CN107475446A

CN107475446A - 一种同时检测多种呼吸道病毒的多重pcr检测方法及其探针组和试剂盒

Info

Publication number: CN107475446A
Application number: CN201710735468.9A
Authority: CN
Inventors: 徐锦; 柳鹏程; 钟华清; 徐梦华; 卢丽娟; 贾然; 李杨霞; 王伟伟
Original assignee: Jiangsu Mole Bioscience Co ltd; Childrens Hospital of Fudan University
Current assignee: Jiangsu Mole Bioscience Co ltd; Childrens Hospital of Fudan University
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-24
Also published as: CN107475446B

Abstract

本发明公开了一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法，包括：设计探针步骤、设计上下游引物序列步骤、多重PCR反应步骤、熔解曲线分析步骤。本方法通过对呼吸道病毒的保守基团序列设计Taqman探针，当Tm相差≤6℃时，采用不同的荧光基团；可以高通量、高准确度地检测多种呼吸道病毒。本发明还提供同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测探针组和相应的试验盒，应用方便，具有较大的市场和应用前景。

Description

一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法及其探针组和试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，尤其涉及一种同时检测多种呼吸道病毒的方法及其探针组和试剂盒。

背景技术

呼吸道感染带来的疾病给全球的卫生系统造成了巨大的疾病负担，是包括中国在内的发展中国家5岁以下儿童死亡的主要原因之一。2013年全球有630万5岁以下死亡儿童，其中93.5万(占14.8％)死于肺炎。除增加死亡率之外，呼吸道感染也是5岁以下儿童患病率增加的主要原因。在经济发达国家，3％至18％的住院患儿是因为下呼吸道感染造成。同时儿童的呼吸道感染也带来了巨大的经济负担，德国的一项多中心研究显示，其平均每年因下呼吸道感染带来的经济负担达2.1亿欧元。2009年美国在肺炎治疗上的费用近10亿美元。在我国苏州地区的一项研究显示，5岁以下严重急性呼吸道感染住院的患儿的费用在1082元至63439元之间，住院费用的中位数为4382元，造成较重的经济负担。

多种病原体可以引起呼吸道感染，如病毒、细菌以及非典型病原体等。其中病毒在儿童，特别是年幼儿童的呼吸道感染中占据主要的地位。引起呼吸道感染的病毒种类繁多，常见的呼吸道病毒包括有呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)、甲型流感病毒(Influenza virus A，FLUA)、乙型流感病毒(Influenza virus B，FLUB)、副流感病毒1型(Parainfluenza virus type 1，PIV1)、副流感病毒2型(Parainfluenza virus type2，PIV2)、副流感病毒3型(Parainfluenza virus type 3，PIV3)、腺病毒(Adenovirus，ADV)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43，HCoV-OC43)、人冠状病毒229E(Humancoronavirus 229E，HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63，HCoV-NL63)鼻病毒(Rhinovirus，RV)、肠道病毒(Enterovirus，EV)、偏肺病毒(Humanmetapneumovirus，hMPV)、博卡病毒(Bocavirus，BoV)、麻疹病毒(Measles virus，MV)以及巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)。虽然有些呼吸道病毒与某些特定临床表现具有更强的相关性，但是多数的呼吸道病毒引起的临床症状没有特异性，单从临床表现难以确定。病毒性呼吸道感染也经常造成临床上的无效抗生素使用，因此呼吸道病毒快速准确的实验室诊断对疾病防控及减少治疗费用至关重要，特别是在指导临床抗病毒药物的合理应用，避免抗生素滥用方面具有重要意义。

