CN111690776A

CN111690776A - 常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、试剂、方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111690776A
Application number: CN202010622387.XA
Authority: CN
Inventors: 刘国宪; 刘琼瑶; 娄志英; 宋文凤; 曹伟
Original assignee: Weifang Anpu Future Biotechnology Co ltd
Current assignee: Weifang Anpu Future Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2020-09-22

Abstract

本发明适用于新型冠状病毒SARS‑CoV‑2检测技术领域，提供了一种常温等温快速检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物和探针。本发明还提供一种包括上述引物和探针的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的试剂、方法及试剂盒。本发明可以在常温等温条件下，对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2进行快速、实时、特异性检测。通过特异性引物、特异性探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，再利用核酸胶体金试纸条实现目标物的快速检测。本发明不需要借助任何的大型仪器设备，检测时间短，操作便捷，准确率高，结果判读也相对简易与直观，特别适用于现场检测。

Description

常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、试剂、方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒SARS-CoV-2检测技术领域，尤其涉及一种常温等温快速检测新型冠状病毒的引物、探针、试剂、方法及试剂盒。

背景技术

冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA 病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。

冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；包膜蛋白(E，Envelope Protein)；膜糖蛋白(M， Membrane Protein)。少数种类还有血凝素糖蛋白(HE蛋白，Haemaglutinin－ esterase)。冠状病毒的核酸为非节段单链(+)RNA，长27-31kb，是RNA病毒中最长的RNA核酸链，具有正链RNA特有的重要结构特征：即RNA链5’端有甲基化“帽子”，3’端有PolyA“尾巴”结构。这一结构与真核mRNA非常相似，也是其基因组RNA自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了RNA －DNA－RNA的转录过程。冠状病毒的RNA和RNA之间重组率非常高。

冠状病毒成熟粒子中，并不存在RNA病毒复制所需的RNA聚合酶，它进入宿主细胞后，直接以病毒基因组RNA为翻译模板，表达出病毒RNA聚合酶。再利用这个酶完成负链亚基因组RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成，以及病毒基因组RNA的复制。冠状病毒各个结构蛋白成熟的mRNA合成，不存在转录后的修饰剪切过程，而是直接通过RNA聚合酶和一些转录因子，以一种“不连续转录”的机制，通过识别特定的TRS，有选择性的从负义链RNA上，一次性转录得到构成一个成熟mRNA的全部组成部分。结构蛋白和基因组RNA 复制完成后，将在宿主细胞内质网处装配生成新的冠状病毒颗粒，并通过高尔基体分泌至细胞外，完成其生命周期。

冠状病毒属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原，引起多种急慢性疾病。根据系统发育树，冠状病毒可分为四个属：α、β、γ、δ，其中β属冠状病毒又可分为四个独立的亚群A、B、C和D群。其中， HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV6 中是已知可以感染人的冠状病毒，2019年SARS-CoV-2新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。

常见的人冠状病毒(包括229E、NL63、OC43和HKU1型)，通常会引起轻度或中度的上呼吸道疾病，如感冒。症状主要包括流鼻涕、头痛、咳嗽、咽喉痛、发热等，有时会引起肺炎或支气管炎等下呼吸道疾病，心肺疾病患者、免疫力低下人群、婴儿和老年人中较为常见。MERS-CoV和SARS-CoV常引起较为严重症状。MERS症状通常包括发热、咳嗽和呼吸急促，甚至发展为肺炎，病死率约为34.4％。SARS症状通常包括发热、畏寒和身体疼痛，甚至发展为肺炎，病死率约为9.6％。

据美国约翰斯·霍普金斯大学发布的新冠疫情最新统计数据显示，截至北京时间5月18日5时50分左右，全球新冠肺炎累计确诊病例超过470万例，达4702603例，累计死亡病例314476例。

