CN111074007A

CN111074007A - 一种检测sars-cov-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组

Info

Publication number: CN111074007A
Application number: CN202010094323.7A
Authority: CN
Inventors: 方圆; 宋泽世; 蔡青青; 郏肯特; 田西西
Original assignee: Shanghai Difei Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Shanghai Difei Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2020-02-15
Filing date: 2020-02-15
Publication date: 2020-04-28

Abstract

本发明公开一种检测SARS‑COV‑2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组，试剂盒包括（1）灭活裂解液；（2）恒温扩增体系：反应缓冲液BufferA、醋酸镁BufferB、阴性对照、无核酸酶水、引物探针组和RAA酶。通过裂解液快速灭活并释放病毒核酸，并利用恒温扩增技术，快速富集并扩增目的区域，通过带有修饰基团的探针与带有生物素的产物结合，通过侧向层析技术，利用胶体金显色，快速确认是否存在特异性扩增产物。该试剂盒操作简单，无需专业抽提试剂和检测仪器，摆脱了检测实验室和专业人员的限制，可以在户外无仪器状态下进行快速检测，全流程仅需30min，判读非常方便。

Description

一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一种针对SARS-COV-2病毒定性检测的恒温扩增检测试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种之前尚未在人类中发现的新型病毒，属于SARS样冠状病毒种，但是与SARS-CoV属于不同毒株。新型冠状病毒感染的肺炎(Corona VirusDisease 2019，简称COVID-19)，简称新冠肺炎，是经呼吸道传播的由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的一种传染病。

新型冠状病毒检测需要在专业的PCR实验室内，由专业人员使用昂贵的抽提和检测仪器进行检测，耗时至少3个小时，并且结果判读较为困难，每日检测量受到限制，基层医疗单位无法第一时间确诊，导致交叉感染和病情延误的情况。并且，早期使用的核酸检测试剂盒对于已确诊的病人阳性率也只在30％—50％之间，给疫情确诊和控制带来了一定困难。

核酸恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来得一种新的体外核酸扩增技术，其特点为扩增反应的全过程均在单一温度进行，反应时间大大缩短，结合核酸试纸条显色来判定检测结果，整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条检测过程密闭，减少核酸扩增产物污染的可能性。针对新发现病毒的恒温扩增检测试剂盒，选择合适的灭活裂解液，以及引物探针的选择尤为关键，目前尚没有针对SARS-COV-2病毒的恒温扩增检测试剂盒公开。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明第一个目的在于提供一种快速、准确、无仪器依赖的检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组。

本发明第二个目的在于提供引物探针组在制备检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒中的应用。

本发明第三个目的在于提供一种快速、准确、无仪器依赖的检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组，

正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQ ID NO.2)；

探针序列为：5’-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT-3’block(SEQ ID NO.3)，其中5’端标记抗原基团，3’端连接封闭基团。

通过在探针序列的5′端增加抗原基因，包括但不限于修饰基团FAM发光基团，FITC，地高辛等，用于和抗体结合，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)进行修饰，在探针3’端连接封闭基团阻断修饰，包括但不限于C3-Spacer，biotin-TEG，phosphate等。探针序列优选5′端标记FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)进行修饰，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

在反向引物5’端增加biotin进行修饰。反应终产物在5’端带有抗原标记，3’端带有生物素。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：所述检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组在制备检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，所述试剂盒包括：

(1)灭活裂解液；

(2)恒温扩增体系：反应缓冲液BufferA、醋酸镁BufferB、阴性对照、无核酸酶水、引物探针组和RAA酶。

所述引物探针组为，

正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQ ID NO.2)；

作为一个优选方案，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01-0.1M的NaOH，体积比为0.1％-0.5％的TWEEN-20，体积比为0.1％-1％的Triton X-100。

作为进一步优选方案，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01M的NaOH，体积比为0.5％的TWEEN-20，体积比为0.1％的Triton X-100。

通过灭活裂解液对口腔拭子样本进行快速灭活，并裂解病毒细胞，释放出核酸。自制灭活裂解液中非离子表面活性剂高效结合病毒表面蛋白，破坏病毒结构，弱碱性溶液进一步破坏细胞结构，释放核酸。

作为一个优选方案，所述恒温扩增体系中引物探针组和RAA酶制成干粉态。

作为一个优选方案，将正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQ ID NO.1)400nm，反向引物为：5’biotin-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQID NO.2)400nm，探针：FAM-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT/3‘block 120nm与反应所需的RAA酶一起，制成干粉态，储于干粉反应管，便于保存和操作。

