CN111926114B - 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 - Google Patents
一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111926114B CN111926114B CN202010682455.1A CN202010682455A CN111926114B CN 111926114 B CN111926114 B CN 111926114B CN 202010682455 A CN202010682455 A CN 202010682455A CN 111926114 B CN111926114 B CN 111926114B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- parainfluenza virus
- virus type
- detecting
- seq
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 37
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 title claims abstract description 28
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 77
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 30
- 241000726041 Human respirovirus 1 Species 0.000 claims abstract description 28
- 241001559186 Human rubulavirus 4 Species 0.000 claims abstract description 28
- 241000712003 Human respirovirus 3 Species 0.000 claims abstract description 27
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 7
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 14
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 27
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种检测副流感病毒多重real‑time PCR试剂盒、方法和应用,所述试剂盒包括用于检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的试剂,所述试剂包括用于检测上述病毒的探针和特异性扩增相应病毒靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照;所述副流感病毒1型的检测通道为FAM,所述副流感病毒2型的检测通道为VIC,所述副流感病毒3型的检测通道为Texas Red,所述副流感病毒4型的检测通道为Cy5。本发明所述试剂盒可以同时检测上述四种病毒,且在具有高灵敏性和特异性的同时,还简化了操作过程、缩短了检测时间、提高了检测通量、降低了检测成本,并且能够在多种荧光定量PCR仪普遍适用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种检测副流感病毒多重real-timePCR试剂盒、方法和应用。
背景技术
目前临床对呼吸道病原体的诊断主要依赖传统的分离培养法,培养法虽然是临床病原诊断的金标准,但是仍存在一定的局限性,包括:(1)大量病原体培养难度高或无法进行体外培养:如病毒、厌氧菌、苛养菌等;(2)阳性率低,假阴性率高(经常高达50%以上);(3)检测耗时长:常规检测需要1-4天,某些慢生长型病原体需要3-4周才能获得培养结果;(4)操作繁琐:对操作者要求高,结果重复性不佳。
除了传统的分离培养法,目前市场上针对呼吸道病原体的检测方案多以核酸检测为目的,这些检测方案依赖不同的技术原理。例如:(1)梅里埃的FilmArray RP panel,通过巢式PCR扩增样本的核酸,产物进行溶解曲线分析,根据不同产物的溶解峰(Tm值)不同从而鉴定病原;(2)海尔施的多重检测试剂盒,先对样本核酸进行多重PCR扩增,然后扩增产物通过毛细管电泳分析,根据产物片段的大小鉴别不同的病原体;(3)博奥的核酸检测试剂盒以环介导等温扩增+芯片检测技术为基础,可以快速检测6种呼吸道常见病毒。但是梅里埃的FilmArray RP panel虽然操作简单、快速且高度自动化,不过必须借助FilmArray自动化分析平台才能实施,使用范围受限。海尔施的多重检测试剂盒虽然可以实现一管反应多重检测,但除依赖PCR仪之外还需要专门的毛细管电泳仪才能对产物进行分析,不仅毛细管电泳分析过程会延长检测周期,并且扩增产物开盖还容易引起实验室气溶胶污染。博奥的核酸检测试剂盒测范围较窄,并且必须借助配套的恒温扩增微流控核酸分析仪才能实施,此外检测通量受仪器限制。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明旨在开发一种能够鉴定数种副流感病毒的多重检测试剂盒,力求在保证高灵敏性和特异性的同时,尽量简化做种病毒检测的操作过程、缩短检测时间、提高检测通量、降低检测成本,并且能够在多种荧光定量PCR仪普遍适用。
本方案以Real-time PCR(Taqman探针)技术为原理,针对每一种检测靶标分别设计一对特异性引物和一条Taqman探针,Taqman探针为一段与靶序列互补并且高度特异的寡核苷酸序列,其5’端标记一个荧光报告基团,3’端标记一个荧光淬灭基团,在PCR扩增过程中,当探针完整时,由于淬灭基团靠近报告基团,报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收,不发出荧光信号;当引物延伸时,与模板结合的荧光探针被Taq酶(5’→3’外切酶活性)切断,报告基团与淬灭基团分离,产生荧光信号。在多重qPCR中,每一个靶标都被一套不同的引物扩增,且每一个靶标的特异性探针分别标记不同光谱范围的荧光基团,荧光定量PCR仪可根据检测到的荧光信号自动绘制出实时扩增曲线,最终通过检测到的荧光信号来判定不同的扩增产物。
本发明采用的技术方案为:
一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒,包括用于检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的试剂。