为了适用现场检测的要求，恒温扩增方法得到了广泛的应用，其最大的优点是可以在恒定的温度下发生反应。应用恒温扩增技术检测致病微生物，简单的水浴锅可以取代昂贵的PCR仪，大大降低了检测成本。胶体金免疫检测试纸条是20世纪90年代发展起来的一项新型体外诊断技术。试纸条制作简单，价格便宜，使用方便，并且保存期长。目前关于将试纸条与多酶恒温核酸快速扩增结合起来检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的分析方法未见报道。该技术操作简单快速，结果容易判定，无需复杂的仪器和专业的技术人员，具有很强的现场应用价值。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、试剂、方法以及试剂盒，其可以常温等温条件下，对新型冠状病毒SARS-CoV-2进行快速、实时、特异性检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种常温等温快速检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2的引物和探针，上下游引物和探针的序列具体如下：

上游引物SARS-CoV-2-E-F：CTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAG (SEQ ID NO:1)

下游引物SARS-CoV-2-E-R：[5’修饰基团]CATAGGCAAATTGTAGAAGACAAATCCATGTA(SEQ ID NO:2)，其中5’修饰基团为生物素(biotin)、地高辛或者FITC；

探针SARS-CoV-2-E-Probe：[5’抗原标记]ATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATA[THF]TATATTAGTTTTTCTGTTT G[3’末端标记](SEQ ID NO:3)，其中5’抗原标记为FITC、地高辛或生物素标记，且当下游引物5’修饰基团为生物素、地高辛或者FITC其中一种时，探针 5’抗原标记只能使用其余两种；3’末端标记为一封端基团，优选为胺基、磷酸基团或C3-间臂(C3-spacer)；THF为四氢呋喃。

本发明所述的常温等温，是指维持在某一特定的温度，温度为20-45℃，接近常温，温度保持恒定，优选扩增反应的温度在39-45℃之间。

本发明的特异性引物，是针对新型冠状病毒的包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)设计的单链DNA。有两条单链DNA组成一对引物，特异性地识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30-35核苷酸 (nt)之间，引物中无回文结构、连续重复序列和内部二级结构区；引物设计不考虑Tm值；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。

参见图1，探针在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer(空间位阻) (四氢呋喃，THF)，nfo是一种核酸内切酶，能够识别THF与碱基不匹配位点，进行酶切反应，使得3’末端封闭打开，聚合酶可以沿着3’末端进行延伸，标记的下游引物与探针组成新的扩增子，形成双夹心的中间部件，结合于试纸条上的标记部位，在检测线(T线)显色。本发明的特异性探针，是针对新型冠状病毒的包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)设计的寡核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别新型冠状病毒的包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共有三个修饰位点，距离5’端的30-35nt的中部位置标记一个空间位阻(四氢呋喃， THF)，作为核酸内切酶的识别位点；5’端修饰一个抗原标记(典型FITC、地高辛或生物素)；3’末端标记为一个封端基团，例如胺基、磷酸基团或C3-spacer，用于抑制DNA聚合酶从3’末端开始延伸；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；下游引物的5’端标记一个修饰基团(常用生物素、地高辛或FITC)。

为实现上述目的，本发明还提供一种常温等温快速检测新型冠状病毒 SARS-CoV-2的试剂，包括如上所述的引物和探针。

根据本发明的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，所述试剂还包括聚乙二醇、Tris、乙酸钠、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、逆转录酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶和核酸内切酶，其中核酸内切酶优选核酸内切酶IV，进一步优选大肠杆菌E.coli核酸内切酶IV、T4噬菌体核酸内切酶IV 等。

根据本发明的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，所述试剂的制备方法包括：将反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂；

将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。

根据本发明的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，在反应液中，各工程酶组份的浓度范围如下：重组酶520-725ng/μl；逆转录酶480-500 ng/μl；单链DNA结合蛋白100-200ng/μl；DNA聚合酶350-450ng/μl；核酸内切酶300-400ng/μl。

本发明所述的试剂为固体状况，通过真空冷冻干燥获得。冷冻干燥处理是一种将液体试剂在超低温条件下进行干燥处理，使液体中的水分升华，直接得到固体试剂的过程，固体试剂便于存储和运输，减少运输过程中酶活性降低的几率。具体的说，本发明将反应混合物分装于反应管中，在-80℃条件下预冻 1～1.5小时得到预冻试剂；将预冻试剂先置于-35～-45℃环境下干燥2～10小时，再置于10～18℃环境下干燥1～2小时，得到冻干粉。两个阶段的干燥时间取决于样品的数量；冷冻干燥后的成品需为白色固体并依附在反应管壁，加入液体后可迅速溶解，无任何颗粒状残留物。