作为一个优选方案，RAA酶、buffer A和buffe B采购自杭州众测生物。所述RAA酶包括逆转录酶，链置换DNA聚合酶，重组酶，单链DNA结合蛋白，NFO酶。

作为一个优选方案，所述BufferA包括摩尔浓度为50mM的Tris pH 8.4,80mM的Potassium acetate,10mM的Magnesium acetate,1mM的DTT,3mM的ATP，20mM的Phosphocreatine,100ng/ul的Creatine kinase和质量浓度为5％的PEG compound(Carbowax-20M，molecular crowding agents拥挤剂)。

作为一个优选方案，所述BufferB包括摩尔浓度为250mM的醋酸镁。

作为一个优选方案，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条(购自杭州优思达生物技术公司)。试剂盒还包括一次性核酸检测装置(购自杭州优思达生物技术公司)，使用核酸检测试纸条检测，结合了重组酶聚合酶扩增技术和胶体金显色技术，在配置好的弱碱性非离子表面活性剂的处理下，RNA病毒可以较为高效的进行裂解，且该体系对对后续重组等温扩增体系影响较小，可以直接加入反应体系中而无需纯化。

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列并链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。上下游引物扩增延伸产生一个完整的扩增子。FAM标记的nfo探针可退火至与原始扩增产物内的靶序列杂交，在nfo酶的作用下切割探针，使得被封闭的3’端被丢弃，探针从切口处在聚合酶作用下延伸，最终与带biotin的反义链生成双标记的扩增子。双标记的扩增子首先与金标抗体形成抗原抗体复合物，其次前进到检测线时被检样和金标抗体复合物与已知抗体形成复合物，即双抗夹心。最后到质控线处形成金标抗体与抗金标抗体复合物。

胶体金技术是通过还原剂将氯金酸溶液中的金离子转化为金原子，生成大小不同的胶体金颗粒，当这些颗粒大量聚集时，肉眼可见红色斑点，用于判读。本发明不限于使用胶体金试纸条，任何可以显色的乳胶颗粒，在与抗体结合后富集到5’端抗原标记的核酸上，均可以用于检测。

反应产物在PBSbuffer缓冲液稀释后，加在样本垫处，经过结合垫与抗体及胶体金染料结合，在醋酸纤维素膜上向另一侧运动，扩增产物的3‘端被检测线处的链霉素亲和素结合。集中在检测T线处，显示条带。未扩增成功的多余探针与抗体和胶体金结合后，继续前进至C线处，被另一抗体进行结合，从而形成C线。试剂盒灵敏度和准确性高，可以满足快速检测SARS-COV-2病毒的要求。

通过一次性核酸检测装置，将反应产物与层析缓冲液放在一个卡槽中，一次按压，即可对结果进行判读。

RT-RAA反应温度为25～42℃，更优的，选择42℃作为最佳反应温度。反应时间为15～25min，更优的，选择20min作为反应时间。通过一次性核酸检测装置，在检测开始后5min观察试纸条，阳性结果出现两条红色的带，一条为质控C线，一条为检测T线。

本发明试剂盒特异性较好，对SARS，229E等冠状病毒和流感等RNA病毒无非特异性扩增，灵敏度较高，临床检测可检出ct值35的样本，使用标准质粒检测可稳定检出100拷贝模板。

本发明具有以下有益效果：本发明公开的引物探针组具有高特异性和高灵敏度，通过自制灭活裂解液快速灭活并释放病毒核酸，并利用恒温扩增技术，快速富集并扩增目的区域，通过带有修饰基团的探针与带有生物素的产物结合，通过侧向层析技术，利用胶体金显色，快速确认是否存在特异性扩增产物。该试剂盒操作简单，无需专业抽提试剂和检测仪器，摆脱了检测实验室和专业人员的限制，可以在户外无仪器状态下进行快速检测，全流程仅需30min，判读非常方便。

附图说明

图1为不同温度下检测结果。

图2为使用不同病毒特异性分析检测结果。

图3为不同浓度质粒反应检测结果。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的意义相同。本发明不对所采用的原料的来源进行限定，如无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1.试剂盒的组成与配置

