CN114317690A - 预扩增多靶核酸结合荧光定量pcr检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法。其中，靶核酸可以是不同类型的核酸或不同类型核酸的混合物，靶核酸数目可以大于5、10、20、50、100、200，预扩增产物通过单重或多重荧光定量PCR多孔检测上述预扩增后的所有的靶核酸的方法在病原体检测、突变检测和药物筛查等领域的应用。所述的多重预扩增多靶核酸结合单重或多重荧光定量PCR检测的方法可以选择性的扩增多靶点，灵敏度高，特异性强，样品用量少。在疾病的检测，诊断，治疗中具有应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及检测、诊断、医学、生物工程等领域。具体地，本发明涉及一种预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法。
背景技术
一方面，感染性疾病由RNA(核糖核酸)病毒、DNA(脱氧核糖核酸)病毒、细菌、真菌等病原体引起，快速检测出感染病原体类型对危重感染病人的救治有特别重要的意义。使医生可以在短时间内了解感染病原，及时制定科学的医疗方案和在确定了病原体种类后选择针对性药物至关重要。挽救病人的生命，同时防止抗生素的错用与滥用。目前，许多病原体还是通过分离培养的方法来鉴定，时间长(需要几天到一周)，灵敏度低，效率低，往往耽搁救治时机。最近几年多重PCR的发展，实现了单管反应同时检测多种类感染性病原，非常节省标本，但普通的多重PCR存在不同引物优化困难和繁琐，靶基因检测通量难于提高，反应条件和反应体系非常苛刻的问题，最大的缺陷是容易出现非特异性扩增和各引物之间相互影响导致的扩增效率不一致和低下，因此如何解决多重PCR的这些缺陷就显得尤为重要了。
现有技术中已有扩增多重靶核酸应用于测序平台上的方法，但能否大规模应用于荧光定量PCR平台还有待验证。
因此，研究和开发预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法，在检测感染性疾病、基因突变和药物筛查等领域具有很好的潜在应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种多重预扩增结合荧光定量PCR检测多种靶核酸的方法，包括：
(a)提供一待检测的样品；
(b)对(a)中所述样品，使用第一引物池在第一反应体系中对所述样品中的靶核酸进行多重预扩增，获得预扩增反应混合物；其中，所述第一引物池包含N对预扩增靶核酸的引物对，所述N≥5(较佳地，5≤N≤500；更佳地，20≤N≤400)；
(c)对上一步骤中的反应混合物，通过荧光定量PCR在M个检测体系中检测靶核酸，其中M≥1(较佳地≥5、10、20、50、100、200)，
其中，M/N＝1-50，较佳地，M/N＝2-20；
其中，每个检测体系中有1-6种靶核酸，较佳地2-3种。
在另一优选例中，所述荧光定量PCR包括单重或多重PCR。
在另一优选例中，所述待检测的样品包含或怀疑包含所述靶核酸。
在另一优选例中，所述待检测的样品包含靶核酸的种类S≥5、10、20、50、100、或200。
在另一优选例中，所述的N≥5、10、20、50、100、或200。
在另一优选例中，所述靶核酸来源于病原体或蛋白突变体。
在另一优选例中，所述靶核酸选自下组：单链DNA、双链DNA、cDNA、RNA、或其组合。
在另一优选例中，所述靶核酸包括野生型或突变型。
在另一优选例中，所述病原体选自下组：RNA病毒、DNA病毒、细菌、真菌、或其组合。
在另一优选例中，所述DNA病毒选自下组：腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌和结核分枝杆菌、或其组合。
在另一优选例中，所述RNA病毒选自下组：偏肺病毒、鼻病毒、甲型流感病毒H1N1、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、人冠状病毒HCoV-HKU1、人冠状病毒HCoV-OC43、人冠状病毒HCoV-NL63和人冠状病毒HCoV-229E、或其组合。
在另一优选例中，所述蛋白突变体为EGFR突变，所述的EGFR突变选自下组：c.2573T>G(p.L858R)、c.2582T>A(p.L861Q)、c.2369C>T(p.T790M)、c.2303G>T(p.S768I)、c.2240_2254del15(p.L747_T751delLREAT)、c.2237_2251del15(p.E746_T751>A)、c.2240_2257del18(p.L747_P753>S)、c.2239_2248TTAAGAGAAG>C(p.L747_A750>P)、c.2237_2255>T(p.E746_S752>V)、c.2236_2250del15(p.E746_A750delELREA)、c.2235_2249del15(p.E746_A750delELREA)、c.2300_2308dup(p.A767_V769dup)、或其组合。
在另一优选例中，所述预扩增在一个反应体系中进行。
在另一优选例中，所述步骤(b)与步骤(c)在同一反应体系中进行。
在另一优选例中，所述预扩增靶核酸的引物对各自独立地互补结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。
在另一优选例中，所述第一反应体系包含：
(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；
(ii)第一引物池，其包含至少5、10、20、50、100、200对以上不同预扩增靶核酸的引物对，其中每种引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；