目前呼吸道病毒的传统实验室诊断方法主要有病毒培养、免疫荧光技术、血清学试验、常规分子生物学方法等，以培养法为金标准，但是由于病毒培养技术复杂、阳性率低，而且所需时间长，一般临床医院无法开展工作。市场上呼吸道感染病原学检测方法主要有直接免疫荧光法(DFA)和快速诊断法(金标试纸条)。这些快速诊断试剂盒绝大多数只能对单一病原体进行检测。面对复杂、众多的病原体种类，检测通量一直是瓶颈问题。直接免疫荧光法(DFA)是目前很多临床实验室主流的呼吸道病毒检测技术。直接免疫荧光法(DFA)是使用荧光标记的抗呼吸道病毒的单克隆抗体对患儿鼻咽分泌物中脱落的上皮细胞进行荧光染色，从而对一些常见的呼吸道病毒进行鉴定。该方法的特异性和灵敏度高，不需要复杂的操作和特殊的仪器，因此可以在临床上的得到较为广泛的应用。但是该方法受限于特异性的单克隆抗体，目前尚不能对博卡病毒、冠状病毒等抗原进行检测。

随着分子生物学技术的发展，国际上已有多种商品化的高通量呼吸道病毒检测技术方案被提出或仍在改进之中，目前已有的方案有基于高分辨率熔解曲线分析的美国Idaho公司的FilmArray呼吸道病毒多重检测系统，基于液相基因芯片系统的GenacoBiomedical Products公司的ResPlex II，基于电喷雾质谱技术的雅培公司的PLEX-ID技术，基于XT-8系统的GenMark Diagnostics,Inc.的Respiratory Virus Panel等。

虽然这些高通量检测方案均相比于单病原体检测体系降低了检测成本，使得在临床应用成为可能，但是国际产品相对于我国经济发展水平的价格仍然显著较高，使这些产品不能在国内尤其在医院系统普及应用。我们亟需要拥有自主产权、成本低廉、适合中国使用呼吸道病毒高通量检测产品。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种同时检测多种呼吸道病毒的方法。

本发明的目的之二在于提供与上述方法相对应的探针组。

本发明的目的之三在于提供与上述方法相对应的试剂盒。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法，包括：

设计探针步骤：根据以下呼吸道病毒的保守基因序列设计Taqman探针，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，且当Tm相差≤6℃时，采用不同的荧光基团；

设计上、下游引物序列步骤：在设计探针步骤得到的探针两端分别设计上、下游引物序列；

多重PCR反应步骤：取上述步骤得到的Taqman探针、上下游引物序列，加检测样本进行多重PCR反应；

熔解曲线分析步骤：多重PCR反应步骤结束后，进行熔解曲线分析步骤。

进一步地，设计探针步骤中，各病毒的Taqman探针序列信息如下所示：

进一步地，设计上、下游引物序列步骤中，各病毒的上下游引物序列如下所示：

进一步地，多重PCR反应步骤中，采用不对称PCR反应，其中，CMV_R、EV_F、ADV_R、MV_R、hCov-229E_F、hCov-OC43_R、hCov-NL63_R和BoV_R为过量引物。

进一步地，多重PCR反应步骤中，多重PCR反应体系为25μL反应体系，包括：2.5μLmTaq PCR Buffer 10×、2.0μL浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为5U/μL的mTaq DNA聚合酶、2.0μL模板，0.5μL浓度为10μM的各病毒的Taqman探针，最终浓度为0.8-1μM的各病毒的过量引物以及与其对应的上或下游引物，其中与其对应的上或下游引物的最终浓度是过量引物的浓度的十分之一。

进一步地，多重PCR反应步骤中，多重PCR反应体系为25μL反应体系，包括：

2.5μL mTaq PCR Buffer 10×、2.0μL浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为5U/μL的mTaq DNA聚合酶、2.0μL模板、以下的Taqman探针和上下游引物；

以及补足至25μL的水。

进一步地，多重PCR反应步骤中，PCR扩增程序如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，进行50个循环，55℃退火阶段同时采集FAM、HEX、ROX、CY5四个通道的荧光信号；

产物熔解曲线分析步骤程序设置为：35℃5min；逐步升温至85℃，在此过程中每上升1℃采集荧光信号10次。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测的探针组，包括以下探针：