进一步地,所述试剂包括用于检测副流感病毒1型的探针和特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒2型的探针和特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒3型的探针和特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒4型的探针和特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对。
进一步地,所述检测副流感病毒1型的探针的核苷酸FluA-P序列如SEQ ID NO:1所示,所述特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对FluA-F和FluA-R序列分别如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示;
所述检测副流感病毒2型的探针的核苷酸FluB-P序列如SEQ ID NO:4所示,所述特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对FluB-F和FluB-R序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示;
所述检测副流感病毒3型的探针的核苷酸HRV-P序列如SEQ ID NO:7所示,所述特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对HRV-F和HRV-R序列如SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示;
所述检测副流感病毒4型的探针的核苷酸HMPV-P序列如SEQ ID NO:10所示,所述特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对HMPV-F和HMPV-R序列如SEQ ID NO:11和SEQID NO:12所示;
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:12基因序列如下所示:
。
进一步地,所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照。
进一步地,所述反应缓冲液包含MgCl2、dNTPs Mixture,所述酶混合物包含AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶,所述阳性对照为含目的基因的质粒混合物,所述阴性对照为无核酸酶水(Nuclease-free Water)。
进一步地,所述反应缓冲液中MgCl2的工作浓度为2-4mM,dNTPs Mixture的工作浓度各为350-450μM,所述酶混合物中AMV逆转录酶的工作浓度为4-6U/μL,RNA酶抑制剂的工作浓度为35-45U/μL,Taq DNA聚合酶的工作浓度为4-6U/μL。
进一步地,所述阳性对照含目的基因的质粒混合物的制备方法包括:
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成4个重组质粒,每个重组质粒分别包含1个扩增子序列,载体选择PUC57,质粒进行浓度定量后,根据下列换算公式转换成拷贝数浓度:
copies/μL=(6.02x 10^23)x(ng/μLx 10^-9)/(DNAlengthx 660)
将各病原重组质粒进行等量混合,使用无菌、无核酸酶的双蒸水稀释,使得4种重组质粒的终浓度均为1000拷贝。
进一步地,所述副流感病毒1型的检测通道为FAM,所述副流感病毒2型的检测通道为VIC,所述副流感病毒3型的检测通道为Texas Red,所述副流感病毒4型的检测通道为Cy5。
本试剂盒不包含核酸提取试剂,采集的临床样本需要经过病毒核酸提取纯化后才能用于检测。
一种同时检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的方法,包括以下步骤:
将采集到的临床样本进行微生物核酸提取并纯化,得到待测样品;采用所述检测流感病毒多重real-time PCR试剂盒对待测样品进行检测,得到检测数据;以及对检测数据进行读取,得到检测结果。
进一步地,所述临床样本包括人体的鼻咽拭子、痰液、支气管灌洗液和肺泡灌洗液中的任一种。
进一步地,所述试剂盒包括用于检测副流感病毒1型的探针和特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒2型的探针和特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒3型的探针和特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒4型的探针和特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照。
进一步地,采用所述试剂盒,利用real-time PCR方法对临床样本中副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型进行同时检测,得到检测数据的步骤包括:
将采集到的临床样本进行微生物核酸提取并纯化,得到待测样品;将待测样品、阳性对照或阴性对照分别与等量的用于检测副流感病毒1型的探针和特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒2型的探针和特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒3型的探针和特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒4型的探针和特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对混合,分别得到待测样品混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物;利用real-time PCR方法对所述待测样品混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物进行检测,得到检测数据;
优选的,所述待测样品的最低检测限为10拷贝/反应;
优选的,所述特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对、特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对、特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对和特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物的工作浓度均为0.1-1.0μM,更优选的为0.2μM;
