CN113293165B - 一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR‑Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用，属于戊型肝炎病毒(HEV)检测技术领域。本发明提供了基于CRISPR‑Cas12a技术的HEV特异crRNA包括四条g RNA。实验表明crRNA中四条gRNA能够特异性靶向特定的四种基因型的HEV，具有较高的结合特异性。本发明提供检测HEV试剂盒包括HEV特异crRNA、CRISPR‑Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统。本发明将等温扩增技术与CRISPR‑Cas12a技术相结合。该方法检测限可达10copies/μl，且特异性良好，为临床诊断和实验室研究提供了一种准确、快速、简便的检测手段。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于戊型肝炎病毒的基因检测技术领域，具体涉及一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用。
背景技术
戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的急性病毒性肝炎，简称戊肝。戊型肝炎的传播方式、临床表现和预后均与甲型肝炎(Hepatitis A，HA)类似，不同之处在于，HEV主要侵犯青壮年，65％以上发生于16～19岁年龄组，儿童感染表现亚临床型较多，其成人病死率高于甲型肝炎，尤其孕妇患戊型肝炎病情较重，在妊娠的后三个月发生感染的病死率高达20％。HEV主要通过粪口途径传播，被污染的食物和水源可引起散发或暴发流行。HEV不仅可以感染人类，在动物中也广泛存在与传播。据世界卫生组织(WHO)的数据显示，HEV感染已经成为全球范围内的公共卫生问题。
HEV为呈二十面体对称的球状病毒颗粒，无包膜，表面粗糙，有突起和缺刻，平均直径为27～34nm，其在胞浆内装配，呈晶格状排列，可形成包涵体。HEV是一种单股、正链RNA病毒，共分为4个基因型(HEV 1～HEV4)，其基因组全长约7.2kb，5′端有帽子结构，3′端有polyA尾，编码区包含有3个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，在编码区前后又有长度分别为25nt和65nt的非编码区。
最初对戊肝主要是根据病人的临床表现结合流行病学特征加以诊断，随着对HEV研究的不断深入及检测技术的持续发展，近几年已经建立了诸如荧光定量PCR，ELISA，免疫电镜等一系列实验室诊断方法，在对戊肝的精确诊断中发挥了巨大作用。但是这些技术有其各自的局限，如操作门槛高，依赖大型设备，灵敏度特异性不足等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，所述crRNA能特异性靶向HEV的四个基因型，便于后续四种基因型的HEV的检测。
本发明的目的还在于提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的HEV检测试剂盒及其应用，能够实现同时对HEV的四个基因型检测，且具有较高的检测灵敏度，且操作简便。
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，所述HEV特异crRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的g RNA。
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术检测不同基因型HEV的试剂，包括所述HEV特异crRNA和CRISPR-Cas12a蛋白酶。
优选的，还包括单链DNA报告系统。
优选的，所述单链DNA报告系统包括5'端标记荧光基团同时3'端标记荧光淬灭基团的单链核苷酸。
优选的，所述单链DNA报告系统包括5'-6FAM-TTATTT-BHQ1-3'、5'-6FAM-TTATTT-TRAMA-3'或5'-HEX-TTATTT-IABkFQ-3'。
本发明提供了所述HEV特异crRNA或所述试剂在制备检测HEV的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的检测HEV试剂盒，包括所述HEV特异crRNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统。
优选的，还包括HEV的cDNA等温扩增试剂。
优选的，所述HEV的cDNA等温扩增试剂包括RPA等温扩增用引物；
所述RPA等温扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的HEV检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本的RNA，经逆转录，得到cDNA；
2)将步骤1)中所述cDNA进行等温扩增，得到扩增产物；
3)将所述扩增产物与所述HEV特异crRNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统混合，得到检测反应体系；
4)将步骤3)中所述检测反应体系进行荧光定量PCR检测，根据有无荧光信号判断待测样本中有无HEV。