本发明试剂中的5种工程酶分别为：重组酶RecA，逆转录酶、单链DNA 结合蛋白，DNA聚合酶和核酸内切酶，是一系列具备特定功能的基因工程酶，具有以下特征：(1)每种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白；(2)每种酶在扩增反应过程中的作用不同，它们的相互合作可以在常温恒温的条件下快速扩增目标核酸片段；(3)重组酶recA，来源于大肠杆菌(E.coli)；(4)单链DNA 结合蛋白，来源于T4或E.coli的gp32；(5)DNA聚合酶的来源较多，例如 Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或者E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段；(6)核酸内切酶，来源于E.coli的核酸内切酶IV、T4 噬菌体核酸内切酶IV等；(7)逆转录酶，来源于莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)或禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV)；(7)每种酶蛋白在反应体系中的最适浓度范围分别为：重组酶，520-725ng/μl；单链DNA结合蛋白，100-200ng/μl；DNA聚合酶，350-450ng/μl；核酸内切酶，300-400ng/μl；逆转录酶480-500ng/μl。

试剂中的其它组分，是维持酶促反应最适条件的多种化合物的混合物，具体的：(1)这些组分的最适浓度范围分别为：聚乙二醇(PEG)，4-5wt％；Tris， 20-30mM；乙酸钠(NaAc)，200-240mM；二硫苏糖醇(DTT)，8-10mM；酸磷酸腺苷(ATP)，8-10mM；磷酸肌酸二钠盐(Creatine phosphate disodium salt， PCr)，80-100mM；磷酸肌酶(Creatine kinase，CK)，80-120ng/μl；脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，450-500μM；海藻糖(Trehalose)，10-12wt％；甘露醇(Mannitol)，40-50ng/μl；(2)这些组分为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、能量、原料，真空冷冻干燥处理过程和存储阶段中提供保护剂。

为实现上述目的，本发明还提供一种通过如上所述试剂实现的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，所述方法包括：

在装有所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和缓冲液(buffer A、buffer B)，buffer A:20mM Tris-HCl(pH 8.5，25℃),150mM KCl,5v/v％PEG, 1v/v％TRITON-X100；buffer B:200mM醋酸镁。

置于一温控设备中孵育10-15分钟，再通过核酸胶体金试纸条进行可视化检测。

另外本发明还涉及一种常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒。具体参见图3示例，本发明提供一种包括如前所述引物及探针或试剂的多酶恒温核酸扩增结合免疫胶体金试纸条检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，探针上连有FITC，能与试纸条检测线(T线)上包被的FITC单克隆抗体结合；下游引物上连有生物素，能与胶体金上标记的抗生物素抗体结合。本发明所述的核酸胶体金试纸条，包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置FITC抗体，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置兔抗鼠二抗(结合生物素的二抗，与生物素的一抗结合同时固定胶体金)，所述结合垫上包被设置生物素抗体-胶体金标记物(图 4示例)。所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。探针和下游引物的5’端分别修饰异硫氰酸荧光素 (FITC)和生物素(Biotin)，扩增产物即为一端有异硫氰酸荧光素标记，另一端有生物素标记的双链DNA结构。核酸胶体金试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素及抗异硫氰酸荧光素抗体(FITC抗体)：链霉亲和素可作为受体与作为配体的生物素结合；抗异硫氰酸荧光素抗体可与异硫氰酸荧光素结合。胶体金核酸试纸条样品端插入反应产物，当有扩增产物时，产物上修饰的生物素与金标上修饰的链霉亲和素的胶体金结合，到达检测线时，检测线上的抗异硫氰酸荧光素抗体将标有异硫氰酸荧光素的产物捕获，从而显色；多余的胶体金向质控线移动时与生物素二抗结合而显色。图3和4只是示例性的，由于下游引物5’修饰基团可以为生物素、地高辛或者FITC；探针5’抗原标记可以为FITC、地高辛或生物素标记，且两者不能相同，相应试纸条上胶体金以及检测线处的抗体可以对应调整。