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：

一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测的试剂盒，包括以下探针：

和以下上、下游引物：

进一步地，上述试剂盒还包括mTaq DNA聚合酶。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法，基于探针熔解曲线原理设计不同的Tm值的Taqman探针，再在Taqman探针上接不同的荧光基团，高准确性地检测多种呼吸道病毒，操作方便、干扰性小、特异性高；

(2)本发明提供的方法具有成本低、通量高、耗时短的特点，其成本与普通的实时荧光PCR相当，而检测通量得到了成倍的增加，因此本发明具有很强的市场竞争力。

(3)本发明提供的探针的抗干扰性强、对荧光通道的利用率高；

(4)本发明提供的试剂盒可适应性广，对操作者的技术高求性低，可用于家庭、学校等，应用情景广阔。

附图说明

图1为本实施例2的多重PCR在FAM通道中各呼吸病毒阳性的熔解曲线；

图2为本实施例2的多重PCR在HEX通道中各呼吸病毒阳性的熔解曲线；

图3为本实施例2的多重PCR在ROX通道中各呼吸病毒阳性的熔解曲线；

图4为本实施例2的多重PCR在CY5通道中各呼吸病毒阳性的熔解曲线；

图1-图4中，曲线1～9分别为CMV、EV、MV、ADV、229E、OC43、NL63、BoV以及8种病毒同时阳性的反应孔；

图5为采用缺乏5’-外切酶活性的mTaq DNA聚合酶的PCR体系的扩增曲线；

图6为采用缺乏5’-外切酶活性的mTaq DNA聚合酶的PCR体系的熔解曲线；

图7为采用具有5’-外切酶活性的Taq DNA聚合酶的PCR体系的扩增曲线；

图8为采用具有5’-外切酶活性的Taq DNA聚合酶的PCR体系的熔解曲线；

图9为CMV阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图10为EV阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图11为MV阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图12为ADV阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图13为hCov-229E阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图14为hCov-OC43阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图15为hCov-NL63阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图16为BoV阳性质粒的10倍梯度稀释曲线；

图9-16中，曲线1-6分别为使用10⁵-10⁰copies/μL阳性质粒为模板以及阴性对照反应孔的熔解曲线。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本发明提供一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法，其中多种呼吸道病毒应该理解为CMV、EV、ADV、MV、hCov-229E、hCov-OC43、hCov-NL63、BOV中的至少三种。

本发明提供一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法，包括：

设计探针步骤：根据以下呼吸道病毒的保守基因序列设计Taqman探针，5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，当Tm相差≤6℃时，采用不同的荧光基团；

本步骤中，采用多色Taqman探针，为后期的熔解曲线分析提供了基础；该步骤中的荧光基团类型包括但不限于：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL、Fluor Gold 540、JOE、HEX、CALFlour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL、Fluor Red 610、TEXAS RED、CALFlour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705，淬灭基团包括但不限于DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。

设计探针步骤中，各病毒的Taqman探针序列信息如下所示：

Taqman探针的Tm值如下表所示：

表1各病毒Taqman探针的Tm值

由上表可知，一种荧光基团可适用两种病毒的探针序列，至少保证，连接同一种荧光基团的两个探针的Tm值大于6℃。

设计上、下游引物序列步骤中，各病毒的上下游引物序列如下所示：

多重PCR反应步骤中，采用不对称PCR反应，即同一种病毒的上游引物或下游引物过理10倍及以上。采用不对称PCR，以并确保在PCR扩增结束后产生大量的可以与探针互补的单链用于后续的探针熔解曲线分析。同时使用缺失5’外切酶活性的mTaq DNA聚合酶，防止探针在反应中被水解，确保有足够量的探针用于后续的熔解曲线分析。

如在上述体系中，CMV_R、EV_F、ADV_R、MV_R、hCov-229E_F、hCov-OC43_R、hCov-NL63_R和BoV_R为过量引物。此处的过量应该理解为其摩尔量数为对应的引物的10倍及以上。

