CN114686621A - 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合rpa的检测方法 - Google Patents
一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合rpa的检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114686621A CN114686621A CN202210440506.9A CN202210440506A CN114686621A CN 114686621 A CN114686621 A CN 114686621A CN 202210440506 A CN202210440506 A CN 202210440506A CN 114686621 A CN114686621 A CN 114686621A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer
- detection
- probe
- mixing
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 title claims abstract description 30
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title abstract description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title abstract description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 26
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 12
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 38
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 36
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 19
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 12
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 11
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 9
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 8
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 6
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 claims description 6
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims description 6
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical group C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000956 alloy Substances 0.000 claims 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 241001112090 Pseudovirus Species 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710116602 DNA-Binding protein G5P Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710162453 Replication factor A Proteins 0.000 description 1
- 101710176758 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit Proteins 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 101710176276 SSB protein Proteins 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 101710126859 Single-stranded DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 210000005181 root of the tongue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合RPA的检测方法，涉及病毒检测技术领域。具体通过硅基磁珠实现对目标病毒核酸的提取，进一步进行RPA反应，得到大量的核酸，最后通过荧光检测，实现对新型冠状病毒COVID‑19的检测。本发明检测方法具有方便、特异性强、灵敏度高的优点，与RT‑PCR相比，大大缩短了检测时间，实现高效快速检测新型冠状病毒的目的。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，更具体的说是涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合RPA的检测方法。
背景技术
新型冠状病毒，世界卫生组织将其命名为“2019新型冠状病毒”(COVID-19)，该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难，严重者表现为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，难以纠正的代谢性酸中毒和凝血功能障碍。且该病毒在环境中可存活数小时或数天，存在潜在致病风险，因此，研发一种高效准确的新型冠状病毒检测方法迫在眉睫。
确诊病例需有病原学证据阳性结果(RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。核酸检测技术是最直接、最本质的病原学证据，是确诊SARS-CoV-2感染的“金标准”，优于其他临床表现、临床体征等经验判读。目前用于检测SARS-CoV-2的常规方法为RT-PCR，该方法能够从鼻腔或咽拭子、痰液或支气管肺泡灌洗液中检测COVID-19。RT-PCR在一定程度上提高了对病毒检测的准确性，但需要专业人员、专业设备配套，且耗时较长，无法实现居家检测，不利于疫情的筛选与防控。