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，所述HEV特异crRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的gRNA。实验结果表明，每条gRNA除与对应的基因型HEV发生结合外，与其他三种基因型HEV均不能发生结合，这表明所述crRNA中4条gRNA能够特异性靶向特定的4种基因型的HEV，具有较高的结合特异性，这为后续检测4种基因型的HEV提供了基础。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的HEV检测方法，本发明通过将等温扩增技术与CRISPR-Cas12a技术相结合，首次实现了对戊型肝炎病毒核酸的高灵敏度，高特异性检测。实验结果显示，此方法检测限可达10copies/μl，且特异性良好，为临床诊断和实验室研究提供了一种准确、快速、简便的检测手段。
附图说明
图1为本发明提供的基于CRISPR-Cas12a技术检测HEV的示意图；
图2为四种型别的HEV的检测结果；
图3为引物对RPA-4F/4R扩增条带电泳结果；
图4为CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV核酸灵敏度验证实时荧光信号；
图5为CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV核酸灵敏度验证结果；
图6为CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV核酸特异性验证结果；
图7为CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV临床样本结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，所述HEV特异crRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的g RNA。序列SEQ ID NO：1所示g RNA可特异性靶向基因HEV-1型的序列(SEQ ID NO：7)，序列SEQ ID NO：2所示g RNA可特异性靶向基因HEV-2型的序列(SEQ ID NO：8)，序列SEQ ID NO：3所示g RNA可特异性靶向基因HEV-2型的序列(SEQ ID NO：9)，序列SEQ ID NO：4所示g RNA可特异性靶向基因HEV-2型的序列(SEQ ID NO：10)。
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术检测不同基因型HEV的试剂，包括所述HEV特异crRNA和CRISPR-Cas12a蛋白酶。所述试剂优选还包括单链DNA报告系统。所述单链DNA报告系统包括5'端标记荧光基团同时3'端标记荧光淬灭基团的单链核苷酸。所述单链DNA报告系统包括5'-6FAM-TTATTT-BHQ1-3'、5'-6FAM-TTATTT-TRAMA-3'或5'-HEX-TTATTT-IABkFQ-3'。本发明对所述CRISPR-Cas12a蛋白酶的来源不做特殊限制，采用本领域所熟知的CRISPR-Cas12a蛋白酶即可。本发明对所述HEV特异crRNA的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的基因序列人工合成方法即可。
在本发明中，所述试剂的检测原理见图1。当CRISPR-Cas12a检测体系中存在HEV靶标基因时，crRNA与HEV靶标基因特异性结合，激活CRISPR-Cas12a蛋白酶，使CRISPR-Cas12a蛋白酶切割由荧光基团和淬灭基团标记的单链DNA报告系统，从而释放荧光基团，使荧光定量PCR仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中若不存在靶标基因序列，荧光读数显示为基底值。
本发明提供了所述HEV特异crRNA或所述试剂在制备检测HEV的试剂盒中的应用。
本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a技术的检测HEV试剂盒，包括所述HEV特异crRNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统。所述试剂盒优选还包括HEV的cDNA等温扩增试剂。本发明对所述HEV的cDNA等温扩增的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的等温扩增的方法即可，例如环介导等温扩增(LAMP)、RPA等温扩增、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)、切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)等。本发明实施例中，采用RPA等温扩增方法对HEV的cDNA进行扩增。所述HEV的cDNA等温扩增试剂优选包括RPA等温扩增用引物。所述RPA等温扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对。
