CN105256048A - 一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重pcr检测方法 - Google Patents

一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测；采用多重PCR检测操作简单、检测周期短，不会出现假阳性，同时还无需开管操作，可重复使用，节约了资源节省了成本，检测灵敏性特异性高。

Description

一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种对于五种口腔常见致病菌牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌多重PCR快速检测方法。
背景技术
人体口腔微生物群是一个极其复杂的生态系统，包括病毒，真菌，原生动物和细菌，其中以细菌数量多的，统计表明，每毫升唾液中约有1亿个细菌，整个口腔中的细菌种类超过600种，目前认为牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌之一，入血后黏附和侵入动脉血管壁所引起的局部炎症反应，被认为是加速心血管疾病（cardiovasculardisease，CVD）动脉粥样硬化发生发展的重要原因之一；幽门螺旋杆菌作为人体口臭的重要原因，该菌与人体的胃炎、消化性溃疡及胃癌等疾病有密切联系；具核梭杆菌是口腔共生菌，但它有潜力致病，有时会引起牙周病，该菌也可能转移到肠道中，且其在肠道中的丰度与诱发性结直肠癌相关。变形链球菌的过度生长容易引发牙髓炎、尖周炎、牙周炎，其患者也可因菌血症而并发脑栓塞或者细菌性心内膜炎，金黄色葡萄球菌是口腔外感染一种主要致病菌，能够引起包括误吸性肺炎、感染性心内膜炎等口腔外感染疾病。
细菌的分离和培养是针对上述五种口腔致病菌最为传统的检测及鉴定方法，这种方法存在明显的缺陷，不仅培养条件和操作复杂，检测周期长，且特异性敏感性都受到很大的限制；随着分子诊断技术的发展，为人们提供多种特异、灵敏和快速的微生物检测方法，例如基于蛋白质水平发展起来酶联免疫吸附剂测定法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）和蛋白质印迹法（WesternBlot，WB），针对特定微生物制备特异抗体，从而实现对微生物的高效灵敏检测，该方法较传统方法有一定的提高，但是存在较高的假阳性率风险，临床效果不佳；随着近年来PCR诊断技术的进步和成熟，PCR应用于微生物定性和定量检测领域越来越受到临床研究的重视，在传统PCR系统中，针对特异靶序列设计的寡核苷酸引物进而扩增特异产物并且结合应用于凝胶鉴定、测序分析，或者与限制性酶切技术或者RAPD技术结合可以对特定微生物进行准确、灵敏的鉴定分析，但该类型PCR不仅操作复杂，而且需要对PCR产物进行开管操作，容易引发污染，造成假阳性现象，而且这些类型PCR仅限于单次反应鉴定单个特异靶序列，并且如果需要实现多种口腔致病菌的检测则需要浪费大量的试剂和时间。
发明内容
为解决上述现有技术操作复杂、检测周期长、特异性灵敏性受限、假阳性出现率高、需开管操作、易引发污染、检测效率低、成本高等问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测，具体包括以下三个步骤：
。1）在需要检测五种口腔致病菌特异靶序列的区域分别设计并制备五条改良的Taqman探针；
2）在每一个设计好的改良Taqman探针外围分别设计一对引物，包括一条上游引物和下游引物，用该对引物对特异靶序列进行单重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应；
3）实时荧光PCR扩增反应后进行熔解曲线分析，根据改良Taqman探针熔点的变化来判断待检测核酸序列是否存在以上五种口腔致病菌及其类型。
作为对本发明的改进，在步骤2）中，所述PCR扩增的单重单色反应体系为单重单色PCR反应缓冲液，所述单重单色PCR反应缓冲液成分如下：
Mgcl21—10mM
dNTP0.05—1.5mM
引物混合物0.05—2μM
探针混合物0.05—2μM
FastTaqPolymerase0.1—5U
模板DNA1—20ul
总体积10-100ul。
作为对本发明的进一步改进，在步骤2）中，所述PCR扩增的多重多色反应体系为多重多色PCR反应缓冲液，所述多重多色PCR反应缓冲液成分如下：
Mgcl21—10mM
dNTP0.05—1.5mM
引物混合物0.05—2μM
FastTaqPolymerase0.1—5U
探针混合物0.05—2μM
模板DNA1—20ul
总体积10-100ul。
作为对本发明的进一步改进，所述引物混合物成分如下：
牙龈卟啉单胞菌的上游引物为5’-gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙龈卟啉单胞菌的下游引物为5’-tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’-ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’-tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’-ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’-ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’-ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’-tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’-gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’-agagccttgctgtgggatta-3’，
所述引物混合物中，每一个引物其5’端均增加一段共同的核酸序列CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，其作用在于提高PCR的灵敏度，特异性，减少引物二聚体的产生(BrownieJ,etal.Nucleicacidsresearch,1997,25(16):3235-3241.)。更为重要的是提高PCR体系的退火温度使其高于寡核苷酸探针Tm值，导致该探针在PCR退火过程探针不易于结合于靶序列，不易被TaqPolymerase切割，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应。