因此，提供一种快速检测新型冠状病毒是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合RPA的检测方法。通过硅基磁珠实现对目标病毒核酸的提取，从而进行RPA反应，得到大量的核酸，最后通过荧光检测，实现对新型冠状病毒COVID-19的检测。本发明检测方法具有方便、特异性强、灵敏度高的优点，与RT-PCR相比，大大缩短了检测时间，实现高效快速检测新型冠状病毒的目的。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括以下引物对和探针：
上游引物F：5’-CCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAAC-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物R：5’-AGTGACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTT-3’，SEQ ID NO.2；
探针P：5’-TAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTTGCTTTGCTGCTGCTT-3’，SEQ IDNO.3。
所述探针P采用荧光淬灭基团和荧光报告基团进行修饰，荧光淬灭基团修饰在探针序列离5’端碱基数28bp的位置上；荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数33bp的位置上，荧光淬灭基团与报告基团之间间隔4个碱基GCTT，其中离5’端碱基数30bp的位置上的C用四氢呋喃残基替换；3’端采用磷酸盐修饰用以阻断链的延伸。
作为优选的技术方案，所述试剂盒，还包括：Buffer C、Buffer D和ddH2O；
所述Buffer C为50mM Tris(pH 8.4)、80mM乙酸钾、2mM DTT、3mM ATP、200μMdNTPs、20mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20M；
所述BufferD为20mM乙酸镁。
作为优选的技术方案，所述试剂盒，总体积50μL，包括2μL上游引物F、2μL下游引物R、0.6μL探针P、29.4μL Buffer C、2.5μL Buffer D、ddH2O和模板13.5μL；
且，所述上游引物F、下游引物R和探针P的浓度均为10μM。
本发明的另一目的，提供一种基于磁珠富集结合RPA的非诊断治疗目的的新型冠状病毒检测方法，利用上述任一试剂盒。
作为优选的技术方案，所述的检测方法，包括以下步骤：
(1)富集核酸：采集样本，加入离心管中，再加入BufferA和硅基磁珠，置于混匀仪上混匀3min，静置5-10min，离心后，磁分离3min后去上清；
再加入BufferB，置于混匀仪上混匀后，磁分离3min后去上清液；
再加入WashBuffer，置于混匀仪上混匀，磁分离1min后去上清液；
离心管于20～25℃敞口放置10-15min；
往离心管中加入20μL ddH2O重悬，于混匀仪上混匀，离心将反应液甩至管底后，于65℃水浴10min，磁分离30s，得到纯化的核酸模板；
(2)RPA检测：向干粉反应管中加入Buffer C；然后加入上游引物F、下游引物R和探针P；再依次加入ddH2O和步骤(1)所得核酸模板；最后加入BufferD，上下颠倒甩动反应管进行混匀；
离心将反应液甩至管底，立即放入荧光检测设备中，42℃反应20min，采集并分析结果。
本发明通过硅基磁珠提取目标病毒核酸，随后在重组酶和结合蛋白存在的条件下，使得核酸扩增能在42℃条件下快速进行RPA反应，得到大量的核酸，最后通过荧光检测，可在20min内实现对新型冠状病毒COVID-19的检测。
硅基磁珠依靠静电作用、疏水作用和氢键作用等吸附在裂解液的作用下释放出来的核酸，形成核酸-磁珠复合体。该复合体经过磁分离后，从生物裂解液中分离出来。其后复合体经过盐洗涤去除非特异性吸附的杂质、醇洗涤去除盐分后，得到纯化的RNA。RPA是一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物DNA和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。反应在42℃下，依赖核酸外切酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用荧光监测设备能实现对目标片段扩增过程的实时监控，以快速实现对目标序列的检测。
优选的，所述BufferA为118.16g异硫氰酸胍盐、0.2M EDTA(pH 8.0)和100mL 0.1MTris-HCl(pH 6.5)；所述BufferB为1.477g异硫氰酸胍盐、100mL 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)和150mL无水乙醇；Wash Buffer为乙醇，浓度为70％vol；Buffer C为50mM Tris(pH 8.4)、80mM乙酸钾、2mM DTT、3mM ATP、200μM dNTPs、20mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20M；Buffer D为20mM乙酸镁。且所述Buffer缓冲液均为无菌的。
优选的，步骤(1)所述硅基磁珠表面修饰硅羟基，且粒径大于1μm。
优选的，步骤(1)所述磁分离的磁场强度为0.4T。
优选的，步骤(1)所述BufferA和硅基磁珠、所述BufferB、所述Wash Buffer相对于样本均是过量的，且硅基磁珠用量为100μL(25mg/mL)。
优选的，步骤(2)所述Buffer C添加量29.4μL，所述上游引物F添加量2μL、所述下游引物R添加量2μL、所述探针P添加量0.6μL，所述ddH2O添加量11.5μL，所述核酸模板添加量2μL，所述Buffer D添加量2.5μL，
且，所述上游引物F，所述下游引物R和所述探针P的浓度为10μM。
优选的，步骤(2)采集的是475nm的荧光值，且每隔30s采集一次。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本方法反应条件为恒温，操作简单、快速高效，仅需20min，便于居家快速检测；
2、本方法灵敏度高、特异性好，能够检测到至少10拷贝/μL的新型冠状病毒COVID-19。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明原理示意图；
图2附图为本发明对缓冲液中新型冠状病毒COVID-19灵敏度的验证；