本发明提供了一种非疾病诊断目的的HEV检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测样本的RNA，经逆转录，得到cDNA；
2)将步骤1)中所述cDNA进行等温扩增，得到扩增产物；
3)将所述扩增产物与所述HEV特异crRNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统混合，得到检测反应体系；
4)将步骤3)中所述检测反应体系进行荧光定量PCR检测，根据有无荧光信号判断待测样本中有无HEV。
本发明提取待测样本的RNA，经逆转录，得到cDNA。
本发明对提取待测样本的RNA和逆转录的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取待测样本的RNA和逆转录的方法即可。
得到cDNA后，本发明将所述cDNA进行等温扩增，得到扩增产物。
本发明所述HEV的cDNA等温扩增的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的等温扩增的方法即可，例如环介导等温扩增(LAMP)、RPA等温扩增、依赖于解旋酶的等温扩增技术(HAD)、切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)等。本发明实施例中，采用RPA等温扩增方法对HEV的cDNA进行扩增。所述HEV的cDNA等温扩增试剂优选包括RPA等温扩增用引物。所述RPA等温扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对。
得到扩增产物后，本发明将所述扩增产物与所述HEV特异crRNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统混合，得到检测反应体系。
在本发明中，所述检测反应体系优选为20μL体系，具体包括以下体积的试剂：1μMCas12a蛋白酶2.5μl、1μM crRNA 3μl、单链DNA报告系统1μM 2.5μl和扩增产物12μl。
得到检测反应体系后，本发明将所述检测反应体系进行荧光定量PCR检测，根据有无荧光信号判断待测样本中有无HEV。
在本发明中，所述检测的温度优选为37℃，所述检测的时间为120min。所述检测优选每1min监测一次信号。
在本发明中，所述检测方法对HEV进行检测，检测限为101copies/μl。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于CRISPR-Cas12a技术HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
基于CRISPR/Cas12a系统的HEV核酸检测靶点的确认
获取HEV四个型别的代表性毒株的全基因组序列，通过生物信息学比对分析，确定不同型别分离株基因组的特异性保守区域(核苷酸序列见SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:10)，针对4个型别HEV的保守区域设计gRNA(SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4)。
HEV-1型的检测区域如SEQ ID NO：7所示(AGGCAGACCACATATGTGGTCGATGCCATGGAGGCCCATCAGTTTATTAAGGCTCCTGGCATCACTACTGCTATTGAGCAGGCTGCTCTAGCAGCGGCCAACTCTGCCCTGGCGAATGCTGTGGTAGTTAGGCCTTTTCTCTCTCACCAGCAGATTGAGATCCTCATTAACCTAATGCAACCTCGCCAGCTTGTTTTCCGCCCCGAGGTTTTCTGGAATCATCCCATCCAGCGTGTCATCCATAACGAGCTGGAGCTTTACTGCCGCGCCCGCTCCGGCCGCTGTCTTGAAATTGGCGCCCATCCCCGCTCAATAAATGATAATCCTAATGTGGTCCACCGCTGCTTCCTCCGCCCTGTTGGGCGTGATGTTCAGCGCTGGTATACTGCTCCCACTCGCGGGCCGGCTGCTAATTGCCGGCGTTCCGCGCTGCGCGGGCTTCCCGCTGCTGACCGCACTTA)。
HEV-2型的检测区域如SEQ ID NO：8所示(TAGACATTACAGGCTCATACATCGTGGATGGTCGGTCTCTGCAAACTGTCTATCAAGCTCTCGACCTGCCAGCTGACCTGGTAGCTCGCGCAGCCCGACTGTCTGCTACAGTTACTGTTACTGAAACCTCTGGCCGTCTGGATTGCCAAACAATGATCGGCAATAAGACTTTTCTCACTACCTTTGTTGATGGGGCACGCCTTGAGGTTAACGGGCCTGAGCAGCTTAACCTCTCTTTTGACAGCCAGCAGTGTAGTATGGCAGCCGGCCCGTTTTGCCTCACCTATGCTGCCGTAGATGGCGGGCTGGAAGTTCATTTTTCCACCGCTGGCCTCGAGAGCCGTGTTGTTTTCCCCCCTGGTAATGCCCCGACTGCCCCGCCGAGTGAGGTCACCGCCTTCTGCTCAGCTCTTTATAGGCACAACCGGCAGAGCCAGCGCCAGTCGGTTATTGGTAGTTTGTGGCTGCACCCTGAAGG)。