(iii)第一核酸聚合酶和第一缓冲液；
(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合。
在另一优选例中，所述预扩增进行10-15个循环，较佳地，进行11-13个循环。
在另一优选例中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处。
在另一优选例中，所述封闭基团选自下组：2'，3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2'，3'SH核苷酸或2'-O-PO3核苷酸。
在另一优选例中，所述封闭引物被进一步修饰以减少不需要的核酸的扩增。
在另一优选例中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。
在另一优选例中，所述错配的核苷酸与具有所述封闭基团的核苷酸相距2-18bp。
在另一优选例中，所述错配的核苷酸碱基位于具有所述封闭基团的核苷酸的5'侧。
在另一优选例中，所述预扩增靶核酸的引物对中每个引物的长度各自独立地为8至100个核苷酸；较佳地，8至80个核苷酸；较佳地，8至60个核苷酸；更佳地，8至40个核苷酸；最佳地，8至20个核苷酸。
在另一优选例中，所述去封闭剂是CS5 DNA聚合酶、具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸盐或RNase H2，所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或其组合。
在另一优选例中，所述样品中除所述靶核酸之外的核酸基本上不在步骤(b)中扩增，即除靶核酸扩增外没有其它非特性扩增产物产生。
在另一优选例中，所述第一引物池包含10-50对的预扩增靶核酸的引物对。
在另一优选例中，所述第一引物池中的每个引物为封闭引物，封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处，所述封闭基团是2'，3'-双脱氧核苷酸。
在另一优选例中，所述第一引物池包含选自下表A中的引物对：
表A
| 名称 | 上游引物 | 下游引物 | 病原体 |
| 引物对1 | SEQ ID NO.1 | SEQ ID NO.2 | 偏肺病毒 |
| 引物对2 | SEQ ID NO.3 | SEQ ID NO.4 | 鼻病毒 |
| 引物对3 | SEQ ID NO.5 | SEQ ID NO.6 | 甲型流感病毒H1N1 |
| 引物对4 | SEQ ID NO.7 | SEQ ID NO.8 | 副流感病毒1 |
| 引物对5 | SEQ ID NO.9 | SEQ ID NO.10 | 副流感病毒2 |
| 引物对6 | SEQ ID NO.11 | SEQ ID NO.12 | 副流感病毒3 |
| 引物对7 | SEQ ID NO.13 | SEQ ID NO.14 | 人冠状病毒HCoV-HKU1 |
| 引物对8 | SEQ ID NO.15 | SEQ ID NO.16 | 人冠状病毒HCoV-OC43 |
| 引物对9 | SEQ ID NO.17 | SEQ ID NO.18 | 人冠状病毒HCoV-NL63 |
| 引物对10 | SEQ ID NO.19 | SEQ ID NO.20 | 人冠状病毒HCoV-229E |
| 引物对11 | SEQ ID NO.21 | SEQ ID NO.22 | 腺病毒B组 |
| 引物对12 | SEQ ID NO.23 | SEQ ID NO.24 | 腺病毒C组 |
| 引物对13 | SEQ ID NO.25 | SEQ ID NO.26 | 腺病毒E组 |
| 引物对14 | SEQ ID NO.27 | SEQ ID NO.28 | 肺炎衣原体 |
| 引物对15 | SEQ ID NO.29 | SEQ ID NO.30 | 肺炎支原体 |
| 引物对16 | SEQ ID NO.31 | SEQ ID NO.32 | 百日咳杆菌 |
| 引物对17 | SEQ ID NO.33 | SEQ ID NO.34 | 流感嗜血杆菌 |
| 引物对18 | SEQ ID NO.35 | SEQ ID NO.36 | 卡他莫拉菌 |
| 引物对19 | SEQ ID NO.37 | SEQ ID NO.38 | 肺炎链球菌 |
| 引物对20 | SEQ ID NO.39 | SEQ ID NO.40 | 肺炎克雷伯菌 |
| 引物对21 | SEQ ID NO.41 | SEQ ID NO.42 | 结核分枝杆菌 |
在另一优选例中，所述检测体系包含：
(i)包含步骤(b)中的预扩增反应混合物；
(ii)第二引物池，其包含L种不同靶核酸的引物组，其中每种靶核酸各自独立地对应一组引物组，所述引物组包含配合使用的荧光PCR的引物对和探针，其中荧光PCR的引物对和探针各自独立地与所述靶核酸的部分序列互补或相同；
(iii)第二核酸聚合酶和第二缓冲液。
在另一优选例中，所述的L≥5、10、20、50、100、或200。
在另一优选例中，所述探针的结构(5'-3')如式I所示：
Z1-Z2-Z3 I
其中，
Z1为荧光基团；
Z2为特异性互补核酸序列；
Z3为淬灭基团；
“-”为化学键、连接基团、或1-3个核苷酸构成的接头。
在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、CY7。
在另一优选例中，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB或TAMARA。
在另一优选例中，所述第二引物池包括选自下表B中的荧光PCR的引物对和探针：
表B.