本发明中RAA酶、buffer A和buffe B采购自杭州众测生物，一次性核酸检测装置采购自杭州优思达生物技术公司。

RAA酶包括：

逆转录酶：MLV用于RNA链逆转录；

链置换DNA聚合酶：Bsu(Bacillus subtilis Pol I)，DNA链延伸；

重组酶：T4 uvsX：帮助引物与模板结合；

单链DNA结合蛋白：T4 gp32保证双链DNA打开为单链状态；

NFO酶：核酸外切酶，切割探针，使探针可以延伸。

gp32:15～30um；109～200ng/ul uvsX；3～6um；uVSY(recombinase loadingfactor重组酶加载因子)2～4um；BSu polymerase,1000Units；200uM dNTPs；MLV200Untis；NFO 50U。

Buffer A包括摩尔浓度为50mM的Tris pH 8.4,80mM的Potassium acetate,10mM的Magnesium acetate,1mM的DTT,3mM的ATP，20mM的Phosphocreatine,100ng/ul的Creatine kinase和质量浓度为5％的PEG compound(Carbowax-20M，molecular crowdingagents拥挤剂)。

Buffer B包括摩尔浓度为250mM的醋酸镁。

依据RAA引物设计原则，根据GenBank中已经公布的新型冠状病毒基因S区域的保守区域设计引物，用primer3.0设计一套引物，该套引物包括1对新冠病毒S基因引物和探针。该套引物由南京金斯瑞公司合成，合成后的引物和探针用NF水稀释成10μmol/L溶液。

正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’(SEQ ID NO.1)400nm；

反向引物为：5’biotin-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’(SEQ ID NO.2)400nm；

探针：FAM-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ATCAGGATGTTAACT/3‘block120nm。

探针序列5′端标记FAM发光基团，AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACT(SEQ ID NO.3)第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)进行修饰，3′端进行C3-spacer阻断修饰。

引物探针与反应所需的RAA酶一起，制成干粉态，储于干粉反应管，便于保存和操作。

灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01-0.1M的NaOH，体积比为0.1％-0.5％的TWEEN-20，体积比为0.1％-1％的Triton X-100。

实施例2.灭活裂解液筛选

配方1：0.1M～0.2M NaOH，0.1～0.5％TWEEN 80；

配方2：0.01-0.1M NaOH，0.1～0.5％TWEEN 20，0.1％-1％Triton X-100；

配方3：0.01-0.1M NaOH，0.1～0.5％TWEEN 20。

使用3个配方裂解液各100ul，在对同样口腔样本进行处理，选择ACTB基因作为内参。

反应结果如下：

	配方1	配方2	配方3
				CT值	27.87	24.52	29.68

三组实验中配方2的效果最佳，选择配方2进行处理。

裂解体系与商业化抽提试剂盒比较：

方案：

采集2组样本，每个样本平行采集2份，将2份共同采集的口腔拭子，分别用自配裂解液和某进口试剂盒处理。

1、自配裂解液150ul，将口腔拭子浸入后，挤压8～10次，剩余约30ul，取5ul模板进行反应。

2、将另一组样本，使用trizol 1ml反复挤压8～10次，加入1ml无水乙醇。

将混合物放入离心柱内，离心1min。

5ulDNase I和消化液75ul，混匀后加入离心柱，室温孵育15min；

加入400ul RNA洗涤液1到离心柱，离心1min，弃去滤液；

加入700ul RNA洗涤液2到离心柱，离心1min，弃去滤液；

高速离心2min，空转；

取出离心柱，放入一个无RNA酶的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl RNase-freewater(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，离心1分钟洗脱RNA。

选择ACTB基因作为内参

反应结果如下：

反应时间：自配裂解液5min；进口试剂盒1.5h。

结论：自配裂解液在同样体积中，检出的RNA量为试剂盒的4～8倍，判断影响因素如下：(1)裂解液无需大体系洗脱，获得的浓度更高；(2)裂解液无过柱纯化步骤，无需转管，无抽提损失。

实施例3.试剂盒检测

1.病毒灭活：依据所需检测样本数准备病毒灭活管，将病毒灭活管置于离心机内，4000rpm瞬时离心3-5秒(如无离心机可用手臂轻甩灭活管)，将拭子伸入灭活液中，反复挤压8-10次，使拭子与灭活液充分混合接触。然后将拭子中的灭活液按压收集至管底。废弃拭子(建议将拭子至于原套筒内然后遗弃)，盖上灭活管，静置至少2min使病毒完全灭活。如不能及时完成后续操作，需至于-20℃条件保存，如需长时间保存需放置于-80℃。

2.恒温扩增：

2.1依据所需检测样本数目准备干粉反应管，将反应管置于离心机内，4000rpm瞬时离心3-5秒(如无离心机可用手臂轻甩干粉反应管)后，方可开盖。建议每次检测均设置阴性对照。

