CN117737212A - 一种恒温单管检测单碱基变异的方法及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种恒温单管检测单碱基变异的方法及其检测试剂盒。本发明通过将恒温扩增与酶切反应结合，利用酶切反应的特异性，实现了单碱基的检测分辨率，其中与靶标结合的检测探针设计了标签序列，通过标签序列与信号报告探针的杂交进一步将识别到的靶标信息转换为信号报告探针输出的信号，达到了信号报告探针通用的目的，节约了检测方法的试剂成本。因此，与现有的恒温检测方法相比，本方法具有操作简便、检测灵敏度高、特异性好、信号报告探针通用等优势，能够实现单管对单碱基差异靶标的低成本恒温检测。
Description
技术领域
本发明属于恒温核酸检测技术领域，具体涉及一种恒温单管检测单碱基变异的方法及其检测试剂盒，尤其涉及一种偶联等温扩增和等温酶切反应的单管检测单碱基变异的方法。
背景技术
单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)分型、体细胞单碱基突变检测对疾病诊断和精准治疗具有重要意义，但其对检测方法要求高，需要能够识别单碱基差异靶标，主要采用基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)的Taqman探针法。事实上，与依赖热循环的PCR扩增不同，恒温扩增反应具有对仪器温度变化要求低、扩增速度快等优势，特别适合试纸条、微流控等检测平台，更符合即时检测(Point-of-caretesting，POCT)的需求，有利于实现快速、便携、低成本的床旁检测。目前，恒温条件下稳定扩增的技术主要有环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification)、重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)、滚环扩增(Rolling circleamplification，RCA)等。尽管恒温扩增技术能够在恒定温度下迅速扩增产生大量模板，但由于聚合酶没有5’→3’外切酶活性，无法直接加入Taqman-MGB探针检测多重靶标或进行序列差异区分，故恒温扩增技术主要应用于单一靶标检测，通过染料法、指示剂法、浊度法等判断靶标有无。因此，实现恒温条件下对不同核酸靶标，特别是单碱基差异靶标的特异性检测是一大难题。
为了克服恒温扩增只能进行单个靶标检测的不足，有研究尝试引入其他酶反应，如连接酶、成簇规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及CRISPR辅助蛋白(CRISPR-associated proteins，CRISPR/Cas)组成的CRISPR/Cas基因编辑系统等，但这类方法需要在不同管中进行反应，或需要开管处理扩增产物，操作步骤繁琐。也有研究为了实现单管恒温检测不同靶标，联合其他核酸内切酶反应，并对靶标检测探针进行了改进，即在常规荧光基团修饰基础上增加特殊修饰，如RNA修饰探针、四氢呋喃残基修饰等，通过引入特殊修饰，让靶标检测反应与恒温扩增反应能够兼容在一管体系中，但这类方法信号报告基团修饰的报告探针不通用，且制作成本高，导致方法研发成本和检测试剂成本昂贵，并不适合大范围推广应用。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种单碱基分辨率高、灵敏度高、操作简便、探针通用性好、检测成本低的恒温单管检测单碱基变异的新方法，能够在闭管条件下识别具有单个碱基差异的核酸靶标。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种单管检测碱基变异的试剂盒。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种恒温单管检测单碱基变异的方法，所述方法为偶联等温扩增和等温酶切反应的方法，具体包括以下步骤：在单管中配制包括LAMP扩增引物、带有标签序列1的野生型靶标的下游检测探针，带有标签序列2的突变型靶标的下游检测探针，匹配签序列1的信号报告探针1、匹配签序列2的信号报告探针2、聚合酶和核酸酶的反应体系，加入待检测样本后，在恒定温度下进行反应，通过生成的报告信号判断具体的检测靶标，所述的带有标签序列1野生型靶标的下游检测探针1和带有标签序列2的突变型靶标的下游检测探针2是针对靶标在扩增过程中大量形成的中间体区域特异性设计得到。
其中，所述聚合酶包括Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶或phi29 DNA聚合酶中的一种。
其中，所述核酸酶只有在检测探针与靶标序列杂交或标签序列与信号报告探针杂交后才进行切割反应，所述的核酸酶包括核酸内切酶、核酸外切酶或切刻内切酶中的一种。