在另一优选例中，所述第一引物池包含在一个反应体系中预扩增EGFR 12种突变位点的预扩增靶核酸的引物对，其中每个引物都为封闭引物，封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸。
在另一优选例中，所述预扩增靶核酸的引物对包括选自下表C中的引物对：
表C.
| 名称 | 上游引物 | 下游引物 | EGFR突变 |
| 引物对1 | SEQ ID NO.106 | SEQ ID NO.107 | p.L858R |
| 引物对2 | SEQ ID NO.108 | SEQ ID NO.109 | p.L861Q |
| 引物对3 | SEQ ID NO.110 | SEQ ID NO.111 | p.T790M |
| 引物对4 | SEQ ID NO.112 | SEQ ID NO.113 | p.S768I |
| 引物对5 | SEQ ID NO.114 | SEQ ID NO.115 | p.L747_T751delLREAT |
| 引物对6 | SEQ ID NO.116 | SEQ ID NO.117 | p.E746_T751>A |
| 引物对7 | SEQ ID NO.118 | SEQ ID NO.119 | p.L747_P753>S |
| 引物对8 | SEQ ID NO.120 | SEQ ID NO.121 | p.L747_A750>P |
| 引物对9 | SEQ ID NO.122 | SEQ ID NO.123 | p.E746_S752>V |
| 引物对10 | SEQ ID NO.124 | SEQ ID NO.125 | p.E746_A750delELREA |
| 引物对11 | SEQ ID NO.126 | SEQ ID NO.127 | p.E746_A750delELREA |
| 引物对12 | SEQ ID NO.128 | SEQ ID NO.129 | p.A767_V769dup |
在另一优选例中，所述第二引物池包括选自下表D中的荧光PCR的引物对和探针：
表D
在另一优选例中，所述方法的最低检测限为2.5拷贝/μL，较佳地，为1.25拷贝/μL。
在另一优选例中，所述方法为非诊断和非治疗的方法。
在本发明的第二方面，提供了一种检测病原体靶核酸的检测试剂，所述检测试剂包含一特异性引物对集，所述引物对集为选自表A的引物对。
在另一优选例中，所述引物对集包含表A中引物对1-21所示的21对引物。
在另一优选例中，所述特异性引物对集用于预扩增病原体靶核酸。
在另一优选例中，所述检测试剂还包括用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针。
在另一优选例中，所述用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针包含选自表B中的引物对和探针。
在另一优选例中，所述病原体选自下组：RNA病毒、DNA病毒、细菌、真菌、或其组合。
在另一优选例中，所述DNA病毒选自下组：腺病毒、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌和结核分枝杆菌、或其组合。
在另一优选例中，所述RNA病毒选自下组：偏肺病毒、鼻病毒、甲型流感病毒H1N1、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、人冠状病毒HCoV-HKU1、人冠状病毒HCoV-OC43、人冠状病毒HCoV-NL63和人冠状病毒HCoV-229E、或其组合。
在本发明的第三方面，提供了如本发明的第二方面所述的检测试剂的用途，所述试剂
(a)用于制备检测病原体靶核酸的试剂盒；或
(b)用于制备检测EGFR蛋白突变靶核酸的试剂盒。
在本发明的第四方面，提供了一种用于(a)检测病原体靶核酸；或(b)检测EGFR蛋白突变靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
一容器A以及位于所述容器内的预扩增靶核酸的引物对集；和/或
一容器B以及位于所述容器内的用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针；和使用说明书。
在另一优选例中，所述预扩增靶核酸的引物对集包含3-50对用于特异性预扩增多种靶核酸的引物对。
在另一优选例中，所述用于检测病原体靶核酸的试剂盒，包括：
一容器A以及位于所述容器内的预扩增靶核酸的引物对集，其中所述预扩增靶核酸的引物对集包括选自表A的引物对；和/或
一容器B以及位于所述容器内的用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针，其中所述荧光定量PCR的引物对集和相匹配的探针包括选自表B的引物对和探针；和使用说明书。
在另一优选例中，所述用于检测EGFR蛋白突变靶核酸的试剂盒，包括：
一容器A以及位于所述容器内的预扩增靶核酸的引物对集，其中所述预扩增靶核酸的引物对集包括选自表C的引物对；和/或
一容器B以及位于所述容器内的用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针，其中所述荧光定量PCR的引物对集和相匹配的探针包括选自表D的引物对和探针；和使用说明书。