作为对本发明的进一步改进，所述探针混合物成分如下：
牙龈卟啉单胞菌的探针为5’-catcaccacataccacagatg-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’-ctgcaacgtgaccattagcag-3’
具核梭杆菌的探针为5’-aaaatagcatactttacatattcatttt-3’
变形链球菌的探针为5’-ttggaagagcacgtccaa-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’-cactttagaattagtg-3’。
作为对本发明的进一步改进，所述改良Taqman探针是一种在低温状态下会形成颈环结构的荧光探针，长度为16-28个碱基，除环上的序列与靶互补外，其臂上碱基也与靶互补。
作为对本发明的进一步改进，所述改良Taqman探针在5’末端标记荧光基团或淬灭基团，在没有与把序列杂交时，改良Taqman探针自身形成颈环结构，使荧光基团和淬灭基团相互靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在与把序列杂交时，改良Taqman探针颈环结构解离，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收。
作为对本发明的进一步改进，所述荧光基团包括目前各种常用的荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CALGold540，JOE，HEX，CALFluorOrange560，TAMRA，CALFluorRed590，ROX，CALFluorRed610，TEXASRED，CALFluorRed635，Quasar670，CY3，CY5，CY5.5，Quasar705等。
作为对本发明的进一步改进，所述淬灭基团包括目前各种常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、ECLIPE等。
本发明的有益效果在于：（1）寡核苷酸探针熔解曲线分析可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析；（2）寡核苷酸探针熔解曲线分析属于非消耗性的检测，在分析结束后，样本保持PCR后的状态，并且可以多次重复分析；（3）寡核苷酸熔解曲线克服在同一荧光通道仅能对其中一种口腔致病菌分析和检测的限制，根据改良的Taqman探针可以通过熔点的变化可在同一荧光通道来区分多种口腔致病菌特异靶序列；（4）在引物设计上其5端采用一段通用的寡核苷酸序列，其目的在于增加PCR的特异性外，还可以提高PCR体系的退火温度使其高于寡核苷酸探针Tm值，导致该探针在PCR退火过程探针不易于结合于靶序列，不易被TaqPolymerase切割，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应，另一方面采用FastTaqPolymerase，该酶被独特的双链DNA结合蛋白融合修饰，使其具有快速反应的特点使其5’端-3’端外切酶活性变弱，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应。
附图说明
图1为实施例1不同互补的靶序列存在下的改良Taqman探针的熔解曲线。图1a和1b表明改良Taqman探针随着温度变化对应的不同荧光通道变化情况；在图1a中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为荧光强度Fluoresecence采集HEX通道荧光；曲线1加入的为代表具核梭杆菌互补的靶序列，曲线2加入的为代表牙龈卟啉单胞菌互补的靶序列，曲线3加入的为代表幽门螺旋杆菌互补的靶序列，曲线6加没有加入任何靶。在图1b中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为荧光强度Fluoresecence采集FAM通道荧光；曲线4加入的为代表金黄色葡萄球菌互补的靶序列，曲线5加入的为代表变形链球菌互补的靶序列。
图2为实施例1为不同互补的靶序列存在下的经过仪器分析处理后的改良Taqman探针的熔解曲线图。图2a和2b是通过将图1的温度与荧光强度的变化求导并取其负导数(-dF/dT)而得到，直接反应了在不同靶序列存在情况下改良Taqman探针的熔点；在图2中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT在图2a中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为荧光强度Fluoresecence采集HEX通道荧光；曲线1加入的为代表具核梭杆菌互补的靶序列，曲线2加入的为代表牙龈卟啉单胞菌互补的靶序列，曲线3加入的为代表幽门螺旋杆菌互补的靶序列，曲线6没有加入任何靶。在图2b中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为荧光强度Fluoresecence采集FAM通道荧光；曲线4加入的为代表金黄色葡萄球菌互补的靶序列，曲线5加入的为代表变形链球菌互补的靶序列。
图3a和3b为实施例2的熔解曲线检测分析图；在图3a中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集HEX通道荧光；峰1代表具核梭杆菌互补的靶序列熔点，峰2代表牙龈卟啉单胞菌互补的靶序列熔点，峰3代表幽门螺旋杆菌互补的靶序列熔点。在图3b中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集FAM通道荧光；峰4代表金黄色葡萄球菌互补的靶序列熔点，峰5代表变形链球菌互补的靶序列熔点。图3a和3b分别由3个平行管组成。
图4为实施例3的扩增曲线检测分析图；在图4中，横坐标为反应循环数Cycle，纵坐标为荧光强度Fluoresecence，采集HEX通道荧光；曲线1加入的为浓度106copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线2加入的为浓度105copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线3加入的为浓度104copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线4加入的为浓度103copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线5加入的为浓度102copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线6加入的为浓度101copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线7加入的为浓度100copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，曲线8没有加入任何靶。
