CN115541875A - N基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种N基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法;属于生物检测技术领域;所述检测SARS‑CoV‑2病毒N基因的引物探针组合特异性扩增并检测SARS‑CoV‑2病毒的N基因。本申请研发的引物探针可以保证快速、高效、特异性地对目的片段进行扩增,扩增时间仅需10min,最低检测拷贝数可达200 copies/ml;扩增产物检测形式为试纸条,肉眼鉴定,无需仪器辅助;且扩增过程无需变温和类似于PCR仪等复杂装置,只需要将反应温度控制在39‑42℃即可。
Description
技术领域
本申请涉及一种生物检测技术领域,更具体地说,尤其涉及N基因检测引物及探针组、层析试纸条、制备方法、检测试剂盒、检测方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(SARS-CoV-2)引起,新冠的全球传播对各个国家构成了多方面威胁。
N基因是新冠病毒核酸检测(SARS-CoV-2)的靶标基因之一,它是新型冠状病毒基因组中核壳蛋白基因。
申请人经过文献调研,发现了以下文献均是基于N基因提出了检测试剂盒:
文献1:CN111778356A。
文献2:CN114317822A。
文献3:CN114277048A。
文献4:CN111690772A。
文献5:US20220259680A1。
文献6:US20220195541A1。
文献7:US20220056542A1。
文献8:EP3986614A2。
文献9:EP3911769A1。
申请人在先申请“2022110650049”提出了一种核酸检测装置,其采用层析试纸条来实现核酸检测。所述核酸检测设备将扩增与检测试剂盒两种技术有机结合在一起。但是,上述技术结合在一起,对层析试纸条(即引物、探针)等提出了新的技术挑战:
第一,检测装置体型小、加热降温功率慢。因此,PCR扩增在恒温状态下,且温度在40°左右是适宜的。而现有技术的检测试剂盒中的扩增程序一般都是在高温状态下进行。
第二,现有技术如CN112458210A、CN111500776A等技术均提出了基于RPA技术的引物、探针。上述荧光RPA扩增的程序为:40℃、20min,间隔30s采集一次荧光,计40个循环。但是,上述引物、探针并不适用于“2022110650049”的方案,因为“2022110650049”采用的核酸检测装置没有荧光。
第三,现有技术如CN112981008A,在其实施例3公开了一种基于RPA技术的引物、探针,其也能配合层析试纸进行检测。
针对N基因的引物、探针、层析试纸也要与申请人研发的“一种引物、探针、组合物、层析试纸及制备方法、试剂盒”均能够搭配在“2022110650049”研发的核酸检测装置。因此,两者的研发目标要相互协调。
即针对N基因的引物、探针、层析试纸,也需要满足下述研发目标:
1)检测时间要快:恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟。
2)初阳人员能够检测出来:灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/ml能够检测出来。
而通过上述检索分析,目前的现有技术还无法满足上述研发目标。
发明内容
本申请的第一目的在于针对上述现有技术的不足,提供一种N基因检测引物及探针组。
本申请的第二目的在于提供一种层析试纸条。
本申请的第三目的在于提供一种层析试纸条的制备方法。
本申请的第四目的在于提供一种检测试剂盒。
本申请的第五目的在于提供一种非诊断目的2019-CoV-2病毒检测方法。
本申请的技术方案是:
一种层析试纸,包括PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫;沿着层析溶液的流动方向,样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上;样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构搭接连接;
结合垫中包含:FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物,所述FAM抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成;所述DNP-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成;
所述检测垫包括硝酸纤维素膜,在检测垫上设置检测区:其经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成;