在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。
在另一优选例中，所述的容器B包括多个反应管，并且每个反应管中放置了用于一次荧光定量PCR反应所需用量的1-6种引物对及探针。
在另一优选例中，所述靶核酸选自下组：单链DNA、双链DNA、cDNA、RNA、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明的方法检测9种DNA病原体的荧光定量PCR结果；其中，图1A-K分别显示了腺病毒B组和阴性、腺病毒C组和阴性、腺病毒E组和阴性、肺炎衣原体和阴性、肺炎支原体和阴性、百日咳杆菌和阴性、肺炎链球菌和阴性、流感嗜血杆菌和阴性、肺炎克雷伯菌和阴性、卡他莫拉菌和阴性、结核分枝杆菌和阴性的检测结果。
图2为本发明的方法检测10种RNA病毒的荧光定量PCR结果；其中，图2A-J分别显示了偏肺病毒和阴性、鼻病毒和阴性、甲型流感病毒H1N1和阴性、副流感病毒1和阴性、副流感病毒2和阴性、副流感病毒3和阴性、人冠状病毒HCoV-HKU1和阴性、人冠状病毒HCoV-OC43和阴性、人冠状病毒HCoV-NL63和阴性、人冠状病毒HCoV-229E和阴性的检测结果。
图3为荧光定量多重PCR检测6种RNA病原体的结果；其中，图3A显示了荧光定量多重PCR检测人冠状病毒HCoV-OC43、人冠状病毒HCoV-NL63和人冠状病毒HCoV-229E及阴性的检测结果；图3B显示了荧光定量多重PCR检测鼻病毒、偏肺病毒和副流感病毒1及阴性的检测结果。
图4为荧光定量多重PCR检测12个EGFR突变的结果；其中，图4A-4L显示：
人EGFR突变中p.L858R突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.L861Q突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.T790M突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.S768I突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.L747_T751delLREAT突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.E746_T751>A突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.L747_P753>S突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.L747_A750>P突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.E746_S752>V突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.E746_A750delELREA突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.E746_A750delELREA突变型、野生型及阴性，人EGFR突变中p.A767_V769dup突变型、野生型及阴性的检测结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，提供了一种多重预扩增多种靶核酸应用于荧光定量PCR检测的方法。本发明人通过优化预扩增引物，获得的特异性引物对集，在预扩增阶段可以高效地特异性扩增样品中不同类型的靶核酸。具体地，通过在预扩增步骤，对含有RNA靶核酸、DNA靶核酸或含有DNA与RNA混合靶核酸的样品，在一管中使用多对靶核酸的预扩增引物对进行扩增，其中靶核酸数目可以大于5、10、20、50、100、200。一管多重预扩增后获得的靶核酸丰度提高的扩增产物，再结合单重或多重荧光定量PCR多孔检测预扩增产物中的靶核酸，其中荧光定量PCR的反应孔数大于5、10、20、50、100、200甚至更多孔。本发明的一管多重预扩增不同类型靶基因间不会产生交叉反应，解决了多重PCR反应中容易出现非特异性反应的难题，具有良好的特异性和非常高的灵敏度，能够达到1.25拷贝/μL。在此基础上完成了本发明。
本发明的多重预扩增结合荧光定量PCR检测多种靶核酸的方法，验证了多重预扩增多靶核酸应用于荧光定量PCR检测的可行性，同时测试了一管多重预扩增产物进行单重荧光定量PCR和多重荧光定量PCR检测。其中预扩增的一管产物足够上百甚至更多孔的荧光定量PCR检测反应，实现了中高通量靶基因的检测。
术语
术语“多重预扩增”是指在一个PCR反应中，使用多对特异性引物对多个靶基因进行同时扩增。在本发明中，所述的多重通常指≥5重，较佳地20-400重，更佳地20-400重。
如本文所用，“多重预扩增多靶核酸结合单重或多重荧光定量PCR检测”、“预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测”可以互换使用，均指本发明第一方面所述的检测靶核酸的方法。
检测试剂及引物
本发明提供了一种检测病原体靶核酸的检测试剂，所述检测试剂包含一特异性引物对集，所述引物对集包含1-21对引物，所述引物的序列如下表A所示：
表A.