多重PCR反应步骤中，多重PCR反应体系为25μL反应体系，包括：2.5μL mTaq PCRBuffer 10×、2.0μL浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为5U/μL的mTaq DNA聚合酶、2.0μL模板，0.5μL浓度为10μM的各病毒的Taqman探针，最终浓度为0.8-1μM的各病毒的过量引物以及与其对应的上或下游引物，其中与其对应的上或下游引物的最终浓度是过量引物的浓度的十分之一。

多重PCR反应步骤中，多重PCR反应体系为25μL反应体系，包括：

以及补足至25μL的水。

多重PCR反应步骤中，PCR扩增程序如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，进行50个循环，55℃退火阶段同时采集FAM、HEX、ROX、CY5四个通道的荧光信号。

实施例1：检测前处理

1)标本前处理

加等体积的生理盐水于鼻咽分泌物中，充分震荡1分钟。吸取上清1ml于1.5ml的EP管中，13000rpm离心10min，弃上清留沉淀。向沉淀中加入200μL生理盐水吹打混匀备用。

2)病毒DNA/RNA抽提

使用磁珠法病毒DNA/RNA核酸提取试剂盒配合核酸抽提仪快速抽取临床呼吸道标本里病毒的DNA/RNA。具体步骤按照说明书进行。

3)逆转录PCR

采用TAKARA公司的PrimeScript^TM逆转录试剂盒对抽取的病毒核酸进行逆转录PCR，具体步骤按说明书进行。

实施例2：多重PCR检测与结果判读

采用罗氏LC480II型荧光定量PCR仪，以实施例1)得到的逆转录PCR为模板，进行多生重PCR反应。扩增程序设置为为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，进行50个循环，55℃退火阶段同时采集FAM、HEX、ROX、CY5四个通道的荧光信号。熔解曲线分析程序设置为：35℃5min；逐步升温至85℃，在此过程中每上升1℃采集荧光信号10次；

以及补足至25μL的水。

结合荧光与熔解温度(Tm)对结果进行判断。图1-4为多重PCR各呼吸道病毒阳性的熔解曲线图，图1-4分别为FAM、HEX、ROX、CY5荧光检测通道的熔解曲线。每张图中的熔解曲线1-9分别为CMV、EV、ADV、MV、hCov-OC43、hCov-229E、hCov-NL63、BoV以及8种呼吸道病毒同时阳性的反应孔的熔解曲线。

图1显示在FAM通道中加入CMV阳性模板的PCR反应孔中形成Tm值为61.4℃的熔解峰，在加入EV阳性模板的PCR反应孔中形成Tm值为69.9℃的熔解峰，在同时加入8种呼吸道病毒阳性模板(ALL)的反应孔中同时出现CMV和EV的双熔解峰；

图2显示在HEX通道中加入MV阳性模板的反应孔中形成Tm值为60.7℃熔解峰，在加入EV阳性模板的PCR反应孔中形成Tm值为72.1℃的熔解峰，在同时加入8种呼吸道病毒阳性模板(ALL)的反应孔中同时出现CMV和EV的双熔解峰；

图3显示在HEX通道中加入hCoV-229E阳性模板的反应孔中形成Tm值为58.0℃熔解峰，在加入hCoV-OC43阳性模板的PCR反应孔中形成Tm值为71.5℃的熔解峰，在同时加入8种呼吸道病毒阳性模板(ALL)的反应孔中同时出现hCoV-OC43和hCoV-229E的双熔解峰；

图4显示在CY5通道中加入hCoV-NL63阳性模板的反应孔中形成Tm值为59.7℃熔解峰，在加入BoV阳性模板的PCR反应孔中出现Tm值为73.1℃的熔解峰，在同时加入8种呼吸道病毒阳性模板(ALL)的反应孔中同时出现hCoV-NL63和BoV的双熔解峰。