根据本发明的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的方法，所述温控设备保持一恒定温度值，且该恒定温度值在20-45℃范围内。

所述常温的温度为20-45℃，扩增过程中保持均一恒定温度；整个检测过程简单，快捷，直观。

本发明检测核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，通过特异性引物、特异性探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，利用核酸胶体金试纸条实现核酸目标物的快速检测的方法，检测过程不借助任何大型仪器设备，时间短，操作便捷。

常温等温条件，是指不依赖精确控温的精密仪器完成核酸扩增的反应。本发明的方法只需要维持恒定温度，可以在简易的温控设备上实现扩增反应，例如金属浴、水浴或者恒温箱；反应温度可以设置在20-45℃之间；由于温度正相关于酶的催化速率，针对于RNA而言，扩增反应的最佳温度在39-45℃之间。

本发明的检测方法适合应用于多种场景，操作简易、不需要专业环境，非专业人才也可培训使用，主体反应结束后插入试纸条，3-5分钟内观察质控线与检测线(T线)判读结果，结果判读也相对简易与直观。

参见图2，本发明第一步，引物特异地结合在RNA模板上，在反转录酶的作用下合成一条互补的cDNA链，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交链；第二步，随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链，形成DNA双螺旋结构；第三步，重组酶与引物结合形成酶-引物复合体，开始模板扫描；第四步，找到匹配区域后，在单链结合蛋白的帮助下，进行重组反应，使得引物与母链互补配对；第五步，酶-引物复合体解体，重组酶脱落，DNA聚合酶进入引物的3’端区域，开始从3’端进行子链延伸；第六步，如此循环，子链的不断积累；第七步，探针找到匹配区域进行重组，核酸内切酶识别双链状态下的THF位点，酶促反应启动，探针被切开分离；第八步，探针被核酸内切酶切后，3’末端封闭打开，聚合酶可以沿着3’末端进行延伸，标记的下游引物与探针组成新的扩增子，形成双夹心的中间部件，结合于试纸条上的标记部位，在T线显色。本发明检测方法的工作，是一种借助酶促反应打开双链核酸的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。在 20-45℃恒温下，引物特异地结合在RNA模板上，在反转录酶的作用下合成一条互补的cDNA链，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交链；随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链，形成DNA 双螺旋结构；重组酶与引物形成复合物，该复合物非特异地结合在DNA链上并检索同源区域；找到匹配区域后，在单链DNA结合蛋白的辅助下进行同源重组，重组酶从引物上脱落，同时DNA聚合酶结合引物的3’端并进行子链的延伸；因为DNA聚合酶的链置换活性，新合成的子链替代同源母链的位置，与母链形成双链结构；由于上下游引物的限制，重组酶-引物复合物在下一轮扩增起始阶段，缩短了匹配时间，可以快速地合成新的子链；当双链DNA被打开之后，特异性探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此探针嵌入新生成的子链中；在新生成的DNA双链中，由于探针的嵌入，在探针的THF区域出现未与母链配对的碱基，核酸内切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的3’末端得以释放出来，可以进行链的延伸，形成双夹心的中间部件，可以结合于试纸条上的标记部位，在T线显色。

本发明具有以下技术优势：

1)常温等温反应：与常规的PCR技术相比，常温等温反应降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此仪器的选择面更加宽广。另外，对于配套荧光仪器的设计可以趋于小型化与便携化，而且对于使用者的操作要求更加简易，可以应用于多种场景。

2)反应快速：多酶恒温快速扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，模拟生物体内的核酸扩增反应的过程，大大缩短了扩增过程所需的时间。相对于荧光定量PCR，扩增反应时间由1.5-3小时缩短至10-15分钟，明显提高了扩增效率。