图5为实施例3的扩增曲线检测分析图；熔解曲线检测分析图；在图5中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集HEX通道荧光；峰1加入的为浓度106copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰2加入的为浓度105copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰3加入的为浓度104copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰4加入的为浓度103copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰5加入为浓度102copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰6加入的为浓度101copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品。峰7加入为浓度100copies的含有具核梭杆菌互补的靶序列质粒标准品，峰8没有加入任何靶。
图6和7为实施例4的熔解曲线检测分析图；在图6中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集FAM通道荧光；图6为金黄色葡萄球菌互补的靶序列熔解曲线检测分析图；峰1为加入FastTaqPolymerase，峰2为加入普通TaqPolymerase。在图7中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT，采集HEX通道荧光；图7为具核梭杆菌互补的靶序列（峰3和峰4）和幽门螺旋杆菌（峰5和峰6）互补的靶序列熔解曲线检测分析图；峰3和峰5为加入FastTaqPolymerase，峰4和峰6为加入普通TaqPolymerase。
具体实施方式
以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的对突变进行检测，这些并不脱离本发明描述的基本概念。
实施例1考察人工合成不同的互补靶序列考察改良Taqman探针熔解曲线法分别检测五种口腔致病菌：牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的能力；
本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针，人以上五种口腔致病菌的靶序列，改良Taqman探针熔解曲线法检测五种口腔致病菌。所用的改良Taqman探针和靶的序列为：
牙龈卟啉单胞菌的探针为5’-HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’-HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2-3’
具核梭杆菌的探针为5’-HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2-3’
变形链球菌的探针为5’-FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’-FAM-cactttagaattagtg-BHQ2-3’
牙龈卟啉单胞菌互补靶的序列为5’-Catctgtggtatgtggtgatg-3’
幽门螺旋杆菌互补靶的序列为5’-Ctgctaatggtcacgttgcag-3’
具核梭杆菌互补靶的序列为5’-Aaaatgaatatgtaaagtatgctatttt-3’
变形链球菌互补靶的序列为5’-ttggaagagcacgtccaa-3’
金黄色葡萄球菌互补靶的序列为5’-Cactaattctaaagtg-3’
所用的靶序列和探针都在上海生工生物工程有限公司合成。
20μL反应液中含10×PCRbuffer2μL(含1.5mMMg2+)，10pmolprobemix，不加靶序列或者加入10pmol上述靶序列中的一种。对上述混合液进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM和HEX荧光信号。该实验在Rotor-geneQ实时PCR仪上进行。
结果见图1a,b和2a,b可以观察到，在没有靶序列存在时，改良Taqman探针低温时，自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发出荧光，随着温度的升高，改良分子信标的茎环结构逐渐解链而使荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光。在有靶序列存在的情况下，改良Taqman探针低温时与互补的靶序列形成刚性且稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降。对不同的靶序列，形成稳定性不同的双链杂合体，具有各自不同的熔点。不同的改良Taqman探针与不同的靶序列，在不同荧光通道形成各种独特的熔点。根据熔点的不同就很容易判断到底是加入的是哪种靶。因此，Taqman探针熔解曲线法可以用于五种口腔致病菌的检测。
实施例2考察多重PCR后人工合成改良Taqman探针熔解曲线法在同时检测五种口腔致病菌(牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌)的能力。
本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针和扩增引物，采用针对以上五种口腔致病菌全基因组DNA，考察改良Taqman探针熔解曲线法同时检测五种口腔致病菌的能力。所用的改良Taqman探针为：
牙龈卟啉单胞菌的探针为5’-HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’-HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2-3’