优选的,用于检测副流感病毒1型的探针、用于检测副流感病毒2型的探针、用于检测副流感病毒3型的探针和用于检测副流感病毒4型的探针的工作浓度均为50-250nM,更优选的为100nM。
进一步地,所述real-time PCR的方法依次包括逆转录、预变性、变性并延伸三个步骤,所述逆转录步骤中的逆转录温度为45-55℃,逆转录时间为10-20min,循环数为1个;所述预变性步骤中的预变性温度为93-97℃,预变性时间为25-35s,循环数为1个;所述变性并延伸的循环数为42-48个,其中所述变性步骤中温度为92-98℃,所述变性时间为8-12s,所述延伸的温度为55-61℃,所述延伸的时间为30-40s。
所述的试剂盒在real-time PCR法检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型中的应用。
所述应用为非诊断目的的应用。
本发明所述技术方案的有益效果:
本发明所述试剂盒包括用于检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的试剂,所述试剂包括用于检测上述病毒的探针和特异性扩增相应病毒靶标基因的引物对、反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照;所述副流感病毒1型的检测通道为FAM,所述副流感病毒2型的检测通道为VIC,所述副流感病毒3型的检测通道为Texas Red,所述副流感病毒4型的检测通道为Cy5。本发明通过各个通道检测到的荧光信号来判断不同的扩增产物,且在具有高灵敏性和特异性的同时,还简化了操作过程、缩短了检测时间、提高了检测通量、降低了检测成本,具有检测范围广、快速简便、通量高且对多个品牌/型号的荧光定量PCR仪均适用的优点。
本发明的具体优点说明:(1)在检测范围上包括数种副流感病毒分型,检测范围更加广泛;(2)采用多重real-time PCR技术,不同于产物终端分析,可以根据扩增曲线实时观测扩增过程,整个检测过程在1.5小时内即可完成,简单快速;(3)使用Taqman探针,可以确保检测的高特异性;(4)产物无需开盖进行额外的分析,可以尽量减少实验室污染;(5)探针标记采用了市面上绝大多数荧光定量PCR仪都配备的通道,适用于ABI7500、上海宏石SLAN-96P、Roche LightCycler480、Bio-Rad CFX96等所有具备FAM、VIC、Texas Red、Cy5、Cy3通道的荧光定量PCR仪;(6)每管试剂独立包装,可根据不同的临床需求自由组合,不仅灵活度高,并且可以最大程度地提高通量,降低成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1所述试剂盒检测结果扩增曲线图;
图2是本发明实施例1所述试剂盒灵敏度测试结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式,都属于本发明所保护的范围。
以下实施例所述试剂盒中包含的引物和探针序列如下所示:
由生工生物工程(上海)股份有限公司根据下述序列合成各副流感病毒的引物和探针序列,置于-20℃下保存备用。
以下实施例中涉及到的阳性对照即含目的基因的质粒混合物的制备方法包括:
由生工生物工程(上海)股份有限公司合成4个重组质粒,每个重组质粒分别包含1个扩增子序列,载体选择PUC57,质粒进行浓度定量后,根据下列换算公式转换成拷贝数浓度:
copies/μL=(6.02x 10^23)x(ng/μL x 10^-9)/(DNA length x 660)
将各病原重组质粒进行等量混合,使用无菌、无核酸酶的双蒸水稀释,使得4种病原微生物的重组质粒的终浓度均为1000拷贝。
实施例1
本实施例提供一种用于检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的real-time PCR多重检测试剂盒,包含用于检测副流感病毒1型的探针和特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒2型的探针和特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒3型的探针和特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒4型的探针和特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对、MgCl2、dNTPs Mixture、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、含目的基因的质粒混合物和无核酸酶水;
本实施例提供一种使用上述试剂盒检测支气管灌洗液的方法:
1、提取临床样本支气管灌洗液的核酸,纯化后得到待测样本;
2、配制反应体系
将试剂盒中所需组分解冻,颠倒混匀并短暂离心后备用;用无菌、无核酸酶的双蒸水将各病原体对应的引物和探针进行混合,根据所需检测的反应管数(样本数量+2)×1.1,按照下表配制检测反应液,
其中,各病原微生物的引物的终浓度均为0.2μM,探针的终浓度均为100nM,
其中,MgCl2的工作浓度为3mM、dNTPs Mixture的工作浓度为400μM、AMV逆转录酶的工作浓度为5U/μL、RNA酶抑制剂的工作浓度为40U/μL、Taq DNA聚合酶的工作浓度为5U/μL。
3、反应
将配制好的反应体系混匀后,按12μL的量分装到光学平盖PCR反应管中,转移至样本处理室,向各反应管中分别加入8μL待测样本,阳性对照管加入8μL含目的基因的质粒混合物,阴性对照管加入8μL无核酸酶水,终体积为20μL/管,盖紧反应管,瞬时低速离心,转移至检测区;使用ABI7500进行检测,所述副流感病毒1型的检测通道为FAM,所述副流感病毒2型的检测通道为VIC,所述副流感病毒3型的检测通道为Texas Red,所述副流感病毒4型的检测通道为Cy5;将各反应管按顺序放入real-time PCR仪,按照如下反应条件进行扩增反应:
将仪器的荧光内参设置为“None”,然后按照仪器操作规程编辑各反应孔的样本信息并选择相应的检测目标。
4、结果分析(参照仪器使用说明书进行)
应结束后自动保存结果,根据分析后图像调整Baseline的Start值、End值以及Threshold值(一般Start值可以在3~15、End值可设在5~20,在Log图谱窗口设置Threshold的Value值,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击Analysis自动获得分析结果,在“Report”窗口读取检测结果,扩增曲线图如图1所示,在图中可以看出反应体系中四种病原模板同时存在时,多重扩增无干扰,所有信号均可检出;