在检测垫上设置对照区:其经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
进一步,所述的显色颗粒均为红色乳胶微球。
进一步,所述乳胶微球粒径为400nm。
一种层析试纸的制备方法,其包括如下步骤:
S100,制作结合垫:
制备显色颗粒溶液,将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体-显色颗粒复合物,将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP-显色颗粒复合物,将FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物加载到结合垫上。
S200,制作检测垫:
抗地高辛抗体和DNP抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区。
S300,制备试纸大板:
样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上形成试纸大板;其中,结合垫与检测垫两者部分重合,吸水垫与检测垫两者部分重合。
S400,制备层析试纸,将步骤三中制备的试纸大板进行裁切,制备成检测试纸。
进一步,若有SARS-CoV-2病毒,其N基因在经过扩增体系后会产生扩增产物;扩增产物首先与样本垫结合,然后经过结合垫,其在经过结合垫时,扩增产物的FITC标签与FAM抗体-显色颗粒复合物结合;
再经过检测垫:经过检测区时,扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区显色;
经过对照区,溶液在经过结合垫时,必然会混入DNP-显色颗粒复合物,溶液在层析试纸流动的时候,经过对照区时,DNP-显色颗粒复合物会与DNP抗体结合,对照区显色。
2019-CoV-2病毒N基因检测引物及探针组,所述的引物的核苷酸序列为:
上游引物序列:CCAAA CTGTC ACTAAG AAATC TGCTG CTGAG
下游引物序列:
[5’-Digoxin]-ATCAGTTCCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTCC
探针序列:[5’FAM]-CTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCAC[THF]AAAGCATACAATGTAACAC-[3’C3spacer]。
进一步,所述引物、探针有四个修饰位点:
在下游引物5’端标记Digoxin;
探针5’端标记FAM;
探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位点;
探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团。
进一步,所述阻断基团采用C3-spacer修饰。
一种检测试剂盒,其包括前述的引物及探针组、前述的层析试纸。
一种非诊断目的2019-CoV-2病毒检测方法,包括以下步骤:
S1,配置反应体系:
所述的引物及探针组为前述的引物及探针组;
S2,将S1中配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球,酶冻干微球主要成分如下:
S3,扩增体系粘稠,配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中,扩增10min;
S4,待扩增结束后,使用蒸馏水对扩增产物进行稀释,稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等。
S5,产物稀释后,取80μl稀释产物滴加到前述的层析试纸条上,5-10min读取结果。
本申请的有益效果在于:
第一,本申请的基础构思是设计一种引物、探针,扩增时间仅10min,提高了检测效率;扩增温度低,减少气溶胶产生和核酸污染,同时反应过程无需变温,扩增装置简易;检测产物匹配自制试纸条,无需复杂设备,且检测结果肉眼可鉴。
第二,本申请经过灵敏性试验研究,表明:本申请的引物探针组合,最低检测限可低于200copies/ml。对于初阳、无症状人员而言,也能检测出来。
附图说明
下面结合附图中的实施例对本申请作进一步的详细说明,但并不构成对本申请的任何限制。
图1是本申请的层析试纸的设计图。
图2是本申请的验证性试验的测试结果。
图3是本申请的层析试纸灵敏度验证的测试结果。
图4是本申请的特异性扩增试验的测试结果。
附图标记:
样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104、检测区201、对照区202。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但下述的实例仅仅是本发明的简易例子,并不代表或限制本发明的权利保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