其中，所述核酸酶为flap核酸内切酶，所述flap核酸内切酶能识别由一条上游检测探针、一条下游检测探针与靶标序列杂交形成三碱基重叠的核酸侵入结构，该三碱基重叠区域位于下游检测探针和靶标序列杂交结合处，同时上游检测探针的3’端碱基侵入结合处5’端一个碱基，该区域形成后能够被flap核酸内切酶识别切割。
其中，所述反应体系还包括KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tris-HCl和Tween-20。
其中，所述待测样本包括核酸、细胞裂解物、血液、唾液或尿液中的一种或几种。
其中，所述恒定温度为同时兼容恒温扩增反应和酶切反应的温度，作为优选，所述恒定温度为60℃～65℃。
其中，所述待检测样本包括L858R野生型样本、L858R突变型样本中的一种或两种，所述LAMP扩增引物包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述检测探针包括上游检测探针，野生型-T碱基下游检测探针，突变型-G碱基下游检测探针，匹配flap1的FRET-probe1、通用荧光信号报告探针1，通用荧光信号报告探针2，所述F3如SEQ ID NO.3所示，所述B3如SEQ ID NO.4所示，所述FIP如SEQ ID NO.5所示，所述BIP如SEQ ID NO.6所示，所述LF如SEQ ID NO.7所示，所述LB如如SEQ ID NO.8所示，所述上游检测探针如SEQ ID NO.9所示，所述野生型-T碱基下游检测探针如SEQ ID NO.10所示，所述突变型-G碱基下游检测探针如SEQ ID NO.11所示，所述通用荧光信号报告探针1如SEQ ID NO.12所示，所述通用荧光信号报告探针2如SEQID NO.13所示。
本发明内容还包括一种单管检测碱基变异的试剂盒，所述试剂盒包括LAMP扩增引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB、上游检测探针，野生型-T碱基下游检测探针，突变型-G碱基下游检测探针，匹配flap1的FRET-probe1、通用荧光信号报告探针1，通用荧光信号报告探针2，所述F3如SEQ ID NO.3所示，所述B3如SEQ ID NO.4所示，所述FIP如SEQ ID NO.5所示，所述BIP如SEQ ID NO.6所示，所述LF如SEQ ID NO.7所示，所述LB如如SEQ ID NO.8所示，所述上游检测探针如SEQ ID NO.9所示，所述野生型-T碱基下游检测探针如SEQ ID NO.10所示，所述突变型-G碱基下游检测探针如SEQ ID NO.11所示，所述通用荧光信号报告探针1如SEQID NO.12所示，所述通用荧光信号报告探针2如SEQ ID NO.13所示。
其中，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、重组FEN1酶、dNTPmix、甜菜碱、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tris-HCl，Tween-20。
有益效果：与现有检测方法相比，本方法具有如下优点：本方法通过将恒温扩增与酶切反应结合，利用酶切反应的特异性，实现了单碱基的检测分辨率，其中与靶标结合的检测探针设计了标签序列，通过标签序列与信号报告探针的杂交进一步将识别到的靶标信息转换为信号报告探针输出的信号，达到了信号报告探针通用的目的，节约了检测方法的试剂成本。因此，与现有的恒温检测方法相比，本方法具有操作简便、检测灵敏度高、特异性好、信号报告探针通用等优势，能够实现单管对单碱基差异靶标的低成本恒温检测，可用于SNP分型和突变检测。
附图说明
图1为本发明用于检测具有单碱基差异的两种靶标原理图；
图2为恒温扩增反应与核酸酶酶反应兼容性验证结果；
图3为本发明检测方法的灵敏度；
图4为本发明检测临床组织样本中的L858R基因突变(T>G)结果。
具体实施方式
下面结合具体的实施例以及附图对本发明的技术方案进一步地完整的详细描述。
本发明以环介导等温扩增和flap核酸内切酶酶切反应偶联的恒温检测方法为例，通过应用于L858R(T>G)单碱基突变检测对本发明进行具体介绍。检测原理如图1所示，为了在单管反应中区分单碱基差异(T>G，变异碱基处用简并碱基K表示)的核酸靶标，设计LAMP扩增引物和检测探针。由于携带T碱基的野生型靶标(W)和携带G碱基的突变型靶标(M)只有单碱基差异，因此LAMP扩增引物(F3、B3、FIP、BIP、LF和LB)和上游检测探针(UP)两靶标共用，野生型靶标的下游检测探针(W-DP)带有通用标签序列(flap1)，突变型靶标的下游检测探针(M-DP)带有通用标签序列(flap2)。具体检测过程为待测靶标核酸首先在LAMP扩增引物作用下生产大量茎环中间体(Intermediate)，此时上游检测探针和特异性下游检测探针去识别靶标序列，当存在与检测探针完全匹配的靶标时将形成三碱基重叠结构，核酸内切酶切割下游检测探针释放通用标签序列，进一步与通用荧光信号报告探针(匹配flap1的FRET-probe1或匹配flap2的FRET-probe2)结合形成三碱基重叠结构，产生靶标特异性报告信号。
药品和试剂：dNTP购自北京赛百盛基因技术有限公司，Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司，重组flap核酸内切酶1(FEN1)自行表达(重组flap核酸内切酶1的表达及活性测定方法的建立，盛楠等，生物工程学报)，Tris-KCl等化学试剂均购自上海国药集团。实验用水为无核酶灭菌双蒸水，寡核苷酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成，质粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成，经突变扩增反应(Amplificationrefractory mutation system-polymerase chain reaction，ARMS-PCR)鉴定后的组织样本核酸提取物为某医院病理科提供。
实施过程中用到的核酸序列如下(5’-3’)：
L858R野生型质粒(SEQ ID NO.1)：
TTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAG
GAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAA
CTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGG
CTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCL858R突变型质粒(SEQ IDNO.2)：
TTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAG
GAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCGGGCCAAA
CTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGG
CTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCC
扩增引物F3(SEQ ID NO.3)：
TACTTGGAGGACCGTCG
扩增引物B3(SEQ ID NO.4)：
TGGTCCCTGGTGTCAG
扩增引物FIP(SEQ ID NO.5)：
GCCCAAAATCTGTGATCTTGACTTAGCCAGGAACGTACT
扩增引物BIP(SEQ ID NO.6)：
TGGGTGCGGAAGAGAAAGTTTTTTATGCTGGCTGACCTA
扩增引物LF(SEQ ID NO.7)：
ATGCTGCGGTGTTTTCAC
扩增引物LB(SEQ ID NO.8)：
ATACCATGCAGAAGGAGGC
上游检测探针(SEQ ID NO.9)：
CGCACCCAGCAGTTTGGCCT
野生型-T碱基下游检测探针(SEQ ID NO.10)：
ACGGACGCGGAGAGCCCAAAATCTGTGATCTTG-PO3
突变型-G碱基下游检测探针(SEQ ID NO.11)：
CGCGCCGAGGCGCCCAAAATCTGTGATCTT-PO3
通用荧光信号报告探针1(SEQ ID NO.12)：
FAM-TCTT(BHQ1)AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACTCCGCGTCCGT-C6-NH2
通用荧光信号报告探针2(SEQ ID NO.13)：
VIC-TCTT(BHQ1)AGCCGGTTTTCCGGCTAAGACCTCGGCGCG-C6-NH2
注：加粗字体为识别的差异单碱基；斜体字体为通用标签序列，能与通用荧光信号报告探针互补。
实施例1本发明恒温扩增反应与核酸酶酶切反应兼容性验证结果
配置反应体系：20μL体系包含1×反应缓冲液(10mM KCl，8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl，0.1％ Tween-20，pH8.8)，0.2μM扩增引物F3(SEQ ID NO.3)和B3(SEQID NO.4)，1.6μM扩增引物FIP(SEQ ID NO.5)和BIP(SEQ ID NO.6)，0.8μM扩增引物LF(SEQID NO.7)和LB(SEQ ID NO.8)，0.05μM上游检测探针(SEQ ID NO.9)，0.5μM野生型-T碱基下游检测探针(SEQ ID NO.10)，4μM突变型-G碱基下游检测探针(SEQ ID NO.11)，0.25μM通用荧光信号报告探针1(SEQ ID NO.12)和通用荧光信号报告探针2(SEQ ID NO.13)，16U Bst聚合酶，200U重组FEN1，1.4mM dNTPmix，80mM甜菜碱，250aM的L858R野生型质粒(SEQ IDNO.1)或/和250aM的L858R突变型质粒(SEQ ID NO.2)，以双蒸水为阴性对照。