图3附图为本发明对咽拭子加标样本中新型冠状病毒COVID-19灵敏度的验证。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合RPA的检测方法，所用原料均为市售可得，对其来源不做具体限定，所涉及的方法，如无特殊提及，均为常规方法，在此不再一一赘述。
实施例1
根据COVID-19N gene序列设计引物和探针。
上游引物F：5’-CCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAAC-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物R：5’-AGTGACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTT-3’，SEQ ID NO.2；
探针P：5’-TAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTTGCTTTGCTGCTGCTT-3’，SEQ IDNO.3。
所述探针P采用荧光淬灭基团和荧光报告基团进行修饰，荧光淬灭基团修饰在探针序列离5’端碱基数28bp的位置上；荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数33bp的位置上，荧光淬灭基团与报告基团之间间隔4个碱基GCTT，其中离5’端碱基数30bp的位置上的C用四氢呋喃残基替换；3’端采用磷酸盐修饰用以阻断链的延伸。
实施例2
(1)富集核酸：将从达安基因获得的新型冠状病毒COVID-19假病毒用磷酸盐缓冲液稀释至不同浓度后，加入离心管中，再加入900μL Buffer A和100μL硅基磁珠(25mg/mL)，置于混匀仪上混匀3min，静置5-10min，随后离心，磁分离3min，去上清；将900μL Buffer B加入上述复合液中，置于混匀仪上混匀，磁分离3min，后吸去上清液；随后加入900μL WashBuffer，置于混匀仪上混匀，磁分离1min后吸去上清液；离心管于20～25℃敞口放置10-15min；上述离心管中加入20μL ddH2O重悬，于混匀仪上混匀，稍离心后将离心管置于65℃，水浴10min，磁分离30s，得到纯化的核酸模板；
其中，磁分离的磁场强度为0.4T；
Buffer A：118.16g异硫氰酸胍盐、0.2M EDTA(pH 8.0)和100mL0.1M Tris-HCl(pH6.5)；
Buffer B：1.477g异硫氰酸胍盐、100mL 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)和150mL无水乙醇；
Wash Buffer：70％vol乙醇。
(2)RPA检测：将Buffer C取出，完全融化并混匀，向干粉反应管加入29.4μLBuffer C；
向反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM；
向反应管中依次加入11.5μL ddH2O和2μL核酸模板；
最后向反应管中加入2.5μL Buffer D并充分混合，上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；
混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min，采集结果，分析结果及作图(每组实验重复3次)；
其中：Buffer C：50mM Tris(pH 8.4)、80mM乙酸钾、2mM DTT、3mM ATP、200μMdNTPs、20mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20M；
Buffer D：20mM乙酸镁。
(2)试验结果：(本实施例发明原理参见附图1，本实施例结果参见附图2)
由附图2可知，本实施例对缓冲液中的新型冠状病毒COVID-19具有理想的检测结果，检测限为10拷贝/μL。
实施例3
(1)富集核酸：参考新冠病毒样本采集和检测技术指南，选取实验室新冠检测阴性人员作为被采集人员，并让其先用生理盐水漱口，随后采样人员将拭子放入无菌生理盐水中湿润，被采集人员头部微仰，嘴张大，并发“啊”音，露出两侧扁桃体，将拭子越过舌根，在被采集者两侧扁桃体稍微用力来回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次，将拭子头浸入含2～3mL磷酸盐缓冲液的管中，尾部弃去，旋紧管盖，即获得咽拭子阴性样本。随后用咽拭子阴性样本溶液将从达安基因获得的新型冠状病毒COVID-19假病毒稀释至不同浓度，再加入900μLBuffer A和100μL的硅基磁珠(25mg/mL)，置于混匀仪上混匀3min，静置5-10min，随后离心，磁分离3min，去上清；将900μLBuffer B加入上述复合液中，置于混匀仪上混匀，磁分离3min，后吸去上清液；随后加入900μLWash Buffer，置于混匀仪上混匀，磁分离1min后吸去上清液；离心管于20～25℃敞口放置10-15min；上述离心管中加入20μLddH2O重悬，于混匀仪上混匀，稍离心后将离心管置于65℃，水浴10min，磁分离30s，得到纯化的核酸模板；
其中，磁分离的磁场强度为0.4T；
Buffer A：118.16g异硫氰酸胍盐、0.2M EDTA(pH 8.0)和100mL0.1M Tris-HCl(pH6.5)；
Buffer B：1.477g异硫氰酸胍盐、100mL 0.1M Tris-HCl(pH 7.5)和150mL无水乙醇；
Wash Buffer：70％vol乙醇。
(2)RPA检测：将Buffer C取出，完全融化并混匀，向干粉反应管加入29.4μLBuffer C；
向反应管分别加入2μL上游引物、2μL下游引物和0.6μL探针(引物和探针浓度为10μM；
向反应管中依次加入11.5μL ddH2O和2μL核酸模板；
最后向反应管中加入2.5μL Buffer D并充分混合，上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；
混匀后，将反应液甩(或快速离心)至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中。荧光检测程序设置为：恒温42℃；每30s采集一次FAM通道荧光值；反应时间20min，采集结果，分析结果及作图(每组实验重复3次)；
其中：Buffer C：50mM Tris(pH 8.4)、80mM乙酸钾、2mM DTT、3mM ATP、200μMdNTPs、20mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20M；
Buffer D：20mM乙酸镁。
(3)试验结果：(本实施例结果参见附图3)
由附图3可知本方案对加标样本中新型冠状病毒COVID-19的检测限可以达到10拷贝/μL，表明本方案能够实现对加标样本中的新型冠状病毒COVID-19的检测。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 南昌大学第一附属医院