<研发要求>
研发目标(1):检测时间要快:恒温扩增温度控制在40℃左右且时间指标控制在10分钟。
研发目标(2)初阳人员能够检测出来:灵敏度控制指标中的扩增体系内的样本在200copies/ml能够检测出来。
基于现有知识的分析,本申请的研发重点与难点在于:
1)现有的引物、探针、层析试纸还无法满足前述的研发目标(1)。
现有技术的恒温扩增,最好的效果就是:温度在40℃扩增20min。恒温扩增技术应用在N基因上,扩增时间缩短到10min,还没有成功经验。
2)现有的引物、探针、层析试纸还无法满足前述的研发目标(2)。
灵敏度是更具挑战的指标之一。研发团队经过测试:CN112981008A的灵敏度在1000copies/ml;上述设计仍然无法达到本申请的设计目标。
而如:CN 112646929 A采用了RNA恒温扩增+胶体金层析试纸方案,在其技术效果中认为:在同一管内能够同时扩增新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因和内参ACTB基因三种指标,且灵敏度还能达到RNA拷贝的最低检测限为100拷贝/mL。
本项目在初始设计时,对CN 112646929A的方案进行了大量重复试验,灵敏度事实上无法达到上述效果。事实上,其灵敏度在1000拷贝/mL以上。而从这一现有技术的测试结果出发,研发团队一度对“恒温扩增+层析试纸”方案能够完成研发目标产生过动摇。
<实施例一、研发方案>
(1)根据N基因保守序列设计的引物、探针,其核苷酸序列如下:
上游引物序列:CCAAA CTGTC ACTAAG AAATC TGCTG CTGAG。
下游引物序列:
[5’-Digoxin]-ATCAGTTCCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTCC。
探针序列:[5’FAM]-CTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCAC[THF]AAAGCATACAATGTAACAC-[3’C3spacer]。
(2)适配的层析试纸
硬件设计:如图1所示,一种层析试纸,包括PVC底板、样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104;沿着层析溶液的流动方向,样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104依次布置在PVC底板上;样品垫101、结合垫102、检测垫103、吸水垫104相邻的两种结构的重合长度在1mm。
核心设计:
(2.1)结合垫102中包含:FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物,所述FAM抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成;所述DNP-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成;所述的显色颗粒均为红色乳胶微球,所述乳胶微球粒径为400nm。
(2.2)所述检测垫103包括硝酸纤维素膜。
在检测垫上设置检测区201(即T线);检测区201,其经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成(所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成)。
在检测垫上设置对照区202(即C线)。对照区202,其经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成(DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成)。
作为一种全新的层析试纸,其制备方法是:
S100,制作结合垫:
制备显色颗粒溶液,将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体-显色颗粒复合物,将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP-显色颗粒复合物,将FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物加载到结合垫上。
S200,制作检测垫:
抗地高辛抗体和DNP抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区(或称为质控区)。
S300,制备试纸大板:
样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上形成试纸大板;其中,结合垫与检测垫两者部分重合,吸水垫与检测垫两者部分重合。
S400,制备层析试纸,将步骤三中制备的试纸大板进行裁切,制备成检测试纸。
层析试纸的作用机理为:
若有SARS-CoV-2病毒,其N基因在经过扩增体系后会产生扩增产物;扩增产物首先与样本垫结合,然后经过结合垫,其在经过结合垫时,扩增产物的FITC标签(即FAM)与FAM抗体-显色颗粒复合物结合。
再经过检测垫:经过检测区时,扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使T线显色(T线显色的要求是:扩增产物的一端与要和FAM抗体-显色颗粒复合物连接,另外一端与抗地高辛抗体结合)。
经过对照区,溶液在经过结合垫时,必然会混入DNP-显色颗粒复合物,溶液在层析试纸流动的时候,经过对照区时,DNP-显色颗粒复合物会与DNP抗体结合,C线显色。其优点在于C线的显色不受模板浓度的影响,为独立的质控体系,若没采样独立质控体系,当模板浓度较高时,C线会不显色,判定试纸无效。
因此,层析试纸会产生如下四种情况:
T线显色、C线不显色,表示:无效。
T线不显色、C线不显色,表示:无效。
T线不显色、C线显色,表示:阴性。
T线显色、C线显色,表示:阳性。
<验证性试验>
制备样本
使用申请人自制的核酸提取试剂盒(磁珠法)对新冠N基因假病毒(拷贝数约2×108copies/ml)进行核酸提取,提取后N基因核酸分别稀释102、103、104、105、106、107倍后作为阳性模板P1、P2、P3、P4、P5、P6,用以验证引物探针扩增效果。
检测体系
对新冠N基因核酸进行恒温扩增体系配制,如下表(每组实验均设置1组复孔):
检测程序
1)将上述配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球。
2)扩增体系粘稠,配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中,扩增10min。
3)待扩增结束后,使用蒸馏水对扩增产物进行稀释,稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等。
4)产物稀释后,取80μl稀释产物滴加到研发团队自研的微球法试纸条上,5-10min读取结果。
如图2所示,为验证性实验一的测试结果。结果显示:该组引物、探针对N基因核酸模板的扩增,最低检测限可低于200copies/ml,且未出现非特异性扩增。
<层析试纸灵敏度验证>
制备样本
使用申请人自制的核酸提取试剂盒(磁珠法)对新冠N基因假病毒(拷贝数约2×108copies/ml)进行核酸提取,作为阳性模板。
检测体系
对新冠N基因核酸进行恒温扩增体系配制,如下表(阴性配制4组重复,阳性配制10组重复)。
检测程序
1)扩增体系粘稠,配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中,扩增10min。
2)待扩增结束后,使用蒸馏水对扩增产物进行稀释20倍。
3)产物稀释后,取80μl稀释产物滴加到本申请自制的微球法试纸条样品垫上,5-10min读取结果。
如图3所示,为验证性实验二的测试结果。结果显示:该组引物、探针对N基因核酸模板的扩增,将200copies/ml的模板重复多次扩增进行检测,均可检出。
<特异性扩增试验>
模板:
1)阴性模板N:DPEC-H2O;
2)阴性参考品盘模板:
编号 | 模板 | 编号 | 模板 |
1 | 阴性拭子样本 | 8 | 冠状病毒OC43 |
2 | 乙型流感Yamagata | 9 | 冠状病毒229E |
3 | 乙型流感Victoria | 10 | 冠状病毒HKU1 |
4 | 季节性H1N1流感病毒 | 11 | 冠状病毒NL63 |
5 | EB病毒 | 12 | 腺病毒3型 |
6 | 肺炎支原体 | 13 | 副流感2型 |
7 | 肺炎衣原体 | 14 | 呼吸道合胞病毒 |
3)阳性模板+:N基因假病毒。
检测体系
检测体系除了模板类型外,其他同“验证性试验”的检测体系。
检测程序
检测程序同“验证性试验”的检测程序。
以上模板使用本申请的引物探针组合物进行恒温扩增;从图4可知显示无非特异性扩增反应。
以上所举实施例为本申请的较佳实施方式,仅用来方便说明本申请,并非对本申请作任何形式上的限制,任何所属技术领域中具有通常知识者,若在不脱离本申请所提技术特征的范围内,利用本申请所揭示技术内容所作出局部更动或修饰的等效实施例,并且未脱离本申请的技术特征内容,均仍属于本申请技术特征的范围内。
Claims (10)
1.一种层析试纸,包括PVC底板、样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫;沿着层析溶液的流动方向,样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上;样品垫、结合垫、检测垫、吸水垫相邻的两种结构搭接连接;