检验结果判断标准:阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30;阴性对照各个通道检测目标无CT值或CT值>40则视为合格;样本中各个检测目标CT值≤40为阳性,无CT值或CT值>40为阴性;
本实施例副流感病毒1型的CT值≤40,阴性对照、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的检测结果均无CT值,阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30。
实施例2
本实施例与实施例1相同,不同之处在于临床样本、各个病原微生物扩增的引物和探针浓度、扩增反应的体系组份浓度和扩增反应的条件与实施例1不同:本实施例取用的临床样本为痰液,各个病原微生物扩增的引物浓度为0.1μM,探针浓度为50nM;扩增反应的体系中所述反应缓冲液中MgCl2的工作浓度为2mM,dNTPs Mixture的工作浓度各为350μM,所述酶混合物中AMV逆转录酶的工作浓度为4U/μL,RNA酶抑制剂的工作浓度为35U/μL,TaqDNA聚合酶的工作浓度为4U/μL,扩增条件如下表所示:
本实施例副流感病毒2型的CT值≤40,阴性对照、副流感病毒1型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的检测结果均无CT值,阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30。
实施例3
本实施例与实施例1相同,不同之处在于临床样本、各个病原微生物扩增的引物和探针浓度、扩增反应体系中组份浓度和扩增反应的条件与实施例1不同:本实施例取用的临床样本为肺泡灌洗液,各个病原微生物扩增的引物浓度为1.0μM,探针浓度为250nM;所述反应缓冲液中MgCl2的工作浓度为4mM,dNTPs Mixture的工作浓度各为450μM,所述酶混合物中AMV逆转录酶的工作浓度为6U/μL,RNA酶抑制剂的工作浓度为45U/μL,Taq DNA聚合酶的工作浓度为6U/μL;扩增条件如下表所示:
本实施例副流感病毒3型的CT值≤40,阴性对照、副流感病毒1型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的检测结果均无CT值,阳性对照各个通道检测目标的CT值≤30。
实验例
实施例1所述试剂盒灵敏度测试
将阳性对照从高浓度往下分别10倍梯度稀释,制备一系列不同浓度的模板,浓度依次为:10^1拷贝/μL、10^2拷贝/μL、10^3拷贝/μL、10^4拷贝/μL、10^5拷贝/μL、10^6拷贝/μL,按照实施例1所述方法配制反应体系,反应模板为6个梯度浓度的阳性对照,按照相应的反应条件设置反应参数并进行结果分析,具体结果如图2所示,图中线条从左向右对应的模板拷贝数依次为10^6拷贝/μL、10^5拷贝/μL、10^4拷贝/μL、10^3拷贝/μL、10^2拷贝/μL、10^1拷贝/μL,由结果可以得到本方法的检测下限可达到10拷贝/反应。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用
<130> 2010
<141> 2020-07-15
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cgactctttg ccaagatgac atacaag 27
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
ttaaatgacg atagcttcaa catat 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ttttgctagc aatgtttctg c 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
tctatttctg tgatcatcct ctcytca 27
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
caagggaggt attgaaggc 19
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
tctaggaact cttgttgtaa ctg 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaatcaacta atatctcctc ggcc 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aatagagagt tgatggaaag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gtcggtgctg agtatgaatt 20
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
acataggtga cccactagtg tcygcatt 28
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
aagttggtgg gttaaattat cta 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gtggtcgtct catgatattt 20
Claims (4)
1.一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于检测副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型和副流感病毒4型的试剂;所述试剂包括用于检测副流感病毒1型的探针和特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒2型的探针和特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒3型的探针和特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对、用于检测副流感病毒4型的探针和特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对;所述检测副流感病毒1型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,所述特异性扩增副流感病毒1型靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