HEV-3型的检测区域如SEQ ID NO：9所示(GGCAGACCACGTATGTGGTCGATGCCATGGAGGCCCACCAGTTTATTAAGGCTCCTGGCATTACTACTGCCATTGAGCAGGCTGCTCTGGCTGCGGCCAACTCCGCCTTGGCGAATGCTGTGGTGGTTCGGCCGTTTTTGTCTCGCGTGCAAACCGAGATCCTTATTAATTTGATGCAACCCCGGCAGTTGGTTTTCCGCCCTGAGGTGCTTTGGAATCATCCTATTCAGAGAGTCATACACAATGAACTAGAACAATACTGCCGGGCACGGGCCGGTCGTTGCCTGGAGATTGGGGCCCACCCAAGATCTATTAATGATAACCCCAATGTTTTGCACCGGTGCTTTCTCAGACCGGTCGGTAGGGATGTTCAGCGCTGGTATTCTGCCCCCACCCGCGGCCCTG)。
HEV-4型的检测区域如SEQ ID NO：10所示(CGGGTGGAATGAATAACATGTTCTTTTGCTCTGTGCATGGCGATGCCACCATGCGCTCTCGGGCTCTTCTGTTTCTGTTCCTCCTGCTTTTGCCTATGCTGCCCGCGCCACCGGCCGGTCAGCCGTCTGGCCGTCGCCGCGGGCGGCGCAGCGGCGGTGCCGGCGGTGGTTTCTGGGGTGACCGGGTTGATTCTCAGCCCTTCGCCCTCCCCTATATTCATCCAACCAACCCCTTCGCATCTGACATTCCAGCCGCCGCCGGGGCTGGAGCTCGCCCTCGACAGCCAGCCCGTCCACTCGGTTCCGCTTGGCGCGACCAATCCCAGCGCCCCGCCGCTCCCGCCCGTCGTCGATCTACCCCAGCTGGGGCTTCGCCG)。
HEV-1型的gRNA如SEQ ID NO：1所示(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCUCUCACCAGCAGAUUGA)。
HEV-2型的gRNA如SEQ ID NO：2所示(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACAGCCAGCAGUGUAGUAUG)。
HEV-3型的gRNA如SEQ ID NO：3所示(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUGCAACCCCGGCAGUUGGU)。
HEV-4型的gRNA如SEQ ID NO：4所示(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGGGGUGACCGGGUUGAUUC)。
采用CRISPR/Cas12a系统验证四种gRNA与保守靶向区域的结合性，具体方法如下：
1)人工合成四种靶向区域DNA片段；
2)配制检测体系如下：总体系为20μL，具体包括以下试剂：1μM Cas12a 2.5μl、1μMcrRNA(单条，SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4)3μl、1μM ssDNA报告系统2.5μl、靶向区域DNA片段(单条，SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：10)12μl；
3)将配制的检测体系置于荧光定量PCR仪监测反应的荧光，条件设置为37℃，反应120min，每1min监测信号，绘制4种型别的HEV对应的荧光信号柱形图。
结果见图2。结果表明，以SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：10所示区域序列为基于CRISPR/Cas12a系统的HEV核酸检测位点，具有很好的检测效果。
实施例2
HEV-1～HEV-4型的gRNA的特异性检测方法
将实施例1得到的不同靶向区域序列与4种不同的gRNA按照表1所示的模板与gRNA组合方式，采用CRISPR/Cas12a检测方法进行检测。配制检测体系如下：总体系为20μL，具体包括以下试剂：1μM Cas12a 2.5μl、1μM crRNA(单条)3μl、1μM ssDNA报告系统2.5μl、靶向区域片段(单条)12μl。CRISPR/Cas12a检测体系检测不同组合特异性结果见表1。
表1CRISPR/Cas12a检测体系验证组合及实验结果
Figure BDA0003123519080000081
Figure BDA0003123519080000091
由上述表1结果可知，每条gRNA除与对应的基因型HEV发生结合外，与其他三种基因型HEV均不能发生结合，这表明所述crRNA中4条gRNA能够特异性靶向特定的4种基因型的HEV，具有较高的结合特异性。
实施例3
CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV-4型核酸灵敏度检测方法
1.1核酸制备