具核梭杆菌的探针为5’-HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2-3’
变形链球菌的探针为5’-FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’-FAM-cactttagaattagtg-BHQ2-3’
所用的引物为：
牙龈卟啉单胞菌的上游引物为5’-gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙龈卟啉单胞菌的下游引物为5’-tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’-ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’-tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’-ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’-ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’-ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’-tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’-gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’-agagccttgctgtgggatta-3’
所有引物在设计过程中，其5’端均人为添加一段共同的寡核苷酸填充序列“CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC”。
所用的探针和引物都在上海生工生物工程有限公司合成。
采用五种口腔致病菌全基因组DNA为：
牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌全基因组DNA由厦门基科实验室保存。
20μL反应液中含10XPCRbuffer2μL(含1.5mMMg2+)，2.0mMMgCl2，10mMdNTP,10pmolprobemix，10pmol引物mix，10ng五种口腔致病菌混合DNA，5UFastTaqPolymerase。对该反应体系重复3次。对上述混合液进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5sec，60℃保温3sec，72℃保温10sec，45循环；在反应后混合物进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM和HEX荧光信号。该实验在Rotor-geneQ实时PCR仪上进行。
结果见图3a和3b，可以观察到，在五种靶序列同时存在的情况下，设计的5对引物能够在混合DNA中PCR扩增出其所覆盖的靶序列区域。在PCR完成后，利用改良Taqman探针针对这些不同靶序列，分别形成稳定性不同的双链杂合体，不同靶序列在荧光通道和熔点均为独特的存在。在统一管内采集的熔解曲线中，其在FAM通道中，形成峰4和峰5两个独特的熔点，其在HEX通道中，形成峰1、峰2和峰3三个独特的熔点。对该反应体系重复3次结果表明，该体系均能稳定的同时检测出以上5个独特的熔点峰。因此，采用多重PCR扩增后进行Taqman探针熔解曲线法可以用于五种口腔致病菌同时检测。
实施例3考察人工合成改良Taqman探针熔解曲线法在多重PCR后检测不同浓度具核梭杆菌质粒标准品的灵敏度。
本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针和扩增引物，人工合成具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品，考察改良Taqman探针熔解曲线检测具核梭杆菌互补靶序列的检测灵敏度。
所用的改良Taqman探针为：
牙龈卟啉单胞菌的探针为5’-HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’-HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2-3’
具核梭杆菌的探针为5’-HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2-3’
变形链球菌的探针为5’-FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’-FAM-cactttagaattagtg-BHQ2-3’
所用的引物为：
牙龈卟啉单胞菌的上游引物为5’-gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙龈卟啉单胞菌的下游引物为5’-tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’-ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’-tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’-ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’-ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’-ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’-tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’-gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’-agagccttgctgtgggatta-3’
所有引物在设计过程中，其5’端均人为添加一段共同的寡核苷酸填充序列“CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC”。
所用的探针和引物都在上海生工生物工程有限公司合成。
人工设计具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品序列为：