<120> 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合RPA的检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctcttctcg ttcctcatca cgtagtcgca ac 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agtgacagtt tggccttgtt gttgttggcc tt 32
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagaatggct ggcaatggcg gtgatgctgc ttgctttgct gctgctt 47
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，包括以下引物对和探针：
上游引物F：5’-CCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAAC-3’，SEQ ID NO.1；
下游引物R：5’-AGTGACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTT-3’，SEQ ID NO.2；
探针P：5’-TAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTTGCTTTGCTGCTGCTT-3’，SEQ ID NO.3，
所述探针P采用荧光淬灭基团和荧光报告基团进行修饰，荧光淬灭基团修饰在探针序列离5’端碱基数28bp的位置上；荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数33bp的位置上，荧光淬灭基团与报告基团之间间隔4个碱基GCTT，其中离5’端碱基数30bp的位置上的C用四氢呋喃残基替换；3’端采用磷酸盐修饰用以阻断链的延伸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括：Buffer C、Buffer D和ddH2O；
所述Buffer C为50mM Tris pH 8.4、80mM乙酸钾、2mM DTT、3mM ATP、200μM dNTPs、20mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20M；
所述Buffer D为20mM乙酸镁。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，总体积50μL，包括2μL上游引物F、2μL下游引物R、0.6μL探针P、29.4μL Buffer C、2.5μL Buffer D、ddH2O和模板13.5μL；
且，所述上游引物F、下游引物R和探针P的浓度均为10μM。
4.一种基于磁珠富集结合RPA的非诊断治疗目的的新型冠状病毒检测方法，其特征在于，利用权利要求1-3任一所述的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)富集核酸：采集样本，加入离心管中，再加入BufferA和硅基磁珠，置于混匀仪上混匀3min，静置5-10min，离心后，磁分离3min后去上清；
再加入Buffer B，置于混匀仪上混匀后，磁分离3min后去上清液；
再加入Wash Buffer，置于混匀仪上混匀，磁分离1min后去上清液；
离心管于20～25℃敞口放置10-15min；
往离心管中加入20μL ddH2O重悬，于混匀仪上混匀，离心将反应液甩至管底后，于65℃水浴10min，磁分离30s，得到纯化的核酸模板；
(2)RPA检测：向干粉反应管中加入Buffer C；然后加入上游引物F、下游引物R和探针P；再依次加入ddH2O和步骤(1)所得核酸模板；最后加入Buffer D，上下颠倒甩动反应管进行混匀；
离心将反应液甩至管底，立即放入荧光检测设备中，42℃反应20min，采集并分析结果。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述Buffer A为118.16g异硫氰酸胍盐、0.2M EDTA pH 8.0和100mL 0.1M Tris-HCl pH 6.5；Buffer B为1.477g异硫氰酸胍盐、100mL 0.1M Tris-HCl pH 7.5和150mL无水乙醇；
Wash Buffer为乙醇，浓度为70％vol；
Buffer C为50mM Tris pH 8.4、80mM乙酸钾、2mM DTT、3mM ATP、200μM dNTPs、20mM磷酸肌酸、100ng/μL肌酸激酶和5％聚乙二醇20M；
Buffer D为20mM乙酸镁。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述硅基磁珠表面修饰硅羟基，且粒径大于1μm。
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述磁分离的磁场强度为0.4T。
9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述Buffer C添加量29.4μL，所述上游引物F添加量2μL、所述下游引物R添加量2μL、所述探针P添加量0.6μL，所述ddH2O添加量11.5μL，所述核酸模板添加量2μL，所述Buffer D添加量2.5μL，
且，所述上游引物F，所述下游引物R和所述探针P的浓度为10μM。
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)采集的是475nm的荧光值，且每隔30s采集一次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210440506.9A CN114686621A (zh) | 2022-04-25 | 2022-04-25 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合rpa的检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210440506.9A CN114686621A (zh) | 2022-04-25 | 2022-04-25 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合rpa的检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114686621A true CN114686621A (zh) | 2022-07-01 |
Family