本实例中HEV基因片段是参考NCBI数据库中多株HEV-4型序列，经由序列比对软件筛选其共有保守序列而得到，长度为377bp，序列为SEQ NO：10。由上海生工将其合成并构建至pUC57载体，命名为pUC57-HEV-4。将其溶于水后，进行10倍梯度稀释，获得每微升含有108、107、106、105、104、103、102和101拷贝数(copy/μl)的质粒样品。
1.2RPA等温扩增
利用本发明中RPA扩增引物RPA-F和RPA-R按照RPA等温扩增操作步骤，扩增获得待检测样品。
RPA-F：TCGGGCTCTTCTGTTTCTGTTCCTCCTGCTTTTG(SEQ NO：5)；
RPA-R：TCAGATGCGAAGGGGTTGGTTGGATGAATAT(SEQ NO：6)。
具体操作如下：
配制扩增体系：采用47.5μL体系：10μM RPA-F 2.4μl、10μM RPA-R 2.4μl、Rehydrationbuffer 29.5μl、模板和水总计13.2μl。
将上述扩增体系振荡摇匀，短暂离心后，将其加入至冻干试剂中，用移液枪吹打均匀。将2.5μl 280mM的MgOAc加到离心管盖，离心将其甩下，混合均匀后在PCR仪中开始反应，条件设置为：37℃，30min。反应结束后，获得样品进行电泳检测，结果见图3。将检测合格的扩增产物备用。
1.3CRISPR-Cas12a检测体系构建
检测体系为20μL体系：Cas12a(1μM)2.5μl、crRNA(1μM)3μl、ssDNA reporter(1μM)、2.5μl；RPAproducts，12μl。体系配制完成后，振荡混匀，短暂离心，待下一步荧光信号监测。
1.4荧光定量PCR仪信号监测
使用荧光定量PCR仪监测反应的荧光，条件设置为37℃，反应120min，每1min监测信号。监测结果如图4和图5，结果显示，该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对HEV-4型的检测，检测限为101copies/μl。
实施例4
CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV核酸特异性验证
1.1核酸制备
本实例中HEV基因片段，使用与实施例2中同样的pUC57-HEV-4合成质粒，长度为377bp。HAV与NV的基因片段为本实验室留存的cDNA。
1.2RPA等温扩增
本案例中扩增体系配制，操作步骤和PCR仪条件设置均与实施例3相同。
1.3CRISPR-Cas12a检测体系构建
本案例中检测体系配制，操作步骤均与实施例3相同。
1.4荧光定量PCR仪信号监测
本案例中荧光定量PCR仪条件设置与实施例3相同。
检测结果如图6。结果显示，该发明具有较好的特异性，在检测非目标核酸时，不会出现假阳性信号。
实施例5
CRISPR-Cas12a体系结合RPA等温扩增检测HEV型临床样本
1.1核酸制备
将实验室留存的30份粪便样本分别称取1g溶于9ml PBS缓冲液中，振荡摇匀，4000g离心20min，取上清。
用
Figure BDA0003123519080000111
Viral RNAMini Kit进行病毒核酸的提取。步骤如下：
1)将310μg carrier RNA溶于310μl Buffer AVE中，得到carrier RNA-BufferAVEmix。
2)将5.6μl carrierRNA-BufferAVE mix添加到560ulBufferAVL中。
3)吸取560μl步骤2)中的混合液至1.5ml离心管中。
4)将140μl粪便上清液加入到步骤3的离心管中，涡流搅拌15s。
5)室温孵化10分钟。
6)向上述离心管中加入560μl乙醇，涡流搅拌15s，短暂离心，除去盖子内的液滴。
7)吸取630μl步骤6)中混合液至QIAamp Mini色谱柱(在2ml收集管中)，而不湿润边缘。盖上盖子，以6000×g(8000rpm)的速度离心1分钟，将色谱柱放入新的收集管中，并丢弃含有滤液的管。
8)重复步骤7)。
9)打开色谱柱，加入500μl BufferAW1。盖上盖子，以6000×g(8000rpm)的速度离心1分钟。将色谱柱放入新的收集管中(提供)，并丢弃含有滤液的管。
10)打开色谱柱，加入500μlBufferAW2。全速(20000×g；14000rpm)离心3分钟。将色谱柱放入新的收集管中，并将旧收集管与滤液一起丢弃。
11)为消除AW2的影响，全速离心1分钟。将色谱柱放入清洁的1.5ml离心管中，丢弃装有滤液的旧收集管。
12)打开色谱柱，小心地向中心加入60μlBufferAVE，平衡至室温，盖上盖子，在室温下孵化1分钟。
13)6000×g(8000rpm)离心1分钟，得到病毒RNA。
用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit对病毒核酸进行逆转录，步骤如下：
1)配制体系(RNA模板，5μl；Random Hexamerprimer，1μl；DEPC H2O，6μl)：
2)若RNA模板GC含量高或包含二级结构，则将上述体系振荡混匀，短暂离心，于65℃孵育5分钟，冰上冷却。
3)配制体系共20μl(5×Reaction Buffer，4μl；RiboLock RNase Inhibitor(20U/μl)，1μl；10mM dNTP Mix，2μl；RevertAid M-MuLV RT(200U/μl)，1μl；步骤1中混合液，12μl)。
4)振荡混匀，短暂离心。
5)于PCR仪上进行反应，条件设置为：25℃孵育5分钟，45℃孵育60分钟。