实施例3：研究5’外切酶活性对探针熔解曲线的影响

我们以腺病毒检测为例，比较使用有无5’外切酶活性的DNA聚合酶对扩增曲线以及探针熔解曲线分析的影响。具有5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶PCR反应采用北京天根生化科技有限公司生产的SuperReal PreMix(Probe)试剂盒，其反应体系为：25μL的反应体系中包含1×SuperRealPreMix，0.1mM上游引物，1mM下游引物，0.2mM探针，2μL模板，用无菌水补齐至25μL。缺乏5’外切酶活性的DNA聚合酶采用mTaq DNA聚合酶(北京康为世纪股份有限公司)，其反应体系为：25μL反应体系中包含1×mTaq PCR Buffer，0.2mM dNTP，2.5U mTaqDNA Polymerase，0.1mM上游引物，1mM下游引物，0.2mM探针，2μL模板，用无菌水补齐至25μL。加入的模板均为腺病毒的人工合成质粒(103，106，109copies/μL)。

根据说明书，SuperReal PreMix(Probe)试剂盒的PCR反应程序设置为95℃15min；95℃3s，60℃20s，进行50个循环，荧光信号在60℃退火/延伸阶段采集。mTaq DNA聚合酶的PCR扩增反应程序为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，进行50个循环，荧光信号在55℃退火阶段采集。

两者产物的熔解曲线分析程序都设置为：35℃5min；逐步升温至85℃，在此过程中每上升1℃采集荧光信号10次。

结果如图5所示，缺乏5’外切酶活性的mTaq DNA聚合酶实验组的熔解曲线荧光信号明显强于具有5’外切酶活性的Taq DNA聚合酶实验组。Taq DNA聚合酶实验组的熔解曲线的信噪比低，并且随着模板浓度的增加，熔解曲线荧光信号反而明显降低。mTaq DNA聚合酶实验组可以形成良好的具有较高信噪比的熔解峰，并且随着模板浓度的增加，熔解曲线荧光信号增加(图7、图8)。相反，Taq DNA聚合酶实验组扩增曲线的信号相比于mTaq DNA聚合酶实验组较强，并且形态较为典型(S型)(图6、图8)。

本发明主要通过熔解曲线对PCR结果进行判断，故缺乏5’外切酶活性的mTaq DNA聚合酶适合于本研究，而不采用普通的Taq DNA聚合酶。

实施例4：考察多重PCR的敏感性

使用无菌水将8种呼吸道病毒的阳性质粒10倍梯度稀释，配置成10⁵～1copies/μL。对于每种呼吸道病毒，我们在多重PCR反应体系中分别加入其10⁵～1copies/μL六个浓度梯度的阳性质粒以及无菌水作为阴性对照，测得每个呼吸道病毒阳性质粒在矩阵荧光PCR反应体系的最低检出限，反映矩阵荧光PCR的敏感性。结果显示MV的最低检出限为1copies/μL，ADV、hCoV-OC43、BoV的最低检出限为10²copies/μL，CMV、hCoV-NL63、hCoV-229E的最低检出限为10³copies/μL，EV的最低检出限为10⁴copies/μL。其中BoV为双峰，所以需通过两个Tm值对其BoV进行判断，当浓度高时以Tm：73.1℃的熔解峰为主，当浓度低时以Tm：66.5℃的熔解峰为主(图9-16)。其中，7条熔解曲线分别是采用阳性质粒浓度为105～1copies/μL以及阴性对照(NC)的结果。

实施例5：考察多重PCR的特异性

在多重PCR反应体系中分别加入EV、RSV、PIV1、PIV2、PIV3、FLUA、FLUB、hMPV、CMV和ADV等常见呼吸道病毒的毒株或临床阳性标本抽提的核酸或cDNA为模板，观察其在多重PCR反应体系中是否只在相应通道的特定Tm值处形成熔解峰，是否不同病毒之间有交叉反应出现，以此验证矩阵荧光PCR反应体系的特异性。