3)结果判读：肉眼直接判读：

阴性(—)：仅在质控线出现一条红色条带，在检测线内无红色条带出现，证明所检测的样本不存在新型冠状病毒SARS-CoV-2感染；

阳性(+)：出现两条红色条带，一条位于检测线内，另一条位于质控线内，证明所检测的样本存在新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。

4)特异性和敏感性：每对引物和探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确而且专一。已有实验数据表明，在10-15分钟内，对新型冠状病毒检测的灵敏度都高达1×10³copies/ml的检测级别。

5)检测过程简易：主要反应组分配制后分装至反应管中，经过真空冷冻干燥后制成固体状态。反应前期准备只需要添加待检样本核酸和缓冲液，混匀后即可启动扩增反应，主体反应结束后插入试纸条，3-5分钟内观察质控线与检测线判读结果，结果判读也相对简易与直观，所以对实验技能要求较低，简单培训实验人员即可完成操作。

6)应用范围广：具有常温、等温、快速、灵敏、特异、操作简便等特点，新方法无需借助任何大型仪器设备，金属浴或者水浴锅等恒温设备即可反应，且结果肉眼可判度，特别适用于现场检测。

附图说明

图1是本发明的探针结构示意图；

图2是本发明的反应原理图；

图3为本发明中核酸免疫胶体金试纸条的检测示意图；

图4是胶体金试纸条的结构示意图；

图5是扩增灵敏度实验的电泳图谱；

图6是扩增灵敏度实验的胶体金试纸条图谱；

图7是特异性的胶体金试纸条图谱；

图8为样本检测的胶体金试纸条图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一：核酸电泳检测

本实施例用于说明在核酸胶体金试纸条进行的常温恒温检测。

1.根据NCBI GenBank上已经公布SARS-CoV-2基因序列(登录号 NC_045512.2)，基于引物与荧光探针设计原则，依据SARS-CoV-2E(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)(SEQ ID NO:4)设计了一对引物 (SARS-CoV-2-E-F和SARS-CoV-2-E-R)，序列下如表一所示：

表一

参考GenBank上已公布的SARS-CoV-2包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)，本申请发明人对SARS-CoV-2包膜糖蛋白基因与功能等信息进行了较为深入的研究，发现包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)是有别于其它冠状病毒，因此包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)被作为检测SARS-CoV-2的位点。

用RNase Free dH₂O对SARS-CoV-2模板(中国疾病控制中心为科研目的提供，全长序列参见NCBI GenBank)进行10倍梯度稀释，用MIRA基础检测试剂盒(即本发明的试剂盒)进行实验，然后进行凝胶电泳反应，根据凝胶电泳结果测试引物的灵敏度。如图5所示，1-5(每个反应做一个重复)为在不同的模版浓度下的扩增效果(模板浓度分别为：1为106copies/mL；2为105copies/mL； 3为104copies/mL；4为103copies/mL；5为102copies/mL；Neg为NTC阴性对照)。该方法可以检测出103copies/mL的SARS-CoV-2的模版为阳性。

根据上述的实验结果，选择引物SARS-CoV-2-E-F和SARS-CoV-2-E-R作为荧光检测实验的引物。根据引物对应的基因序列，设计了一条探针 SARS-CoV-2-E-Probe，探针序列如下。

SARS-CoV-2-E-Probe：

[FITC]ATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATA[THF]TATATTAGTTTTTC TGTTTG[C3spacer]；(SEQ ID NO:3)

其中，FITC为异硫氰酸荧光基团，THF为四氢呋喃，3’末端标记C3间臂。

实施例二：核酸胶体金检测

1.根据NCBI GenBank上已经公布SARS-CoV-2包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)，基于引物与荧光探针设计原则，依据 SARS-CoV-2包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列(SEQ ID NO:4)设计了一对引物(SARS-CoV-2-E-F和SARS-CoV-2-E-R)和一条荧光探针 (SARS-CoV-2-E-Probe)，序列下如表二所示：