6)在70℃加热5分钟终止反应。
1.2RPA等温扩增
本案例中扩增体系配制，操作步骤和PCR仪条件设置均与实施例3相同。
1.3CRISPR-Cas12a检测体系构建
本案例中检测体系配制，操作步骤均与实施例3相同。
1.4荧光定量PCR仪信号监测
本案例中荧光定量PCR仪条件设置与实施例3相同。
与此同时，对相同样本采用荧光定量PCR法进行重复检测。具体方法如下：
荧光定量引物：QF：TATTCATCCAACCAACCCCTT(SEQ ID NO：11)；
QR：GTCDCGCCAAGYGGAGC(SEQ ID NO：12)；
荧光定量探针QP：FAM-CGCATCTGACATWCCARCCGC-TRAMA(SEQ ID NO：13)。
配制体系共20μl(罗氏FastStart Universal probe Mast，10μl；QF(10mM)，0.5μl；QR(10mM)，0.5μl；QF(10mM)，0.5μl；模板，2μl；DEPC H2O，6.5μl)。
反应程序，于荧光定量PCR仪上进行反应，条件设置为：50℃，2分钟；95℃，10分钟；然后进入循环95℃，30秒；60℃，60秒(荧光信号采集)，共进行40个循环反应，根据荧光信号计算结果。
检测结果如图7。结果显示，20号和27号样本为阳性样本，其余为阴性，该结果与荧光定量PCR检测结果完全一致，说明该发明可以对实际样本进行检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
<120> 一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA、检测试剂盒及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uaauuucuac uaaguguaga uucucucacc agcagauuga 40
<210> 2
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uaauuucuac uaaguguaga uacagccagc aguguaguau g 41
<210> 3
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga uaugcaaccc cggcaguugg u 41
<210> 4
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga uuggggugac cggguugauu c 41
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcgggctctt ctgtttctgt tcctcctgct tttg 34
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcagatgcga aggggttggt tggatgaata t 31
<210> 7
<211> 461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggcagacca catatgtggt cgatgccatg gaggcccatc agtttattaa ggctcctggc 60
atcactactg ctattgagca ggctgctcta gcagcggcca actctgccct ggcgaatgct 120
gtggtagtta ggccttttct ctctcaccag cagattgaga tcctcattaa cctaatgcaa 180
cctcgccagc ttgttttccg ccccgaggtt ttctggaatc atcccatcca gcgtgtcatc 240
cataacgagc tggagcttta ctgccgcgcc cgctccggcc gctgtcttga aattggcgcc 300
catccccgct caataaatga taatcctaat gtggtccacc gctgcttcct ccgccctgtt 360
gggcgtgatg ttcagcgctg gtatactgct cccactcgcg ggccggctgc taattgccgg 420
cgttccgcgc tgcgcgggct tcccgctgct gaccgcactt a 461
<210> 8
<211> 478
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagacattac aggctcatac atcgtggatg gtcggtctct gcaaactgtc tatcaagctc 60
tcgacctgcc agctgacctg gtagctcgcg cagcccgact gtctgctaca gttactgtta 120
ctgaaacctc tggccgtctg gattgccaaa caatgatcgg caataagact tttctcacta 180
cctttgttga tggggcacgc cttgaggtta acgggcctga gcagcttaac ctctcttttg 240
acagccagca gtgtagtatg gcagccggcc cgttttgcct cacctatgct gccgtagatg 300