“CCAGCTGGCATTCCCTTTaaaatagcatactttacatattcattttgtttttgtgatataactgaattttttaaaattctagcataataaatccattcaactgcaacaacagaaattatcatattacttattcctgcacctaacattccaactaataccatagctagtaaaaaacttggaaatgttgagaatatcatagtcaaccaatcaaaaaaactttcttctttccCTTGCCTCCAACCGATAAAA”
所用的探针、引物和具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品都在上海生工生物工程有限公司合成。
20μL反应液中含10XPCRbuffer2μL(含1.5mMMg2+)，2.5mMMgCl2，15mMdNTP,10pmolprobemix，13pmol引物mix，106copies-100copies具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品，5UFastTaqPolymerase。对上述混合液进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5sec，60℃保温3sec，72℃保温10sec，45循环；在反应后混合物进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集HEX荧光信号。该实验在Rotor-geneQ实时PCR仪上进行。
结果见图4和5可以观察到，图4的实时PCR扩增曲线表明，在具核梭杆菌互补靶序列的106copies-101copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针都能给出较好的信号，在具核梭杆菌互补靶序列的100copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针无法检测出荧光信号。在靶序列不存在的情况下，改良Taqman探针无法检测出荧光信号。而图4的熔解曲线分析表明，在具核梭杆菌互补靶序列的106copies-101copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针能够在HEX通道形成独特一致的熔点。在具核梭杆菌互补靶序列的100copies质粒标准品存在的情况下，改良Taqman探针无法形成熔点。在靶序列不存在的情况下，改良Taqman探针无法形成熔点。因此，采用多重PCR扩增后进行Taqman探针熔解曲线法检测具核梭杆菌互补靶序列的质粒标准品的灵敏度可达101copies。
实施例4考察人工合成改良Taqman探针熔解曲线法在采用不同的TaqPolymerase下含有以上三种口腔致病菌（具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌和金黄色葡萄球菌）检测临床口腔样本的能力。
本实施例设计了针对以上五种口腔致病菌的改良Taqman探针和扩增引物，采用含有以上三种口腔致病菌临床口腔样本，考察改良Taqman探针熔解曲线和不同TaqPolymerase对口腔致病菌临床口腔样本检测的能力
所用的改良Taqman探针为：
牙龈卟啉单胞菌的探针为5’-HEX-catcaccacataccacagatg-BHQ2-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’-HEX-ctgcaacgtgaccattagcag-BHQ2-3’
具核梭杆菌的探针为5’-HEX-aaaatagcatactttacatattcatttt-BHQ2-3’
变形链球菌的探针为5’-FAM-ttggaagagcacgtccaa-BHQ2-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’-FAM-cactttagaattagtg-BHQ2-3’
所用的引物为：
牙龈卟啉单胞菌的上游引物为5’-gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙龈卟啉单胞菌的下游引物为5’-tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’-ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’-tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’-ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’-ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’-ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’-tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’-gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’-agagccttgctgtgggatta-3’
所有引物在设计过程中，其5’端均人为添加一段共同的寡核苷酸填充序列“CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC”。
所用的探针、引物都在上海生工生物工程有限公司合成。
含有以上三种口腔致病菌临床口腔样本由口腔医院提供。
20μL反应液中含10XPCRbuffer2μL(含1.5mMMg2+)，1.8mMMgCl2，7mMdNTP,10pmolprobemix，10pmol引物mix，含有以上三种口腔致病菌临床口腔样本，对上述混合液分别加入FastTaqPolymerase和普通TaqPolymerase后进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性5sec，60℃保温3sec，72℃保温10sec，45循环；在反应后混合物进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集HEX和FAM荧光信号。该实验在Rotor-geneQ实时PCR仪上进行。