ID=82144510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210440506.9A Pending CN114686621A (zh) | 2022-04-25 | 2022-04-25 | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合rpa的检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114686621A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111074007A (zh) * | 2020-02-15 | 2020-04-28 | 上海迪飞医学检验实验室有限公司 | 一种检测sars-cov-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组 |
| CN111549182A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-18 | 广州再生医学与健康广东省实验室 | 用于检测SARS-CoV-2的探针及试剂盒 |
| EP3985128A1 (en) * | 2020-10-14 | 2022-04-20 | midge medical GmbH | Isothermal nucleic acid amplification methods for point-of-need diagnosis of emerging infectious diseases |
-
2022
- 2022-04-25 CN CN202210440506.9A patent/CN114686621A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111074007A (zh) * | 2020-02-15 | 2020-04-28 | 上海迪飞医学检验实验室有限公司 | 一种检测sars-cov-2病毒的恒温扩增试剂盒及引物探针组 |
| CN111549182A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-18 | 广州再生医学与健康广东省实验室 | 用于检测SARS-CoV-2的探针及试剂盒 |
| EP3985128A1 (en) * | 2020-10-14 | 2022-04-20 | midge medical GmbH | Isothermal nucleic acid amplification methods for point-of-need diagnosis of emerging infectious diseases |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JIA LI等: "Review: a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification" * |
| 肖性龙: "多重荧光PCR与液相芯片高通量病原体检测体系的建立与应用" * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110982943B (zh) | 一种新型冠状病毒rt-pcr检测方法及试剂盒 | |
| CN111187858A (zh) | 新型冠状病毒检测试剂盒 | |
| CN105441595B (zh) | 一种用于检测hbv-b/c的数字pcr绝对定量分型检测试剂盒 | |
| JP2012080884A (ja) | 核酸検出 | |
| CN110578017A (zh) | 一种同步检测二十三种呼吸道病原体的试剂盒及其检测方法 | |
| CN112981011B (zh) | 一种检测SARS-CoV-2的引物组合物及其应用 | |
| CN112080585A (zh) | 一种新型冠状病毒（SARS-CoV-2）快速检测试剂盒及其方法 | |
| CN111560478B (zh) | 一种一步法反转录PCR结合Sanger测序检测新型冠状病毒的试剂盒 | |
| CN113943836B (zh) | 检测引起呼吸道感染的病原体并鉴定病原体种类的组合物、试剂盒、方法及用途 | |
| CN112695134A (zh) | 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测引物组、探针组及检测试剂盒和检测方法 | |
| CN111521781B (zh) | 一种用于新冠肺炎病毒SARS-CoV-2核酸的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN112662809A (zh) | 一种用于新型冠状病毒covid-19检测的核酸组合物及其应用 | |
| CN113293165B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用 | |
| CN113174426B (zh) | 一种rca-纳米磁珠复合物及其制备与应用 | |
| CN111676218B (zh) | SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物 | |
| CN109680101B (zh) | 一种区分h7n9亚型禽流感病毒强弱毒的快速检测方法 | |
| CN112662808A (zh) | 一种新型冠状病毒covid-19核酸检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN111647685A (zh) | 一种检测covid-19病毒的引物组、探针组和试剂盒及其应用 | |
| CN114686621A (zh) | 一种新型冠状病毒检测试剂盒及基于磁珠富集结合rpa的检测方法 | |
| CN112011595A (zh) | 一种针对SARS-CoV-2病毒的全基因组扩增方法及应用及测序方法及试剂盒 | |
| CN113736913B (zh) | 基于病毒核酸与miRNA双向共生检测2019-nCoV的方法及试剂盒 | |
| Nikpey et al. | Nanomolecular Magnetic Probe for Colorimetric RT-LAMP of Viral RNA | |
| CN115491431A (zh) | 基于基因编辑技术检测日本乙型脑炎病毒核酸的检测试剂盒及应用 | |
| CN111172320A (zh) | 呼吸道合胞病毒f基因的检测引物、试剂盒及方法 | |
| CN111793716A (zh) | 一种检测2019新型冠状病毒的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220701 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |