATTTTGCAAATCTCAAAGGAACACAGACCAGAGGAAAACTATGCCCAAACTGTTTTAACTGCACAGATCTGGACGTGGCCCTAGGCAGACCAAAATGCATGGGGAACACACCCTCCGCAAAAGTCTCAATACTCCATGAAGTCAAACCTGCTACATCTGGATGCTTTCCTATAATGCACGACAGAACAAAAATCAGACAACTACCTAATCTTCTCAGAGGATATGAAAACATCAGGTTATCAACCAGTAATGTTATCAATACAGAGACGGCACCAGGAGGACCCTACAAGGTGGGGACCTCAGGATCTTGCCCTAACGTTGCTAATGGGAACGGCTTCTTCAACACAATGGCTTGGGTTATCCCAAAAGACAACAACAAGACAGCAATAAATCCAGTAACAGTAGAAGTACCATACATTTGTTCAGAAGGGGAAGACCAAATTACTGTTTGGGGGTTCCACTCTGATGACAAAACCCAAATGGAAAGACTCTATGGAGACTCAAATCCTCAAAAGTTCACCTCATCTGCCAATGGAGTAACCACACATTATGTTTCTCAGATTGGTGGCTTCCCAAATCAAACAGAAGACGAAGGGCTAAAACAAAGCGGCAGAATTGTTGTTGATTACATGGTACAAAAACCTGGAAAAACAGGAACAATTGTTTATCAAAGAGGCATTTTATTGCCTCAAAAAGTGTGGTGCGCAAGTGGCAGGAGCAAGGTAATAAAAGGGTCCTTGCCTTTAATTGGTGAAGCAGATTGCCTCCACGAAAAGTACGGTGGATTAAATAAAAGCAAGCCTTACTACACAGGAGAGCATGCAAAGGCCATAGGAAA-3'，SEQ ID No:30

按10倍倍比稀释的原则对待检质粒(SEQ ID No:30)进行稀释，分别稀释成15000拷贝/反应，1500拷贝/反应，150拷贝/反应，15拷贝/反应，1.5拷贝/反应的标准品稀释液。将质粒样本和阴性对照(H₂O)加入到实施例1中的扩增体系中，按实施例1步骤进行操作。

结果如图5所示，最低可检测出1.5拷贝/反应的样本，阴性对照(0拷贝/反应)成立。

实施例6针对不同浓度的假病毒标准品进行检测

按10倍倍比稀释的原则对待检标准品进行稀释，分别稀释成10000拷贝/毫升，1000拷贝/毫升，100拷贝/毫升，10拷贝/毫升，假病毒稀释液，分别吸取140μl标准品稀释液进行核酸提取(QIAamp Viral RNA Mini Kit)。将10μl核酸提取样品、阴性对照(H₂O)和阳性对照(目标片段质粒)加入到实施例1中的扩增体系中，每个浓度梯度分别做做4个重复，实验按实施例1步骤进行操作。

结果如图6所示，本发明检测方法对10000拷贝/毫升，1000拷贝/毫升的SARS-CoV-2假病毒样本均稳定检出，最低可检测出100拷贝/毫升的样本，阴性对照(0拷贝/毫升)成立，与商品化qPCR检测试剂盒检测结果一致。

结果表明，本发明SARS-CoV-2假病毒最低检测限可达600拷贝/毫升。

实施例7应用便携式设备检测RNA标准品

使用SARS-CoV-2 RNA标准品，稀释梯度为450、150、50、16、5、1.6、0拷贝/反应，每个梯度三个样本重复。

实验方法参照实施例1。

图7显示，便携式荧光检测设备检测灵敏度可达5拷贝/反应(三个重复全部检出)。

结果表明本发明能够应用于便携式设备，实现POCT检测。

实施例8临床样品的验证

使用33个经2种荧光RT-PCR方法确诊的临床样品(32个甲型流感样本和1个乙型流感样本)。

反应条件参照实施例1。

结果如图6所示，本发明检测方法对33个临床样品的检测结果与商品化qPCR检测试剂盒检测结果一致，并且没有交叉荧光信号。

结果表明本发明能够区分临床样本中存在的多种病毒的种类

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸多重等温快速检测方法

<130> P2022-0097

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 LAMP F3

<400> 1

cgcaaacata caacgtgttg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 LAMP B3

<400> 2

gtgttgtaaa ttgcggacat 20

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 LAMP FIP

<400> 3

acacatgacc atttcactca atactgcttg tcacaccgtt tct 43

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 LAMP BIP

<400> 4

catttgtcaa gctgtcacgg cggcaatttt gttaccatca gt 42

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 LAMP LF

<400> 5

cacactcatt agctaatcta t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 LAMP LB

<400> 6

caatgttaat gcacttttat c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A LAMP F3

<400> 7

tttctatcat cccrtcaggc 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A LAMP B3

<400> 8

tcgggtcccc attcccatt 19

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A LAMP FIP

<400> 9

ttagccattc catgagagcc tcragcccct caaagccgag atc 43

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A LAMP BIP

<400> 10

ttgtgttcac gctcaccgtg cttttggaca aagcgyctac g 41

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A LAMP LF

<400> 11

ctgtgttctt tcctgcaaar aca 23

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A LAMP LB

<400> 12

cagtgagcga ggactgca 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B LAMP F3

<400> 13

caaatcaaac agaagacgga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B LAMP B3

<400> 14

gcttttgttt aatccaccgt 20

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B LAMP FIP

<400> 15

acccctttga tagryaattg ttccaaagtg gcagaattgt tgttga 46

<210> 16

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B LAMP BIP

<400> 16

caagtggcag gagcaargta atttttcgtg gaggcaatc 39

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B LAMP LF

<400> 17

gttttcccag atttytgcac catg 24

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B LAMP LB

<400> 18

ggatccttgc ccttaattgg wgaag 25

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 gDNA 1

<400> 19

ttgatgaggt tccacc 16

<210> 20

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 gDNA 2

<400> 20

tcagttgtgg catctc 16

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A gDNA 1

<400> 21

tcagttgtgg catctc 16

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A gDNA 2

<400> 22

tgtcacctct gactaa 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B gDNA 1

<400> 23

tattttattg cctcaa 16

<210> 24

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B gDNA 2

<400> 24

taggtgtggt gcgcaa 16

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2 Reporter

<400> 25

agttgtggca tctcctgatg aggttccac 29

<210> 26

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza A Reporter

<400> 26

taccagtcaa tcttgtcacc tcttaccagt 30

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> Influenza B Reporter

<400> 27

aaagccccag aagttcacct catctgccaa 30

<210> 28

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> SARS-CoV-2病毒的特异性目标核酸序列

<400> 28

atgcactttt cgcatataca aaacgtaatg tcatccctac tataactcaa atgaatctta 60

agtatgccat tagtgcaaag aatagagctc gcaccgtagc tggtgtctct atctgtagta 120

ctatgaccaa tagacagttt catcaaaaat tattgaaatc aatagccgcc actagaggag 180

ctactgtagt aattggaaca agcaaattct atggtggttg gcacaacatg ttaaaaactg 240

tttatagtga tgtagaaaac cctcacctta tgggttggga ttatcctaaa tgtgatagag 300

ccatgcctaa catgcttaga attatggcct cacttgttct tgctcgcaaa catacaacgt 360

gttgtagctt gtcacaccgt ttctatagat tagctaatga gtgtgctcaa gtattgagtg 420

aaatggtcat gtgtggcggt tcactatatg ttaaaccagg tggaacctca tcaggagatg 480

ccacaactgc ttatgctaat agtgttttta acatttgtca agctgtcacg gccaatgtta 540

atgcactttt atctactgat ggtaacaaaa ttgccgataa gtatgtccgc aatttacaac 600

acagacttta tgagtgtctc tatagaaata gagatgttga cacagacttt gtgaatgagt 660

tttacgcata tttgcgtaaa catttctcaa tgatgatact ctctgacgat gctgttgtgt 720

gtttcaatag cacttatgca tctcaaggtc tagtggctag cataaagaac tttaagtcag 780

ttctttatta tcaaaacaat gtttttatgt ctgaagcaaa atgttggact gagactgacc 840

ttactaaagg acctcatgaa ttttgctctc aacatacaat gctagttaaa cagggtgatg 900

attatgtgta ccttccttac ccagatccat caagaatcct aggggccggc tgttttgtag 960

atgatatcgt aaaaacagat ggtacactta tgattgaacg 1000

<210> 29

<211> 1027

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 甲型流感病毒的特异性目标核酸序列

<400> 29

agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60

ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120

tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180

gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240

aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300

catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360

caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420

caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480

acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaacccact 540

aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600

ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctaggcaaat 660

ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720

tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780

gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc 840

ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900

cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960

ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020

ttctact 1027

<210> 30

<211> 1034

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 乙型流感病毒的特异性目标核酸序列

<400> 30

agcagaagcg ttgcattttc taatatccac aaaatgaagg caataattgt actactcatg 60

gtagtaacat ccaatgcaga tcgaatctgc actgggataa catcgtcaaa ctcacctcat 120

gtggttaaaa ctgccactca aggggaagtc aatgtgactg gtgtgatacc actaacaaca 180

acacctacca aatctcattt tgcaaatctc aaaggaacac agaccagagg aaaactatgc 240

ccaaactgtt ttaactgcac agatctggac gtggccctag gcagaccaaa atgcatgggg 300

aacacaccct ccgcaaaagt ctcaatactc catgaagtca aacctgctac atctggatgc 360

tttcctataa tgcacgacag aacaaaaatc agacaactac ctaatcttct cagaggatat 420

gaaaacatca ggttatcaac cagtaatgtt atcaatacag agacggcacc aggaggaccc 480

tacaaggtgg ggacctcagg atcttgccct aacgttgcta atgggaacgg cttcttcaac 540

acaatggctt gggttatccc aaaagacaac aacaagacag caataaatcc agtaacagta 600

gaagtaccat acatttgttc agaaggggaa gaccaaatta ctgtttgggg gttccactct 660

gatgacaaaa cccaaatgga aagactctat ggagactcaa atcctcaaaa gttcacctca 720

tctgccaatg gagtaaccac acattatgtt tctcagattg gtggcttccc aaatcaaaca 780

gaagacgaag ggctaaaaca aagcggcaga attgttgttg attacatggt acaaaaacct 840

ggaaaaacag gaacaattgt ttatcaaaga ggcattttat tgcctcaaaa agtgtggtgc 900

gcaagtggca ggagcaaggt aataaaaggg tccttgcctt taattggtga agcagattgc 960

ctccacgaaa agtacggtgg attaaataaa agcaagcctt actacacagg agagcatgca 1020

aaggccatag gaaa 1034

Claims

1.一种SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂包括向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：

(Z1)针对SARS-CoV-2的第一gDNA对：

其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；

P-TTGATGAGGTTCCACC SEQ ID No:19

P-TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:20

(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：

其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和

P-TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:21

P-TGTCACCTCTGACTAA SEQ ID No:22

(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：

其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示:

P-TATTTTATTGCCTCAA SEQ ID No:23

P-TAGGTGTGGTGCGCAA SEQ ID No:24。

2.如权利要求1所述的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂还包括荧光报告核酸集，所述荧光报告核酸集包括：

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸：

其中，第一荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:25所示；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸：

其中，荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:26所示；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸：

其中，第三荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:27所示。

3.如权利要求2所述的荧光报告核酸集，其特征在于，第一荧光报告核酸、第二荧光报告核酸和第三荧光报告核酸的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。

4.如权利要求1所述的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂还包括LAMP引物组的集，所述LAMP引物组的集包括：

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组：

(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组：

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组：

5.一种用于检测SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸的反应体系，其特征在于，所述的反应体系含有：

(Z)用于检测核酸的向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：

(Z1)针对SARS-CoV-2的第一gDNA对：

其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；

(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：

其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和

(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：

其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示；

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸；

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组；

(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组；和

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组。

6.如权利要求2所述的荧光报告核酸集，其特征在于，所述的荧光报告核酸集包括：

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸：

其中，第一荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:25所示；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸：

其中，荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:26所示；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸：

其中，第三荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:27所示。

7.如权利要求4所述的LAMP引物组的集，其特征在于，对于针对同一病毒的LAMP引物组中的F3/B3、LF/LB、和/或FIP/BIP引物对，F3引物和B3引物的浓度C1、LF引物和LB引物的浓度C2；FIP引物和BIP引物的浓度C3满足：C1：C2：C3＝(0.8-1.2)：(1.5-3)：(5-12)，较佳地(0.9-1.1):(1.8-2.5):(6-10)，更佳地为约1：2：8。

8.如权利要求4所述的LAMP引物组的集，其特征在于，对于针对两个或三个所述病毒的LAMP引物组中的F3/B3、LF/LB、和/或FIP/BIP引物对，其浓度之比满足：

9.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有：

(Z)用于检测核酸的向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：

(Z1)针对SARS-CoV-2的第一gDNA对：

其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；

(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：

其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和

(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：

其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示；

(Y1)针对SARS-CoV-2的第一荧光报告核酸；

(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸；和

(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸；

(W1)针对SARS-CoV-2的第一LAMP引物组；

(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组；和

(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组；

基因编辑酶(Ago)。

10.一种SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测方法，其特征在于，包括步骤：采用权利要求1-5中任一项所述的SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸等温多重检测试剂，进行检测。