表二

2.扩增反应体系为：

表三

*备注：冻干粉试剂包含上述必要的酶和辅助组分，具体为：聚乙二醇，4wt％；Tris，25mM；乙酸钠，200mM；二硫苏糖醇，8mM；酸磷酸腺苷，10mM；磷酸肌酸二钠盐，100mM；磷酸肌酶，100ng/μl；脱氧核糖核苷三磷酸，480μM；海藻糖，10wt％；甘露醇，42ng/μl；重组酶700ng/μl；单链DNA结合蛋白120 ng/μl；DNA聚合酶400ng/μl；逆转录酶480ng/μl；核酸内切酶300ng/μl。

3.扩增反应程序：40度恒温，10分钟。反应结束后,将扩增产物50倍稀释，然后插入试纸条(杭州优思达生物技术有限公司，3号试纸条)，3-5分钟内观察质控线与检测线判读结果。

用RNase Free dH₂O对新型冠状病毒SARS-CoV-2模板进行10倍梯度稀释，用MIRA胶体金检测试剂盒进行实验，结果判断标准为胶体金试纸条质控线为红色且检测线为红色，判断为阳性。如图6所示，1-5为在不同的模版浓度下的扩增效果(模板浓度分别为：1为105copies/mL；2为104copies/mL；3为103 copies/mL；4为102copies/mL；5为NTC阴性对照)。该方法可以检测出103 copies/mL的新型冠状病毒SARS-CoV-2的包膜糖蛋白基因的模版为阳性。并且在胶体金试纸条显色过程中，阴性反应在检测线的位置没有出现红色条带。

实施例三：特异性测试

用于测试所筛选引物和探针的特异性，选择几种其他冠状病毒，用引物 SARS-CoV-2-E-F、SARS-CoV-2-E-R和探针SARS-CoV-2-E-Probe检测，验证是否会出现非特异性扩增，判读假阳性结果。分别选择MERS-CoV(NCBI登录号NC_019843.3，中国疾病控制中心提供用于科研使用，序列与NCBI对应)和 SARS-CoV(NCBI登录号NC_004718.3，中国疾病控制中心提供用于科研使用，序列与NCBI对应)为对比。

实验过程：1)每个干粉反应管(冻干粉同上)加入29.4μL A buffer(A buffer:20mM tris-HCl(pH 8.5，25℃),150mM KCl,5v/v％PEG,1v/v％TRITON-X100)；

2)每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10uM)；

3)向反应管中依次加入11.5μL ddH₂O和2μL核酸模板分别为 MERS-CoV和SARS-CoV(106copies/mL)；

4)最后向反应管中加入2.5μL B buffer(200mM醋酸镁)并充分混合；

5)混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中39℃孵育8-12mins；

6)反应结束后，取10μL加入含有190μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5mins内观察质控线与检测线判读结果。

体系配制

结果如图7所示，该图中，1为SARS-CoV-2，2为MERS-CoV，3为 SARS-CoV，NTC为阴性照引物。可以看出，引物SARS-CoV-2-E-F、 SARS-CoV-2-E-R和探针SARS-CoV-2-E-Probe特异性较佳，未出现假阳性判读结果。

实施例四：试剂样本测试

验证该方法在检测实际样本中有效性，测试几份实际样本的效果。验证引物SARS-CoV-2-E-F、SARS-CoV-2-E-R和探针SARS-CoV-2-E-Probe是否出现假阴性判读。利用收集到的不同咽拭子核酸样本(中国疾病控制中心提供，用于科研使用)进行测试。

实验过程：1)每个干粉反应管(冻干粉同上)加入29.4μL A buffer(同上)；

2)每个反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM)；

3)向反应管中依次加入11.5μL ddH₂O和2μL核酸模板(浓度106 copies/mL)；

4)最后向反应管中加入2.5μL B buffer(同上)并充分混合；

体系配制

结果如图8所示，引物SARS-CoV-2-E-F、SARS-CoV-2-E-R和探针 SARS-CoV-2-E-Probe覆盖面较佳，未出现假阴性判读结果。

综上所述，本发明涉及一种在常温等温条件下，对新型冠状病毒 SARS-CoV-2进行快速、实时、特异性检测的方法，通过特异性引物、特异性探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，利用核酸胶体金试纸条实现核酸目标物的快速检测，检测过程不借助任何大型仪器设备，时间短，操作便捷，结果判读也相对简易与直观。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 潍坊安普未来生物科技有限公司

<120> 常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、试剂、方法及试剂盒

<130> DSP1F201325JW

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cataggcaaa ttgtagaaga caaatccatg ta 32

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcttctggt ctaaacgaac taaatatata ttagtttttc tgtttg 46

<210> 4

<211> 445

<212> DNA

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2)

<220>

<221> misc_feature

<223> SARS-CoV-2 包膜蛋白及其3’UTR和膜糖蛋白基因序列

<400> 4

atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60

cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120

gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180

cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaaac gaactaaata 240

ttatattagt ttttctgttt ggaactttaa ttttagccat ggcagattcc aacggtacta 300

ttaccgttga agagcttaaa aagctccttg aacaatggaa cctagtaata ggtttcctat 360

tccttacatg gatttgtctt ctacaatttg cctatgccaa caggaatagg tttttgtata 420

taattaagtt aattttcctc tggct 445

Claims

1.一种常温等温快速检测新冠病毒SARS-CoV-2的引物和探针，其特征在于，上下游引物和探针的序列具体如下：

上游引物(5’到3’端)SARS-CoV-2-E-F：

CTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAG(SEQ ID NO:1)；

下游引物SARS-CoV-2-E-R：[5’修饰基团]

CATAGGCAAATTGTAGAAGACAAATCCATGTA(SEQ ID NO:2)，其中5’修饰基团为生物素、地高辛或者FITC；

探针SARS-CoV-2-E-Probe：[5’抗原标记]

ATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATA[THF]TATATTAGTTTTTCTGTTTG[3’末端标记](SEQ IDNO:3)，其中5’抗原标记为FITC、地高辛或生物素标记，且当下游引物5’修饰基团为生物素、地高辛或者FITC其中一种时，探针5’抗原标记只能使用其余两种；3’末端标记为一封端基团，优选为胺基、磷酸基团或C3-间臂。

2.一种常温等温快速检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，所述试剂还包括聚乙二醇、Tris、乙酸钠、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸、海藻糖、甘露醇、重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、逆转录酶和核酸内切酶；其中，单链DNA结合蛋白例如来源于T4或E.coli的gp32；DNA聚合酶例如Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或者E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段；逆转录酶例如来源于莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV)或禽类成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV)；核酸内切酶优选核酸内切酶IV，进一步优选大肠杆菌E.coli核酸内切酶IV或T4噬菌体核酸内切酶IV。

4.根据权利要求3所述的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，所述试剂的制备方法包括：

将反应液在-80℃条件下预冻1～1.5小时得到预冻试剂；

5.根据权利要求4所述的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，在反应液中，各组份的浓度范围如下：

重组酶520-725ng/μl；单链DNA结合蛋白100-200ng/μl；DNA聚合酶350-450ng/μl；逆转录酶480-500ng/μl；核酸内切酶300-400ng/μl。

6.根据权利要求5所述的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，在反应液中，各组份的浓度范围如下：

聚乙二醇，4-5wt％；Tris，20-30mM；乙酸钠，200-240mM；二硫苏糖醇，8-10mM；酸磷酸腺苷，8-10mM；磷酸肌酸二钠盐，80-100mM；磷酸肌酶，80-120ng/μl；脱氧核糖核苷三磷酸，450-500μM；海藻糖，10-12wt％；甘露醇，40-50ng/μl。

7.根据权利要求2～6任一项所述的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，所述试剂的使用方法包括：

在装有所述试剂的反应管中加待检样本、双蒸水和试剂缓冲液；

8.根据权利要求7所述的常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂，其特征在于，所述温控设备保持一恒定温度值，且该恒定温度值在20-45℃范围内，优选的温度在39-45℃之间。

9.一种包括如权利要求1所述引物和探针或者权利要求2-8的试剂的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸胶体金试纸条。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸胶体金试纸条的胶体金用生物素、地高辛或者FITC的抗体标记，检测线包被FITC、地高辛或生物素的抗体，优选地所述核酸胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。