;所述检测副流感病毒2型的探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示,所述特异性扩增副流感病毒2型靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示;所述检测副流感病毒3型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示,所述特异性扩增副流感病毒3型靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示;所述检测副流感病毒4型的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述特异性扩增副流感病毒4型靶标基因的引物对序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶混合物、阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述反应缓冲液包含MgCl2、dNTPsMixture,所述酶混合物包含AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶,所述阳性对照为含目的基因的质粒混合物,所述阴性对照为无核酸酶水。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述副流感病毒1型的检测通道为FAM,所述副流感病毒2型的检测通道为VIC,所述副流感病毒3型的检测通道为Texas Red,所述副流感病毒4型的检测通道为Cy5。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010682455.1A CN111926114B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010682455.1A CN111926114B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111926114A CN111926114A (zh) | 2020-11-13 |
CN111926114B true CN111926114B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=73313474
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010682455.1A Active CN111926114B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111926114B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN116806268A (zh) * | 2021-02-05 | 2023-09-26 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于检测人副流感病毒1-4(hpiv 1-4)的组合物和方法 |
CN113186348B (zh) * | 2021-05-21 | 2024-06-21 | 广东科蓝生物技术有限公司 | 检测常见呼吸道病毒的引物组合及方法 |
CN113278738A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-08-20 | 宁波海尔施基因科技有限公司 | 用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量pcr试剂盒 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004057021A2 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | UNIVERSITé LAVAL | Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses |
CN101748218A (zh) * | 2008-12-12 | 2010-06-23 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | 一种用于检测i型副流感病毒的靶序列及试剂盒 |
RU2010143681A (ru) * | 2010-10-27 | 2012-05-10 | Министерстов промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) (RU) | Способ дифференциальной диагностики респиратоных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления |
CN105441589A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-03-30 | 深圳市生科源技术有限公司 | 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法 |
CN108239676A (zh) * | 2016-12-23 | 2018-07-03 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种副流感病毒一步法荧光分型rt-pcr检测试剂盒 |
CN108676913A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-10-19 | 中华人民共和国无锡出入境检验检疫局 | 一种人副流感病毒核酸免提取基因分型检测试剂盒 |
CN110964853A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-07 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用 |
-
2020
- 2020-07-15 CN CN202010682455.1A patent/CN111926114B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004057021A2 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | UNIVERSITé LAVAL | Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses |
CN101748218A (zh) * | 2008-12-12 | 2010-06-23 | 上海复星医药(集团)股份有限公司 | 一种用于检测i型副流感病毒的靶序列及试剂盒 |
RU2010143681A (ru) * | 2010-10-27 | 2012-05-10 | Министерстов промышленности и торговли Российской Федерации (Минпромторг России) (RU) | Способ дифференциальной диагностики респиратоных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления |
CN105441589A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-03-30 | 深圳市生科源技术有限公司 | 人副流感病毒ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ型四重pcr检测试剂盒及其检测方法 |
CN108239676A (zh) * | 2016-12-23 | 2018-07-03 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种副流感病毒一步法荧光分型rt-pcr检测试剂盒 |
CN108676913A (zh) * | 2018-02-09 | 2018-10-19 | 中华人民共和国无锡出入境检验检疫局 | 一种人副流感病毒核酸免提取基因分型检测试剂盒 |
CN110964853A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-04-07 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 一种基于双扩增技术联合检测呼吸道合胞病毒、副流感病毒及腺病毒的试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Niloofar Neisi 等.Detection of Common Respiratory Viruses in Patients with Acute Respiratory Infections Using Multiplex Real-Time RT-PCR.Jundishapur Journal of Microbiology.2019,第12卷(第11期),第3.3项、表1. * |
陈传德 等.荧光定量RT-PCR技术在副流感病毒检测中的应用研究.中国卫生检验杂志.2010,20(09),2200-2202. * |
陈翊 等.人副流感病毒广州分离株ZYMgz01全基因组序列测定及分析.热带医学杂志.2011,11(08),第879-882页. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111926114A (zh) | 2020-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111926114B (zh) | 一种检测副流感病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
CN109576352B (zh) | 单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒 | |
CN111910017A (zh) | 一种检测呼吸道病原体多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
CN110358815B (zh) | 一种同时检测多个靶标核酸的方法及其试剂盒 | |
CN110408725B (zh) | 用于呼吸道病原体多重检测的试剂盒 | |
CN107245531B (zh) | 腹泻病原体多重基因检测体系及其试剂盒和应用 | |
CN112176112A (zh) | 一种禽流感病毒h5,h7,h9亚型三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用 | |
CN113817868A (zh) | 一种用于检测新型冠状病毒及其变异株的引物、探针组合物及试剂盒 | |
CN110273026B (zh) | 呼吸道感染多重检测试剂盒及检测方法 | |
WO2022089550A1 (en) | Novel compositions and methods for coronavirus detection | |
CN111893215A (zh) | 一种检测冠状病毒多重real-time PCR试剂盒、方法和应用 | |
CN110317861B (zh) | 一种检测病原体的试剂盒 | |
CN112538550B (zh) | 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用 | |
CN112322705A (zh) | 一种用于多重核酸检测的恒温扩增荧光rma方法 | |
CN111733291A (zh) | 数字pcr检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒 | |
CN111004862A (zh) | 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用 | |
CN113652505A (zh) | 检测新型冠状病毒及其voc-202012/01突变株的方法和试剂盒 | |
CN107083446B (zh) | 腹泻病原菌多重基因检测体系及其试剂盒和应用 | |
CN105755134B (zh) | 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用 | |
CN110938711A (zh) | 一种检测鸡传染性喉气管炎病毒的实时荧光raa引物和探针、试剂盒及其使用方法 | |
CN116356005B (zh) | 一种检测car-t细胞拷贝数的组合物及其用途 | |
CN111944923B (zh) | 一种检测呼吸道病原体多重荧光pcr试剂盒、方法和应用 | |
CN111893197B (zh) | 一种检测呼吸道常见细菌的多重荧光pcr试剂盒和方法 | |
CN113481326B (zh) | 一种等温核酸扩增反应试剂、等温核酸扩增方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |