CN117230249A - 用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒及其使用方法 Download PDF

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CN117230249A CN202210634846.5A CN202210634846A CN117230249A CN 117230249 A CN117230249 A CN 117230249A CN 202210634846 A CN202210634846 A CN 202210634846A CN 117230249 A CN117230249 A CN 117230249A
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彭春梅
蒋析文
廖丽丽
肖彩霞
方倩
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Abstract

本申请公开了一种用于检测高传染性SARS‑Cov‑2突变病毒的试剂盒及其使用方法。本申请中开发了一种能够有效区分高传染率新型冠状病毒与普通新型冠状病毒的方法和配套使用的试剂盒，该方法基于多色熔解曲线分析技术，根据Tm值的差异就可以实现不同靶基因的检测和区分，避免使用周期长的且昂贵的测序仪，节约成本。

Description

用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒及其使用 方法
技术领域
本发明及生化检测领域，特别涉及用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒及其使用方法。
背景技术
新型冠状肺炎(SARS-Cov-2)是近年来出现的一种严重的急性呼吸道传染病，在人群中具有极其强的传染性，目前全球范围内累计确诊人数已接近2.3亿人次，累计死亡人数已达 470万。SARS-Cov-2由新型冠状病毒(SARS-CoV-2，严重急性呼吸综合征冠状病毒2)感染造成，主要传播途径为飞沫传播、接触传播和粪-口传播。该病毒为正链RNA病毒，RNA病毒极容易发生突变，造成了目前全球范围内多种突变株共同存在的情况，给病毒防治过程带了不小麻烦。
目前国内外主要存在的突变株有：Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta (B.1.617.2)、Epsilon(B.1.427、B.1.429)、Zeta(P.2)、Eta(B.1.525)、Mu(B.1.621)、Lota(B.1.526)、 Theta(P.3)、Kappa(B.1.617.1)和Lambda(C.37)等突变株。有较高传染性，更容易引起并发症，且更难以被免疫系统和疫苗中和掉，被疾病预防控制中心和世界卫生组织列为Variants of Concern(VOCs)的有Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)突变株。Lambda(C.37)毒株虽然未列为VOCs，仅为Variantsof interest(VOI)，但其突变株正在快速传播并且已经扩散到全球四十余国家,也不能忽视其影响力。Alpha(B.1.1.7)毒株为主流的突变株；Beta对疫苗免疫力较高；因为传染性超越了Alpha毒株，Delta曾在短期内席卷全球，而Lambda的传染性同样超越了Alpha，虽然传染力不及Delta毒株，但Lambda株对疫苗抵抗力超过了Delta株。全球42个国家各种病毒株流行率增长速度做的元数据分析显示， Delta传染力排在第一位，Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)和Lambda(C.37) 毒株的传染力也同样很高。但目前针对SARS-Cov-2的药物较少，其效果不佳，且部分突变株存在疫苗逃逸的可能性，SARS-Cov-2或将流行较长一段时间。因此，研发新型冠状病毒突变株检测技术具有重大意义。
目前，这类高传染率的新型冠状病毒突变毒株主要是通过基因组测序的方法与普通新冠病毒进行区分，过长的测序周期以及上万美元的仪器成本，阻碍了该病毒的检测效率。因此，一种能够有效鉴别高传染率新型冠状病毒与普通型新型冠状病毒的产品是目前亟需的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒，该试剂盒可一次同时检测SARS-Cov-2的5种高传染新变异病毒Alpha、Beta、Gamma、Delta和Lambda，灵敏度高，特异性很高，可实现高效鉴别高传染率新型冠状病毒与普通型新型冠状病毒。
本发明的另一目的在于提供高传染性SARS-Cov-2突变病毒的检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的PCR引物对组。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的引物探针混合液。
为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的PCR探针组，所述高传染性SARS-Cov-2突变病毒包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和/或Lambda；
所述PCR探针组包括选自下组的一个或多个探针：
如SEQ ID NO.：3所示的第一探针(特异性靶向A570D位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：4所示的第二探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：5所示的第三探针(特异性靶向A701V位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：6所示的第四探针(特异性靶向H655Y位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：7所示的第五探针(特异性靶向L452R位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：8所示的第六探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：9所示的第七探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：10所示的第八探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：11所示的第九探针(特异性靶向D614G位点)。
在一些优选的方案中，所述PCR探针组包括选自第一探针组、第二探针组、第三探针组、第四探针组和第五探针组中的至少两组(优选为三组、更有选为四组，最优选为全部五组)，和所述PCR探针组还包括第九探针；
所述第一探针组包括：第一探针和第二探针；
所述第二探针组包括：第三探针；
所述第三探针组包括：第四探针；
所述第四探针组包括：第五探针和第六探针；
所述第五探针组包括：第七探针和第八探针。
在一些优选的方案中，所述PCR探针组包括选自第一探针组、第二探针组、第三探针组、第四探针组和第五探针组，和所述PCR探针组还包括第九探针；
所述第一探针组包括：第一探针和第二探针；
所述第二探针组包括：第三探针；
所述第三探针组包括：第四探针；
所述第四探针组包括：第五探针和第六探针；
所述第五探针组包括：第七探针和第八探针。
在一些优选的方案中，所述第一探针和所述第九探针具有第一荧光标记；和/或，
所述第二探针和所述第六探针具有第二荧光标记；和/或，
所述第三探针和所述第四探针具有第三荧光标记；和/或，
所述第五探针、所述第七探针和所述第八探针具有第四荧光标记。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记、第二荧光标记、第三荧光标记和第四荧光标记互不相同。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记、第二荧光标记、第三荧光标记和第四荧光标记分别独立地选自ROX、HEX、CY5和FAM。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记为ROX；和/或，
所述第二荧光标记为HEX；和/或，
所述第三荧光标记为CY5；和/或，
所述第四荧光标记为FAM。
在一些优选的方案中，所述第一探针和第九探针的5’端标记有ROX，且3’端标记有BHQ2；和/或，
所述第二探针和所述第六探针的5’端标记有HEX，且3’端标记有BHQ1；和/或，
所述第三探针和所述第四探针的5’端标记有CY5，且3’端标记有BHQ2；和/或，所述第五探针、所述第七探针和所述第八探针的5’端标记有FAM，且3’端标记有BHQ1。
本发明的第二方面提供了一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括本发明第一方面所述的PCR探针组和引物对，
所述引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。
上述的SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：11序列信息如下表所示：
编号 引探名称 核酸序列(5’--3’)
SEQ ID NO：1 F 5’-GAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCC-3’
SEQ ID NO：2 R 5’-GTTCAACAGCTATTCCAGTTAAAGCACGGT-3’
SEQ ID NO：3 A-P1 ROX-TTTGGCAGAGACATTGATGACACTACT-BHQ2
SEQ ID NO：4 A-P2 HEX-TCAGACTAATTCTCATCGG-BHQ1
SEQ ID NO：5 B-P1 CY5-TGTCACTTGGTGTAGAAAATTCA-BHQ2
SEQ ID NO：6 G-P1 CY5-TAGGGGCAGAATATGTCAACAACT-BHQ2
SEQ ID NO：7 D-P1 FAM-ATTATAATTACCGGTATAGATTGTT-BHQ1
SEQ ID NO：8 D-P2 HEX-CAGACTAATTCTCGTCGGCGG-BHQ1
SEQ ID NO：9 L-P1 FAM-TAATTGTTACTCTCCTTTACAA-BHQ1
SEQ ID NO：10 L-P2 FAM-ATAATTACCAGTATAGATTGTT-BHQ1
SEQ ID NO：11 C-P ROX-TGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCAC-BHQ2
本发明的第三方面，提供了一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR探针组。
在一些优选的方案中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含本发明第二方面所述的引物探针混合液。
在一些优选的方案中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器包含PCR反应酶系；优选地，所述PCR反应酶系包括逆转录酶、热启动Taq抗体酶或其稀释液。
在一些优选的方案中，所述PCR反应酶系包括：C-MMLV酶、Taq酶、RNasin酶和UDG酶。
本发明的第四方面，提供了一种检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有高传染性突变病毒核酸；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应；
(3)对步骤(2)扩增反应所得产物进行熔解曲线分析；
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和本发明第一方面所述的探针组。
在一些优选的方案中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和本发明第二方面所述的引物探针混合液。
在一些优选的方案中，所述方法为非诊断目的。
本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：
(1)本发明开发了一种能够有效区分高传染率新型冠状病毒与普通新型冠状病毒的方法和配套使用的试剂盒，该方法基于多色熔解曲线分析技术，根据Tm值的差异就可以实现不同靶基因的检测和区分，避免使用周期长的且昂贵的测序仪，节约成本；
(2)本发明一些优选的实施方式中提供了一种可以同时检测多种高传染性新型冠状病毒突变毒株的试剂盒，其在单个反应中检测多个靶基因，大大提升了检测效率，单管检测容量可以高出实时PCR数倍甚至数十倍，且在突变筛查方面不受突变类型的影响，较其他方法具有更高的灵敏度，适合随机突变的检测。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中含冠状病毒SARS-2003、SARS coronavirus ZS-C、bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21、SARS coronavirus ZS-B、SARS coronavirusSin3765、 SARS coronavirus Sin3408L、MERS coronavirus重组质粒模板检测结果图；