gcgggctgga agttcatttt tccaccgctg gcctcgagag ccgtgttgtt ttcccccctg 360
gtaatgcccc gactgccccg ccgagtgagg tcaccgcctt ctgctcagct ctttataggc 420
acaaccggca gagccagcgc cagtcggtta ttggtagttt gtggctgcac cctgaagg 478
<210> 9
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggcagaccac gtatgtggtc gatgccatgg aggcccacca gtttattaag gctcctggca 60
ttactactgc cattgagcag gctgctctgg ctgcggccaa ctccgccttg gcgaatgctg 120
tggtggttcg gccgtttttg tctcgcgtgc aaaccgagat ccttattaat ttgatgcaac 180
cccggcagtt ggttttccgc cctgaggtgc tttggaatca tcctattcag agagtcatac 240
acaatgaact agaacaatac tgccgggcac gggccggtcg ttgcctggag attggggccc 300
acccaagatc tattaatgat aaccccaatg ttttgcaccg gtgctttctc agaccggtcg 360
gtagggatgt tcagcgctgg tattctgccc ccacccgcgg ccctg 405
<210> 10
<211> 377
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgggtggaat gaataacatg ttcttttgct ctgtgcatgg cgatgccacc atgcgctctc 60
gggctcttct gtttctgttc ctcctgcttt tgcctatgct gcccgcgcca ccggccggtc 120
agccgtctgg ccgtcgccgc gggcggcgca gcggcggtgc cggcggtggt ttctggggtg 180
accgggttga ttctcagccc ttcgccctcc cctatattca tccaaccaac cccttcgcat 240
ctgacattcc agccgccgcc ggggctggag ctcgccctcg acagccagcc cgtccactcg 300
gttccgcttg gcgcgaccaa tcccagcgcc ccgccgctcc cgcccgtcgt cgatctaccc 360
cagctggggc ttcgccg 377
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tattcatcca accaacccct t 21
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtcdcgccaa gyggagc 17
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgcatctgac atwccarccg c 21

Claims (9)

1.一种基于CRISPR-Cas12a技术的HEV特异crRNA，其特征在于，所述HEV特异crRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的gRNA。
2.一种基于CRISPR-Cas12a技术检测不同基因型HEV的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述HEV特异crRNA和CRISPR-Cas12a蛋白酶。
3.根据权利要求2所述试剂，其特征在于，还包括单链DNA报告系统。
4.根据权利要求3所述试剂，其特征在于，所述单链DNA报告系统包括5'端标记荧光基团同时3'端标记荧光淬灭基团的单链核苷酸。
5.根据权利要求4所述试剂，其特征在于，所述单链DNA报告系统包括5'-6FAM-TTATTT-BHQ1-3'、5'-6FAM-TTATTT-TRAMA-3'或5'-HEX-TTATTT-IABkFQ-3'。
6.权利要求1所述HEV特异crRNA或权利要求2～5任意一项所述试剂在制备检测HEV的试剂盒中的应用。
7.一种基于CRISPR-Cas12a技术的检测HEV试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述HEV特异crRNA、CRISPR-Cas12a蛋白酶和单链DNA报告系统。
8.根据权利要求7所述检测HEV试剂盒，其特征在于，还包括HEV的cDNA等温扩增试剂。
9.根据权利要求8所述检测HEV试剂盒，其特征在于，所述HEV的cDNA等温扩增试剂包括RPA等温扩增用引物；
所述RPA等温扩增用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物对。
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