在StepOne实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上进行恒温反应，程序为：61℃1min，读取荧光信号，共60个循环。
结果示于图2，当检测体系只加入L858R野生型质粒(W)时，识别野生型靶标荧光信号通道检测到阳性荧光信号，而识别突变型靶标的荧光信号通道无阳性信号；当检测体系只加入L858R突变型质粒(M)时，识别野生型靶标荧光信号通道无阳性信号，而识别突变型靶标的荧光信号通道有特异性荧光信号；当检测体系同时加入质粒W和M时，识别野生型靶标荧光信号通道有特异性荧光信号，识别突变型靶标的荧光信号通道也有特异性荧光信号。表明具有单碱基差异的核酸靶标在反应体系中能够正常扩增和特异性识别，证明恒温扩增反应与核酸酶酶切反应兼容，具有区分单碱基差异的特异性，可用于SNP分型、单碱基突变检测等。
实施例2本发明检测方法的灵敏度检测
配置反应体系：20μL体系包含1×反应缓冲液(10mM KCl，8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl，0.1％ Tween-20，pH8.8)，0.2μM扩增引物F3(SEQ ID NO.3)和B3(SEQID NO.4)，1.6μM扩增引物FIP(SEQ ID NO.5)和BIP(SEQ ID NO.6)，0.8μM扩增引物LF(SEQID NO.7)和LB(SEQ ID NO.8)，0.05μM上游检测探针(SEQ ID NO.9)，0.5μM野生型-T碱基下游检测探针(SEQ ID NO.10)，4μM突变型-G碱基下游检测探针(SEQ ID NO.11)，0.25μM通用荧光信号报告探针1(SEQ ID NO.12)和通用荧光信号报告探针2(SEQ ID NO.13)，16U Bst聚合酶，200U重组FEN1，1.4mM dNTPmix，80mM甜菜碱，终浓度分别为250aM、25aM、2.5aM或0.25aM的L858R野生型质粒(SEQ ID NO.1)和终浓度分别为250aM、25aM、2.5aM或0.25aM的L858R突变型质粒(SEQ ID NO.2)按1:1混合组成的混合模板，以双蒸水为阴性对照。
在StepOne实时荧光定量PCR仪上进行恒温反应，程序为：61℃1min，读取荧光信号，共60个循环。
结果示于图3，浓度低至2.5aM的质粒W和M均能检出特异性荧光信号，表明该方法对核酸靶标的检测灵敏度达到每管反应浓度为2.5aM(30拷贝)，检测灵敏度高。
实施例3本方法检测临床组织样本中的L858R基因突变(T>G)
研究证实含有L858R突变的肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂才敏感，因此检测L858R基因突变对临床靶向用药具有指导意义。为了考察本方法应用于临床实际样本的效果，采用以下步骤对临床组织样本核酸提取物进行L858R基因突变检测：
配置反应体系：20μL体系包含1×反应缓冲液(10mM KCl，8mM MgSO4、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl，0.1％ Tween-20，pH8.8)，0.2μM扩增引物F3(SEQ ID NO.3)和B3(SEQID NO.4)，1.6μM扩增引物FIP(SEQ ID NO.5)和BIP(SEQ ID NO.6)，0.8μM扩增引物LF(SEQID NO.7)和LB(SEQ ID NO.8)，0.05μM上游检测探针(SEQ ID NO.9)，0.5μM野生型-T碱基下游检测探针(SEQ ID NO.10)，4μM突变型-G碱基下游检测探针(SEQ ID NO.11)，0.25μM通用荧光信号报告探针1(SEQ ID NO.12)和通用荧光信号报告探针2(SEQ ID NO.13)，16U Bst聚合酶，200U重组FEN1，1.4mM dNTPmix，80mM甜菜碱，1μL临床组织样本核酸提取物，以双蒸水为阴性对照。
在StepOne实时荧光定量PCR仪上进行恒温反应，程序为：61℃1min，读取荧光信号，共60个循环。
为了考察本方法检测临床实际样本的可行性，使用34例某三甲医院病理科用ARMS-PCR法检测后的临床组织样本核酸提取物进行验证，具体样本情况如表1所示，包括23例纯野生样本和11例含有L858R突变的样本。
表1
结果显示，本方法对34例样本检测结果与临床提供结果完全一致。代表性临床样本的荧光曲线结果示于图4，样本S1和S3均只检出野生型靶标的荧光信号，无突变型靶标信号，表明所测样本无突变，临床检测参考结果也显示S1和S3为纯野生样本；样本S2和S5在单管反应中同时检出了野生型靶标信号和突变型靶标信号，表明所测样本存在突变，相应的临床检测参考结果显示S2和S5为携带突变的样本。上述结果证明了本方法能够用于临床实际样本的基因突变检测，有一定的临床应用价值。
Claims (10)
1.一种恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述方法为偶联等温扩增和等温酶切反应的方法，具体包括以下步骤：在单管中配制包括LAMP扩增引物、带有标签序列1的野生型靶标的下游检测探针，带有标签序列2的突变型靶标的下游检测探针，匹配签序列1的信号报告探针1、匹配签序列2的信号报告探针2、聚合酶和核酸酶的反应体系，加入待检测样本后，在恒定温度下进行反应，通过生成的报告信号判断具体的检测靶标，所述的带有标签序列1野生型靶标的下游检测探针1和带有标签序列2的突变型靶标的下游检测探针2是针对靶标在扩增过程中大量形成的中间体区域特异性设计得到。
2.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述聚合酶包括Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶或phi29 DNA聚合酶中的一种。
3.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述核酸酶只有在检测探针与靶标序列杂交或标签序列与信号报告探针杂交后才进行切割反应，所述的核酸酶包括核酸内切酶、核酸外切酶或切刻内切酶中的一种。
4.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述核酸酶为flap核酸内切酶，所述flap核酸内切酶能识别由一条上游检测探针、一条下游检测探针与靶标序列杂交形成三碱基重叠的核酸侵入结构，该三碱基重叠区域位于下游检测探针和靶标序列杂交结合处，同时上游检测探针的3’端碱基侵入结合处5’端一个碱基，该区域形成后能够被flap核酸内切酶识别切割。
5.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述反应体系还包括KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tris-HCl和Tween-20。
6.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述待测样本包括核酸、细胞裂解物、血液、唾液或尿液中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述恒定温度为同时兼容恒温扩增反应和酶切反应的温度，作为优选，所述恒定温度为60℃~65℃。
8.根据权利要求1所述的恒温单管检测单碱基变异的方法，其特征在于，所述待检测样本包括L858R野生型样本、L858R突变型样本中的一种或两种，所述LAMP扩增引物包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述检测探针包括上游检测探针，野生型-T碱基下游检测探针，突变型-G碱基下游检测探针，匹配flap1的FRET-probe1、通用荧光信号报告探针1，通用荧光信号报告探针2，所述F3如SEQ ID NO.3所示，所述B3如 SEQ ID NO.4所示，所述FIP如 SEQ IDNO.5所示，所述BIP如 SEQ ID NO.6所示，所述LF如 SEQ ID NO.7所示，所述LB如如 SEQ IDNO.8所示，所述上游检测探针如SEQ ID NO.9所示，所述野生型-T碱基下游检测探针如SEQID NO.10所示，所述突变型-G碱基下游检测探针如SEQ ID NO.11所示，所述通用荧光信号报告探针1如SEQ ID NO.12所示，所述通用荧光信号报告探针2如SEQ ID NO.13所示。
9.一种单管检测碱基变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括LAMP扩增引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB、上游检测探针，野生型-T碱基下游检测探针，突变型-G碱基下游检测探针，匹配flap1的FRET-probe1、通用荧光信号报告探针1，通用荧光信号报告探针2，所述F3如SEQ ID NO.3所示，所述B3如 SEQ ID NO.4所示，所述FIP如 SEQ ID NO.5所示，所述BIP如 SEQ ID NO.6所示，所述LF如 SEQ ID NO.7所示，所述LB如如 SEQ ID NO.8所示，所述上游检测探针如SEQ ID NO.9所示，所述野生型-T碱基下游检测探针如SEQ ID NO.10所示，所述突变型-G碱基下游检测探针如SEQ ID NO.11所示，所述通用荧光信号报告探针1如SEQ ID NO.12所示，所述通用荧光信号报告探针2如SEQ ID NO.13所示。
10.根据权利要求9所述的单管检测碱基变异的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、重组FEN1酶、dNTPmix、甜菜碱、KCl、MgSO4、(NH4)2SO4、Tris-HCl， Tween-20。
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