结果见图6和7，可以观察到，在有普通TaqPolymerase或者FastTaqPolymerase反应液中，改良Taqman探针能够在FAM和HEX通道与对应的三种口腔致病菌（具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌和金黄色葡萄球菌）形成独特一致的熔点。特别是在有FastTaqPolymerase反应液中，改良Taqman探针能够在FAM和HEX通道与对应的三种口腔致病菌（具核梭杆菌、幽门螺旋杆菌和金黄色葡萄球菌）形成独特一致的熔点并且熔点信号显著高于有普通TaqPolymerase的反应液，因此，采用FastTaqPolymerase进行多重PCR扩增后进行Taqman探针熔解曲线法检测临床口腔样本具有较好的检测效果。

Claims (9)

1.一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：采用多重PCR同时扩增口腔致病菌中的牙龈卟啉单胞菌、幽门螺旋杆菌、具核梭杆菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌的特异靶序列，再通过改良Taqman探针熔解曲线分析鉴定，实现对于五种口腔常见致病菌多重检测，具体包括以下三个步骤：
1）在需要检测五种口腔致病菌特异靶序列的区域分别设计并制备五条改良的Taqman探针；
2）在每一个设计好的改良Taqman探针外围分别设计一对引物，包括一条上游引物和下游引物，用该对引物对特异靶序列进行单重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应；
3）实时荧光PCR扩增反应后进行熔解曲线分析，根据改良Taqman探针熔点的变化来判断待检测核酸序列是否存在以上五种口腔致病菌及其类型。
2.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：在步骤2）中，所述PCR扩增的单重单色反应体系为单重单色PCR反应缓冲液，所述单重单色PCR反应缓冲液成分如下：
Mgcl21—10mM
dNTP0.05—1.5mM
引物混合物0.05—2μM
探针混合物0.05—2μM
FastTaqPolymerase0.1—5U
模板DNA1—20ul
总体积10-100ul。
3.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：在步骤2）中，所述PCR扩增的多重多色反应体系为多重多色PCR反应缓冲液，所述多重多色PCR反应缓冲液成分如下：
Mgcl21—10mM
dNTP0.05—1.5mM
引物混合物0.05—2μM
FastTaqPolymerase0.1—5U
探针混合物0.05—2μM
模板DNA1—20ul
总体积10-100ul。
4.根据权利要求2或3所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：所述引物混合物成分如下：
牙龈卟啉单胞菌的上游引物为5’-gtcgtttacgagcagccttc-3’
牙龈卟啉单胞菌的下游引物为5’-tttggcttccgttctattgg-3’
幽门螺旋杆菌的上游引物为5’-ggaaaccgattgccttcata-3’
幽门螺旋杆菌的下游引物为5’-tgatgaacagcaccagaagc-3’
具核梭杆菌的上游引物为5’-ccagctggcattcccttt-3’
具核梭杆菌的下游引物为5’-ttttatcggttggaggcaag-3’
变形链球菌的上游引物为5’-ctaaggattccaggggaagg-3’
变形链球菌的下游引物为5’-tggtggcacagaactaagca-3’
金黄色葡萄球菌的上游引物为5’-gctcacatgcctgtggacta-3’
金黄色葡萄球菌的下游引物为5’-agagccttgctgtgggatta-3’，
所述引物混合物中，每一个引物其5’端均增加一段共同的核酸序列CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC，其作用在于提高PCR的灵敏度，特异性，减少引物二聚体的产生(BrownieJ,etal.Nucleicacidsresearch,1997,25(16):3235-3241.)，更为重要的是提高PCR体系的退火温度使其高于寡核苷酸探针Tm值，导致该探针在PCR退火过程探针不易于结合于靶序列，不易被TaqPolymerase切割，保证期在熔解曲线分析中具有足量探针参与反应。
5.根据权利要求2或3所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：所述探针混合物成分如下：
牙龈卟啉单胞菌的探针为5’-catcaccacataccacagatg-3’
幽门螺旋杆菌的探针为5’-ctgcaacgtgaccattagcag-3’
具核梭杆菌的探针为5’-aaaatagcatactttacatattcatttt-3’
变形链球菌的探针为5’-ttggaagagcacgtccaa-3’
金黄色葡萄球菌的探针为5’-cactttagaattagtg-3’。
6.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：所述改良Taqman探针是一种在低温状态下会形成颈环结构的荧光探针，长度为16-28个碱基，除环上的序列与靶互补外，其臂上碱基也与靶互补。
7.根据权利要求1所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：所述改良Taqman探针在5’末端标记荧光基团或淬灭基团，在没有与把序列杂交时，改良Taqman探针自身形成颈环结构，使荧光基团和淬灭基团相互靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在与把序列杂交时，改良Taqman探针颈环结构解离，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收。
8.根据权利要求7所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：所述荧光基团包括目前各种常用的荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CALGold540，JOE，HEX，CALFluorOrange560，TAMRA，CALFluorRed590，ROX，CALFluorRed610，TEXASRED，CALFluorRed635，Quasar670，CY3，CY5，CY5.5，Quasar705等。