图2是根据本发明实施例中含未突变株的SARS-CoV-2S基因片段的重组质粒特异性模板检测结果图；
图3是根据本发明实施例中阴性对照检测结果图；
图4为根据本发明实施例中试剂盒灵敏度进行检测结果图。
具体实施方式
新型冠状病毒SARS-Cov-2突变速度快，且部分突变所得毒株传染性极强，现有技术厚中，检测病毒突变常通过基因测序的方式，该方法需要依赖昂贵的基因测序仪器，且耗时长。
熔解线分析技术(melting curve analysis)分为探针熔解曲线和荧光染料溶解熔解曲线两类，探针熔解曲线利用不同的靶序列杂交后形成的双链DNA熔点差异区分不同的靶序列，由于探针之间互相影响，容易使体系更加复杂，造成高背景荧光，进而降低了检测的灵敏度，因此，在多重实时基因分型检测中，如何使用更少的探针同时结合多种靶序列且彼此之间具有多个可区分的熔解峰是探针熔解曲线分析方法开发的难点。
本发明开发了基于熔解曲线分析法的快速分析新型冠状病毒SARS-Cov-2的五种高传染性突变毒株Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda的方法，该方法基于发明人经过优化选择的PCR探针组，所述PCR探针组包括选自下组的一个或多个探针：
如SEQ ID NO.：3所示的第一探针(特异性靶向A570D位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：4所示的第二探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：5所示的第三探针(特异性靶向A701V位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：6所示的第四探针(特异性靶向H655Y位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：7所示的第五探针(特异性靶向L452R位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：8所示的第六探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：9所示的第七探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：10所示的第八探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：11所示的第九探针(特异性靶向D614G位点)。
上述探针组中各探针成员之间彼此影响小，造成的背景荧光少，使得方法的灵敏度更高，可实现同时检测包括新型冠状病毒SARS-Cov-2的五种高传染性突变毒株Alpha、Beta、 Gamma、Delta和Lambda中的至少两种、优选三种、更优选为四种、最优选为全部五种，特异性好，准确度高，灵敏度高。
SARS-Cov-2的野生型和相关突变株
新型冠状病毒SARS-Cov-2的突变毒株主要包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda几类，其中，Alpha突变毒株至少产生如下突变A570D和P681H；Beta突变毒株至少产生如下突变A701V；Gamma突变毒株至少产生如下突变H655Y；Delta突变毒株至少产生如下突变L452R和P681H；Lambda突变毒株至少产生如下突变F490S和L452R，下表1中总结了各突变株基于野生型的突变位点。
SARS-Cov-2的各突变株突变位点具体见下表1。
表1
SARS-Cov-2的野生型基因序列信息(SEQ ID NO：12)：
ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGC ATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACT TGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGAT AACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGG TACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTC AATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTAT TCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAA AAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGC GTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACT TTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCA-GGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATG TGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTT GACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGT CCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGAT TTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATT TGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAG ATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTAT AGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTG TAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAAC CATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTG GTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCT GCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACA TTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAG GATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTC TAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTG GTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATT GCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTAT TAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAA CTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAA CAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTT TAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGA CACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAA AAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGG TACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTA ATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAA ATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAA CACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAG TTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATT AGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGT TGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTT ATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGT GTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACAC ATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACT CATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAAT GCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCT CCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCA TAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGC TGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA
SARS-Cov-2的突变株野生型蛋白序列信息(SEQ ID NO：13)：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFD NPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVY SSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQT LLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRV QPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPC NGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFL PFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGS NVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTI SVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGF NFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAG TITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALN TLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRV DFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDL QELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SARS-Cov-2检测试剂盒
本发明中所述的SARS-Cov-2检测试剂盒包括：用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的PCR探针组，所述高传染性SARS-Cov-2突变病毒包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和 /或Lambda；所述PCR探针组包括选自下组的一个或多个探针：
如SEQ ID NO.：3所示的第一探针(特异性靶向A570D位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：4所示的第二探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：5所示的第三探针(特异性靶向A701V位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：6所示的第四探针(特异性靶向H655Y位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：7所示的第五探针(特异性靶向L452R位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：8所示的第六探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：9所示的第七探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：10所示的第八探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：11所示的第九探针(特异性靶向D614G位点)。
在一些优选的方案中，所述PCR探针组包括选自第一探针组、第二探针组、第三探针组、第四探针组和第五探针组中的至少两组(优选为三组、更有选为四组，最优选为全部五组)，和所述PCR探针组还包括第九探针；
所述第一探针组包括：第一探针和第二探针；
所述第二探针组包括：第三探针；
所述第三探针组包括：第四探针；
所述第四探针组包括：第五探针和第六探针；
所述第五探针组包括：第七探针和第八探针。
在一些优选的方案中，所述PCR探针组包括选自第一探针组、第二探针组、第三探针组、第四探针组和第五探针组，和所述PCR探针组还包括第九探针；
所述第一探针组包括：第一探针和第二探针；
所述第二探针组包括：第三探针；
所述第三探针组包括：第四探针；
所述第四探针组包括：第五探针和第六探针；
所述第五探针组包括：第七探针和第八探针。
在一些优选的方案中，所述第一探针具有第一荧光标记；和/或，
所述第二探针具有第二荧光标记；和/或，
所述第三探针具有第三荧光标记；和/或，
所述第四探针具有第四荧光标记；和/或，
所述第五探针具有第五荧光标记；和/或，
所述第六探针具有第六荧光标记；和/或，
所述第七探针具有第七荧光标记；和/或，
所述第八探针具有第八荧光标记；和/或，
所述第九探针具有第九荧光标记。
在一些优选的方案中，所述第一探针和所述第九探针具有第一荧光标记；和/或，
所述第二探针和所述第六探针具有第二荧光标记；和/或，
所述第三探针和所述第四探针具有第三荧光标记；和/或，
所述第五探针、所述第七探针和所述第八探针具有第四荧光标记。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记、第二荧光标记、第三荧光标记和第四荧光标记互不相同。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记、第二荧光标记、第三荧光标记和第四荧光标记分别独立地选自ROX、HEX、CY5和FAM。
在一些优选的方案中，所述第一荧光标记为ROX；和/或，
所述第二荧光标记为HEX；和/或，
所述第三荧光标记为CY5；和/或，
所述第四荧光标记为FAM。
在一些优选的方案中，所述第一探针和第九探针的5’端标记有ROX，且3’端标记有BHQ2；和/或，
所述第二探针和所述第六探针的5’端标记有HEX，且3’端标记有BHQ1；和/或，
所述第三探针和所述第四探针的5’端标记有CY5，且3’端标记有BHQ2；和/或，
所述第五探针、所述第七探针和所述第八探针的5’端标记有FAM，且3’端标记有BHQ1。
本发明中所述的SARS-Cov-2检测试剂盒还包括：用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括上述PCR探针组和引物对，
所述引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。
本发明中所述的SARS-Cov-2检测试剂盒还包括：PCR反应酶系。本发明中所述的PCR 反应酶系如本领域常用的那样，包括逆转录酶、热启动Taq抗体酶或其稀释液。
在一些优选的方案中，所述PCR反应酶系包括：C-MMLV酶、Taq酶、RNasin酶和UDG酶。
在一些优选的实施方案中，本发明中所述的SARS-Cov-2检测试剂盒组成如下表2：
表2
表2中引物探针序列如下表3所示：
表3
SARS-Cov-2检测试剂盒的使用方法
本发明提供的试剂盒优选的适用样本为新型冠状病毒SARS-Cov-2阳性患者的痰液培养物，本发明的一个实施方式中取临床新型冠状病毒SARS-Cov-2阳性患者的痰液培养物提取核酸作为样本RNA进行后续检测。
在提取待测样本RNA后，将试剂盒中的组分按照下表3中所述的比例进行混合，制备获得反应体系，表中，PCR Buffer 10x组成为：甜菜碱：10-100mmol/L；NH4 +：1-20mmol/L；5‰Tween20：0-10μL；Tris-HCl(pH8.8)：10-50mmol/L；KCl：20mmol/L～100mmol/L；Mg2+：2～2.5mmol/L甲酰胺：10-50mmol/L；dNTPs：50～200umol/L。
表3
/>
混合均匀后离心数秒，即可上机检测。
本发明中，SARS-Cov-2的突变株的检测采用荧光PCR熔解曲线法进行，其具体原理如下：使用特异引物经PCR扩增得到与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后进行熔解曲线分析，通过荧光PCR仪检测荧光信号，然后仪器软件系统通过计算各荧光通道的荧光值与温度的负导数自动绘制熔解曲线，并得到熔解峰及熔点(Tm)，根据各通道检测的熔点或熔解峰判断模板是否发生突变。在本发明一个实施方案中给出了具体的结构判读的方法。
术语
除非另有说明，否则本文所述的"引物"通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约15-25个核苷酸之间。本文使用的术语"正向引物"是指与靶DNA的一条特定链退火的寡核苷酸。本文使用的术语"反向引物"是指与靶DNA的相反链退火的寡核苷酸。总之，正向引物和反向引物通常以类似于PCR引物的方式定向在靶DNA序列上，使得其3'末端比其 5'末端更接近靶序列。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为"G"、"A"、"C"和"T")以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。本文使用的术语“PCR 引物”是指用于起始对核酸进行的PCR反应的寡核苷酸引物。
除非另有说明，否则本文所述的"PCR产物"是指自核酸模板，通过核酸PCR扩增而产生的扩增的核酸。
除非另有说明，否则本文所述的“样本”包括含有核酸分子的任何样本。样本可来源于生物来源("生物样品")，倒如组织(例如活组织检查样品)、提取物或包括结核分枝杆菌的培养物和生物或生理流体，例如经固化处理的样品(如石蜡包埋样本)、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌注液、尿液、粪便、分泌液、乳汁、腹膜液等。在本发明的一些实施例中，样本是痰。
除非另有说明，否则本文中所述的“采样”为采集临床诊断为结核分枝杆菌复合群阳性的样本，例如采集临床诊断为新型冠状病毒SARS-Cov-2阳性患者的人痰液样本。
除非另有说明，否则本文中所述的“人痰液样本”包括即时痰、清晨痰和夜间痰，使用其中任意一种痰液样本培养即可。即时痰为患者就诊时深呼吸后咳出的痰液，清晨痰为清晨晨起立即用清水漱口后深咳出的痰液，夜间痰为送痰前一日夜间咳出的痰液，合格的痰液标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液，痰量以3mL～5mL为宜。痰液标本应由检验人员或经培训合格的专人验收，痰液不合格者，要求重新送检；当难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以便分析结果时参考。对于当天不能制备培养的痰液标本应置2-8℃冰箱内保存，时间不能超过7天。痰液标本如需在机构之间运送应按照规定取得相关许可，然后冷藏运送。
除非另有说明，否则本文中所述的“样本制备”指的是在培养基(例如罗氏固体培养基) 上分离样本培养物，例如痰液样本培养物。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1、SARS-Cov-2的突变株检测试盒及检测方法
(1)采样及制样
临床诊断为新型冠状病毒SARS-Cov-2阳性的人痰液样本，并在培养基(例如罗氏固体培养基)上分离痰液样本培养物，并提取核酸作为样本RNA。
(2)反应体系的配制
取本发明试剂盒中的试剂，按照下表1配制检测试剂体系(发明人对反应体系进行反复优化，得出下表1为最优得反应体系)。
表1
/>
其中，PCR Buffer 10x的组成为：甜菜碱：10-100mmol/L；NH4 +：1-20mmol/L；5‰Tween20： 0-10μL；Tris-HCl(pH8.8)：10-50mmol/L；KCl：20mmol/L～100mmol/L；Mg2+：2～2.5mmol/L 甲酰胺：10-50mmol/L；dNTPs：50～200umol/L。
从试剂盒中取出PCR引物和探针反应混合液和酶系置于室温融化后振荡混匀，8,000rpm 离心数秒后使用。
(3)PCR反应程序
使用PCR仪扩增(2)中的反应体系，PCR循环程序如下表4所示。荧光通道选择FAM、HEX、ROX、CY5通道，并选择样品孔需要收集的荧光基团。
表4
/>
(4)结果判读方法
各突变株在各检测通道的参考熔点(Tm值)如下表5：
表5
各突变株在FAM、HEX、ROX、CY5均应该有峰，若任意通道无溶解峰则待测样本检测无效。
判读结果解读：
当FAM通道Tm为55±0.5℃，HEX通道通道存在2个熔解峰Tm值为51±0.5和64.5 ±0.5，ROX通道存在2个熔解曲线峰且Tm分别为54±0.5℃和66±0.5℃，CY5通道Tm为 60±0.5℃，则为新型冠状病毒阳性，为野生株。
当FAM通道存在两个熔解峰，Tm为49±0.5℃和55±0.5℃，HEX通道Tm值为57±0.5，ROX通道存在2个熔解曲线峰且Tm分别为54.5±0.5℃和60±0.5℃，CY5通道Tm为 60±0.5℃，则为新型冠状病毒阳性，且为Delta变异株。
当FAM通道Tm为55±0.5℃，HEX通道通道存在2个熔解峰Tm值为55.5±0.5和64.5±0.5，ROX通道存在2个熔解曲线峰且Tm分别为56±0.5℃和60±0.5℃，CY5通道Tm为 60±0.5℃，则为新型冠状病毒阳性，且为Alpha变异株。
当FAM通道Tm为55±0.5℃，HEX通道通道存在2个熔解峰Tm值为51±0.5和64.5 ±0.5，ROX通道存在2个熔解曲线峰且Tm分别为54±0.5℃和60±0.5℃，CY5通道Tm为 63±0.5℃，则为新型冠状病毒阳性，且为Gamma变异株。
当FAM通道Tm为55±0.5℃，HEX通道通道存在2个熔解峰Tm值为51±0.5和64.5 ±0.5，ROX通道存在2个熔解曲线峰且Tm分别为54±0.5℃和60±0.5℃，CY5通道存在2 个熔解曲线峰且Tm分别为54.5±0.5℃和60±0.5℃，则为新型冠状病毒阳性，且为Beta变异株。
当FAM通道存在两个熔解峰，Tm为52±0.5℃和58±0.5℃，HEX通道通道存在2个熔解峰Tm值为51±0.5和64.5±0.5，ROX通道存在2个熔解曲线峰且Tm分别为54±0.5℃和 60±0.5℃，CY5通道Tm为60±0.5℃，则为新型冠状病毒阳性，且为Lambda变异株。
实施例2、特异性检测
以分别含冠状病毒SARS-2003、SARS coronavirus ZS-C、bat-SL-CoVZC45、 bat-SL-CoVZXC21、SARS coronavirus ZS-B、SARS coronavirus Sin3765、SARS coronavirusSin3408L、MERS coronavirus片段的重组质粒为模板，同时也将含未突变株的SARS-CoV-2S基因片段的重组质粒作为特异性模板。并用纯化水作为阴性对照进行检测，检测结果如表7、图1、图2和图3所示。
表7
由图可知，SARS-2003、SARS coronavirus ZS-C、bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21、 SARS coronavirus ZS-B、SARS coronavirus Sin3765、SARS coronavirusSin3408L、MERS coronavirus和阴性对照均没有熔融曲线峰，同时含未突变株的SARS-CoV-2S基因片段的重组质粒也呈现阴性。
实施例3、灵敏度检测
含Alpha、Beta、Gamma、Delta、Lambda新冠变异株S基因序列的重组质粒用ddH2O做梯度稀释，拷贝数依次为104copies/ml、103copies/ml、500copies/ml。使用本发明试剂盒进行检测，检测结果如图4所示。
由图4可知，体系的最低检测限为500copies/ml，表明本发明试剂盒灵敏度很高。
同时取市售的新型冠状病毒Alpha变异毒株检测试剂盒进行检测，其在103copies/ml即显示不出较高的熔融曲线，而在500copies/ml时，则完全看不出熔融曲线。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒及其使用方法
<130> P220010-1CNCNA9
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
gaggtgatga agtcagacaa atcgctcc 28
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
gttcaacagc tattccagtt aaagcacggt 30
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tttggcagag acattgatga cactact 27
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
tcagactaat tctcatcgg 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
tgtcacttgg tgtagaaaat tca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
taggggcaga atatgtcaac aact 24
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<211> 25
<212> DNA
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<400> 7
attataatta ccggtataga ttgtt 25
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cagactaatt ctcgtcggcg g 21
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<213> 人工序列（Artificial sequence）
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taattgttac tctcctttac aa 22
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<211> 22
<212> DNA
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ataattacca gtatagattg tt 22
<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
tgttctttat cagggtgtta actgcac 27
<210> 12
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
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acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
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aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 13
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (10)

1.一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的PCR探针组，其特征在于，所述高传染性SARS-Cov-2突变病毒包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和/或Lambda；
所述PCR探针组包括选自下组的一个或多个探针：
如SEQ ID NO.：3所示的第一探针(特异性靶向A570D位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：4所示的第二探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：5所示的第三探针(特异性靶向A701V位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：6所示的第四探针(特异性靶向H655Y位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：7所示的第五探针(特异性靶向L452R位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：8所示的第六探针(特异性靶向P681H位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：9所示的第七探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：10所示的第八探针(特异性靶向F490S位点)；和/或，
如SEQ ID NO.：11所示的第九探针(特异性靶向D614G位点)。
2.根据权利要求1所述的PCR探针组，其特征在于，所述PCR探针组包括选自第一探针组、第二探针组、第三探针组、第四探针组和第五探针组中的至少两组，和所述PCR探针组还包括第九探针；
所述第一探针组包括：第一探针和第二探针；
所述第二探针组包括：第三探针；
所述第三探针组包括：第四探针；
所述第四探针组包括：第五探针和第六探针；
所述第五探针组包括：第七探针和第八探针。
3.根据权利要求1所述的PCR探针组，其特征在于，所述第一探针和所述第九探针具有第一荧光标记；和/或，
所述第二探针和所述第六探针具有第二荧光标记；和/或，
所述第三探针和所述第四探针具有第三荧光标记；和/或，
所述第五探针、所述第七探针和所述第八探针具有第四荧光标记；
所述第一荧光标记、第二荧光标记、第三荧光标记和第四荧光标记互不相同。
4.根据权利要求1所述的PCR探针组，其特征在于，所述第一荧光标记、第二荧光标记、第三荧光标记和第四荧光标记分别独立地选自ROX、HEX、CY5和FAM。
5.根据权利要求1所述的PCR探针组，其特征在于，所述第一荧光标记为ROX；和/或，
所述第二荧光标记为HEX；和/或，
所述第三荧光标记为CY5；和/或，
所述第四荧光标记为FAM。
6.一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的引物探针混合液，所述引物探针混合液包括如权利要求1至5中任一项所述的PCR探针组和引物对，
所述引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.:2所示的反向引物。
7.一种用于检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器包含如权利要求1至5中任一项所述的PCR探针组。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器包含PCR反应酶系。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应酶系包括C-MMLV酶、Taq酶、RNasin酶和UDG酶。
10.一种检测高传染性SARS-Cov-2突变病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有高传染性突变病毒核酸；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应；
(3)对步骤(2)扩增反应所得产物进行熔解曲线分析；
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本和如权利要求1至5中任一项所述的PCR探针组。
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