结果显示多重PCR体系在常见呼吸道病毒之间无交叉反应出现，具有较好的特异性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110> 复旦大学附属儿科医院，江苏默乐生物科技股份有限公司

<120> 一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法及其探针组和试剂盒

<130> 复旦大学附属儿科医院，江苏默乐生物科技股份有限公司

<141> 2017-08-24

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> CMV_P

<400> 1

ctggatgtgg cttttacctc 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> EV-P

<400> 2

acccaaagta gtcggttccg ctgca 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> ADV_P

<400> 3

tgcaccagac ccgggctcag gtactccga 29

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> MV_P

<400> 4

aggatgcaag gcttgtttca 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> hCov-229E-P

<400> 5

aacattccaa tagcctataa gc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> hcov-oc43-p

<400> 6

tccgcctggc acggtactcc ct 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> hcov-nl63-p

<400> 7

cttgttgctg ctgttactt 19

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> BoV-P

<400> 8

aggaacaccc aatcagccac ctatcgtct 29

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> CMV_F

<400> 9

gcaagatctc gcacatc 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> CMV_R

<400> 10

gatgctcttg ggacacag 18

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> EV_F

<400> 11

ccctgaatgc ggctaat 17

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> EV_R

<400> 12

attgtcacca taagcagcc 19

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> ADV_F

<400> 13

gccacggtgg ggtttctaaa ctt 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> ADV_R

<400> 14

gccccagtgg tcttacatgc acatc 25

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> MV_F

<400> 15

tggcatctga actcggtatc ac 22

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> MV_R

<400> 16

tgtcctcagt agtatgcatt gcaa 24

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> hcov-229e_f

<400> 17

ccctttgctt gttgatag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> hCov-229E_R

<400> 18

gccctttcta gttctgaa 18

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> hCov-OC43_F

<400> 19

cgatgaggct attccgacta ggt 23

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> hCov-OC43_R

<400> 20

ccttcctgag ccttcaatat agtaacc 27

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> hCov-NL63_F

<400> 21

cactcgttct gattctaa 18

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> hCov-NL63_R

<400> 22

cttcgactgg ttatcaaa 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> BoV_F

<400> 23

agaggctcgg gctcatatca 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> BoV_R

<400> 24

cacttggtct gaggtcttcg aa 22

Claims

1.一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测方法，包括：

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，设计探针步骤中，各病毒的Taqman探针序列信息如下所示：

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，设计上、下游引物序列步骤中，各病毒的上下游引物序列如下所示：

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，多重PCR反应步骤中，采用不对称PCR反应，其中，CMV_R、EV_F、ADV_R、MV_R、hCov-229E_F、hCov-OC43_R、hCov-NL63_R和BoV_R为过量引物。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，多重PCR反应步骤中，多重PCR反应体系为25μL反应体系，包括：2.5μL mTaq PCR Buffer 10×、2.0μL浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为5U/μL的mTaq DNA聚合酶、2.0μL模板，0.5μL浓度为10μM的各病毒的Taqman探针，最终浓度为0.8-1μM的各病毒的过量引物以及与其对应的上或下游引物，其中与其对应的上或下游引物的最终浓度是过量引物的浓度的十分之一。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，多重PCR反应步骤中，多重PCR反应体系为25μL反应体系，包括：

2.5μL mTaq PCR Buffer 10×、2.0μL浓度为2.5mM的dNTP、0.5μL浓度为5U/μL的mTaqDNA聚合酶、2.0μL模板、以下的Taqman探针和上下游引物；

以及补足至25μL的水。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，多重PCR反应步骤中，PCR扩增程序如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，进行50个循环，55℃退火阶段同时采集FAM、HEX、ROX、CY5四个通道的荧光信号；

8.一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测的探针组，包括以下探针：

9.一种同时检测多种呼吸道病毒的多重PCR检测的试剂盒，包括以下探针：

和以下上、下游引物：

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括mTaq DNA聚合酶。