9.根据权利要求7所述的一种基于熔解曲线分析的口腔致病菌多重PCR检测方法，其特征在于：所述淬灭基团包括目前各种常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、ECLIPE等。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591488A (zh) * 2017-02-23 2017-04-26 武汉艾米森生命科技有限公司 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒
CN107475446A (zh) * 2017-08-24 2017-12-15 复旦大学附属儿科医院 一种同时检测多种呼吸道病毒的多重pcr检测方法及其探针组和试剂盒
CN108103149A (zh) * 2018-03-02 2018-06-01 四川知几未来健康管理有限公司 一种具核梭杆菌的检测核酸组合、试剂盒、芯片及其应用
CN109943662A (zh) * 2019-05-07 2019-06-28 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用
CN110982915A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 山东大学齐鲁医院 一种检测唾液中具核梭杆菌的引物探针组、试剂盒和检测方法
WO2020124472A1 (zh) * 2018-12-20 2020-06-25 深圳华大智造科技有限公司 Pcr引物及pcr扩增方法和用途
CN114606298A (zh) * 2020-12-08 2022-06-10 厦门致善生物科技股份有限公司 一种检测样品中一种或多种核酸分子扩增产物长度的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270381A (zh) * 2008-05-14 2008-09-24 肖水清 一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
CN104651487A (zh) * 2014-11-05 2015-05-27 蔡先全 检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光pcr检测方法
EP3056567B1 (en) * 2013-10-07 2019-04-10 Mitsui Chemicals, Inc. Pcr primer set for bacterial dna amplification, kit for detecting and/or identifying bacterial species, and method for detecting and/or identifying bacterial species

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270381A (zh) * 2008-05-14 2008-09-24 肖水清 一种口腔致病菌的多重pcr快速检测方法
EP3056567B1 (en) * 2013-10-07 2019-04-10 Mitsui Chemicals, Inc. Pcr primer set for bacterial dna amplification, kit for detecting and/or identifying bacterial species, and method for detecting and/or identifying bacterial species
CN104651487A (zh) * 2014-11-05 2015-05-27 蔡先全 检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光pcr检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JANNINE BROWNIE: "The elimination of primer-dimer accumulation in PCR", 《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》 *
刘晓华等: "正畸治疗患者口腔中四种细菌的多重PCR检测", 《中国实验诊断学》 *
陈清凉: "探针熔解曲线技术在食源性致病菌检测分型中的应用", 《全国优秀硕士学文论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106591488A (zh) * 2017-02-23 2017-04-26 武汉艾米森生命科技有限公司 一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒
CN107475446A (zh) * 2017-08-24 2017-12-15 复旦大学附属儿科医院 一种同时检测多种呼吸道病毒的多重pcr检测方法及其探针组和试剂盒
CN107475446B (zh) * 2017-08-24 2020-12-11 复旦大学附属儿科医院 一种同时检测多种呼吸道病毒的多重pcr检测方法及其探针组和试剂盒
CN108103149A (zh) * 2018-03-02 2018-06-01 四川知几未来健康管理有限公司 一种具核梭杆菌的检测核酸组合、试剂盒、芯片及其应用
WO2020124472A1 (zh) * 2018-12-20 2020-06-25 深圳华大智造科技有限公司 Pcr引物及pcr扩增方法和用途
CN113166801A (zh) * 2018-12-20 2021-07-23 深圳华大智造科技股份有限公司 Pcr引物及pcr扩增方法和用途
CN109943662A (zh) * 2019-05-07 2019-06-28 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用
WO2020224195A1 (zh) * 2019-05-07 2020-11-12 丹娜（天津）生物科技有限公司 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用
CN110982915A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 山东大学齐鲁医院 一种检测唾液中具核梭杆菌的引物探针组、试剂盒和检测方法
CN114606298A (zh) * 2020-12-08 2022-06-10 厦门致善生物科技股份有限公司 一种检测样品中一种或多种核酸分子扩增产物长度的方法

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