其特征在于,结合垫中包含:FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物,所述FAM抗体-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与FAM抗体混合反应形成;所述DNP-显色颗粒复合物经由显色乳胶微球与DNP混合反应形成;
所述检测垫包括硝酸纤维素膜,在检测垫上设置检测区:其经由抗地高辛抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;所述检测抗地高辛抗体是由抗地高辛抗体与磷酸缓冲液组成;
在检测垫上设置对照区:其经由对DNP抗体加载在硝酸纤维素膜上形成;DNP抗体由DNP多克隆抗体与磷酸缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的一种层析试纸,其特征在于,所述的显色颗粒均为红色乳胶微球。
3.根据权利要求2所述的一种层析试纸,其特征在于,所述乳胶微球粒径为400nm。
4.如权利要求1所述的一种层析试纸的制备方法,其特征在于,其包括如下步骤:
S100,制作结合垫:
制备显色颗粒溶液,将显色颗粒溶液与FAM抗体混合反应形成FAM抗体-显色颗粒复合物,将显色颗粒溶液与DNP混合反应形成DNP-显色颗粒复合物,将FAM抗体-显色颗粒复合物、DNP-显色颗粒复合物加载到结合垫上;
S200,制作检测垫:
抗地高辛抗体和DNP抗体分别加载在检测垫上的检测区和对照区;
S300,制备试纸大板:
样本垫、结合垫、检测垫、吸水垫依次布置在PVC底板上形成试纸大板;其中,结合垫与检测垫两者部分重合,吸水垫与检测垫两者部分重合;
S400,制备层析试纸,将步骤三中制备的试纸大板进行裁切,制备成检测试纸。
5.如权利要求4所述的一种层析试纸的制备方法,其特征在于,若有SARS-CoV-2病毒,其N基因在经过扩增体系后会产生扩增产物;扩增产物首先与样本垫结合,然后经过结合垫,其在经过结合垫时,扩增产物的FITC标签与FAM抗体-显色颗粒复合物结合;
再经过检测垫:经过检测区时,扩增产物的另一端Digoxin标签会和检测区上的抗地高辛抗体结合使检测区显色;
经过对照区,溶液在经过结合垫时,必然会混入DNP-显色颗粒复合物,溶液在层析试纸流动的时候,经过对照区时,DNP-显色颗粒复合物会与DNP抗体结合,对照区显色。
6.一种2019-CoV-2病毒N基因检测引物及探针组,其特征在于,所述的引物的核苷酸序列为:
上游引物序列:CCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAG
下游引物序列:
[5’-Digoxin]-ATCAGTTCCTTGTCTGATTAGTTCCTGGTCC
探针序列:
[5’FAM]-CTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCAC[THF]AAAGCATACAATGTA ACAC-[3’C3spacer]。
7.如权利要求6所述的一种2019-CoV-2病毒N基因检测引物及探针组,其特征在于,所述引物、探针有四个修饰位点:
在下游引物5’端标记Digoxin;
探针5’端标记FAM;
探针距离5’端约30nt、距离3’端约15nt位置设置一个四氢呋喃修饰位点;
探针3’端末端标记阻断探针延伸的阻断基团。
8.如权利要求7所述的一种2019-CoV-2病毒N基因检测引物及探针组,其特征在于,所述阻断基团采用C3-spacer修饰。
9.一种检测试剂盒,其特征在于,其包括如权利要求6所述的引物及探针组、权利要求1所述的层析试纸。
10.一种非诊断目的2019-CoV-2病毒检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,配置反应体系:
其中,所述的引物及探针组为权利要求6所述的引物及探针组;
S2,在S1中配制的体系溶解恒温扩增混合酶冻干微球,酶冻干微球包括:T4 UvsX重组酶、T4 UvsY蛋白、Bsu DNA聚合酶、逆转录酶、gp32蛋白、冻干骨架;
其中,冻干骨架为蔗糖;
其中,T4 UvsX重组酶的含量浓度为100ng/μL;
其中,T4 UvsY蛋白的含量浓度为50ng/μL;
其中,Bsu DNA聚合酶的含量浓度为50ng/μL;
其中,逆转录酶的含量浓度为50ng/μL;
其中,gp32蛋白的含量浓度为300ng/μL。
S3,扩增体系粘稠,配制后需在涡旋仪中涡旋震荡混匀20s后再将体系放置于39-42℃金属浴或其他恒温仪器中,扩增10min;
S4,待扩增结束后,使用蒸馏水对扩增产物进行稀释,稀释倍数可根据产物浓度控制在10-120倍不等;
S5,产物稀释后,取80μl稀释产物滴加到如权利要求1所述的层析试纸条上,5-10min读取结果。
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