2.2一管反应管中依次加入45.5μL A Buffer、2μL阴性对照，在管盖上加入2.5μLB Buffer，盖上管盖，轻柔颠倒6-8次，勿要剧烈震荡，作为阴性对照。

2.3反应管中依次加入45.5μL A Buffer、2μL灭活样本，在管盖上加入2.5μL BBuffer，盖上管盖，轻柔颠倒6-8次，勿要剧烈震荡。

2.4将反应管置于离心机内，4000rpm瞬时离心3-5秒(如无离心机可用手臂轻甩反应管)。

2.5将反应管置于恒温装置上，42℃，20min。

3.检测：

3.1将步骤2中经过反转录、扩增的产物反应管取出(不可开盖)，放入固定盒(内芯)中，同时检测有无漏液，合上固定盒后将其装入装置外盒。

3.2按手柄至检测装置于关闭状态。

3.3将检测装置竖立放置于水平操作台上，5分钟后即可进行结果判读。

检测结果判读：

阳性：试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)出现一条红色条带，表明样本中含有新型冠状病毒。

阴性：试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)未出现条带，表明样本中不含有新型冠状病毒，或样本病毒含量低于本试剂盒的最低检出限。

无效：试纸条质控区(C线)未出现红色条带，表明试剂盒已损坏、失效或者操作流程有误。

为获得最佳反应时间，在1000拷贝的模板下，分别在15min，20min，25min进行反应，其结果如下表所示，确认20min后反应基本完成，最佳反应时间为20min。

不同时间扩增产物浓度定量

时间	15min	20min	25min
				浓度	12.36ng/ul	18.75ng/ul	18.52ng/ul

为获得最佳反应温度，在42℃，37℃，30℃，25℃，20℃条件下检测，结果如图1，从左至右依次为42℃，37℃，30℃，25℃，20℃温度下试纸显色结果，判断42℃为最佳反应温度。

特异性分析：使用SARS同源质粒、甲型流感病毒、冠状病毒229E作为模板，每个样本重复2次，未检出阳性。图2从左至右依次为使用SARS同源质粒x2、流感病毒x2、冠状病毒229Ex2作为模板检测结果。

灵敏度分析：图3为不同浓度质粒反应检测结果，从左至右质粒浓度依次为10^4,，10³，10²，10¹，10⁰，从试纸显色结果判断在100拷贝可以检出。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 迪飞医学科技（南京）有限公司

<120> 一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组

<130> /

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

gatccacaga cacttgagat tcttgacatt ac 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

cattagaacc tgtagaataa acacgccaag 30

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

aacaaatact tctaaccagg ttgctgttct ttatcaggat gttaact 47

Claims

1.一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组，其特征在于，

正向引物为：5’-gatccacagacacttgagattcttgacattac-3’；

反向引物为：5’-cattagaacctgtagaataaacacgccaag-3’；

探针序列为：5’-AACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTT/idsp/ ATCAGGATGTTAACT-3’block，其中5’端标记抗原基团，3’端连接封闭基团。

2.权利要求1所述检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增引物探针组在制备检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒中的应用。

3.一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）灭活裂解液；

（2）恒温扩增体系：反应缓冲液BufferA、醋酸镁BufferB、阴性对照、无核酸酶水、权利要求1所述引物探针组和RAA酶。

4.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01-0.1M 的NaOH，体积比为0.1%-0.5%的 TWEEN-20，体积比0.1%-1% 的Triton X-100。

5.根据权利要求4所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述灭活裂解液包括摩尔浓度为0.01M的 NaOH，体积比为0.5% 的TWEEN-20，体积比为0.1%的Triton X-100。

6.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述恒温扩增体系中引物探针组和RAA酶制成干粉态。

7.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述RAA酶包括逆转录酶，链置换DNA聚合酶，重组酶，单链DNA结合蛋白，NFO酶。

8.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述BufferA包括摩尔浓度为50 mM 的Tris pH 8.4, 80 mM 的Potassium acetate, 10 mM的Magnesium acetate, 1 mM的DTT, 3 mM 的ATP ，20 mM 的Phosphocreatine, 100 ng/ul的Creatine kinase和质量浓度为5%的 PEG compound。

9.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述BufferB包括摩尔浓度为250mM的醋酸镁。

10.根据权利要求3所述一种检测SARS-COV-2病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸检测试纸条。