表A中的引物对用于预扩增病原体靶核酸。
此外，检测试剂还包括用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针，所述用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针包含选自表B中的引物对和探针。
表B.
在本发明中的一些实施例中，通过引物对反转录预扩增病原体的RNA以提高靶核酸丰度，其中引物对的序列如表1所示，每个引物对含有两个引物且可以选择性地与靶核酸杂交，所述引物在其3'末端具有双脱氧核苷终止(封闭基团)。每个引物从5’-3’具有如下表1所示的序列。
表1.多重预扩增病原体的RNA的引物
其中，所述引物对1特异性扩增偏肺病毒；引物对2特异性扩增鼻病毒；引物对3特异性扩增甲型流感病毒H1N1；引物对4特异性扩增副流感病毒1；引物对5特异性扩增副流感病毒2；引物对6特异性扩增副流感病毒3；引物对7特异性扩增人冠状病毒HCoV-HKU1；引物对8特异性扩增人冠状病毒HCoV-OC43；引物对9特异性扩增人冠状病毒HCoV-NL63；引物对10特异性扩增人冠状病毒HCoV-229E。
在一些实施例中，先通过多重预扩增病原体的DNA，提高靶核酸丰度，其中引物对的序列如表2所示，每个引物对含有两个引物且可以选择性地与靶核酸杂交，所述引物在其3'末端具有双脱氧核苷终止。
表2.多重预扩增DNA病原体引物对
在一些实施例中，荧光定量PCR检测预扩增病原体RNA的产物，其中引物组的序列如表3所示，由一对引物对和一个探针组成，每个引物对含有两个引物且可以选择性地与靶核酸杂交，所述探针在其5’端带有荧光基团和3’端淬灭基团，其中，除表3中所带的荧光基团FAM外，所述荧光基团还可以是选自VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、CY7；除表3中所带的淬灭基团BHQ1外，所述淬灭基团还可以是选自BHQ2、BHQ3、MGB或TAMARA：
表3.荧光定量PCR检测RNA病原体的引物和探针
在一些实施例中，荧光定量PCR检测预扩增病原体DNA的产物，其中引物组的序列如表4所示，由一对引物对和一个探针组成，每个引物对含有两个引物且可以选择性地与靶核酸杂交，所述探针在其5’端带有荧光基团和3’端淬灭基团，其中，除表4中所带的荧光基团FAM外，所述荧光基团还可以是选自VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、CY7；除表4中所带的淬灭基团BHQ1外，所述淬灭基团还可以是选自BHQ2、BHQ3、MGB或TAMARA。
表4.荧光定量PCR检测DNA病原体的引物和探针
试剂盒及其应用
本发明还提供了一种用于(a)检测病原体靶核酸；或(b)检测EGFR蛋白突变靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
一容器A以及位于所述容器内的预扩增靶核酸的引物对集；和/或
二容器B以及位于所述容器内的用于荧光定量PCR的引物对集和相匹配的探针；和
使用说明书。
在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。
在另一优选例中，所述预扩增靶核酸的引物对集包含3-50对用于特异性预扩增多种靶核酸的引物对。
在另一优选例中，所述靶核酸选自下组：单链DNA、双链DNA、cDNA、RNA、或其组合。
当所述试剂盒用于检测病原体靶核酸时，所述预扩增靶核酸的引物对集包括选自表A的引物对，和/或所述荧光定量PCR的引物对集和相匹配的探针包括选自表B的引物对和探针。
当所述试剂盒用于检测EGFR蛋白突变靶核酸时，所述预扩增靶核酸的引物对集包括选自表C的引物对，和/或所述荧光定量PCR的引物对集和相匹配的探针包括选自表D的引物对和探针。
在另一优选例中，所述的容器A和容器B为同一容器。
本发明的检测方法
本发明第一方面，提供了预扩增DNA多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法，其中所述方法包括：
(a)在一管中同时预扩增DNA多靶核酸时，提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)包含或怀疑包含所述多靶核酸的DNA核酸样品；
(ii)引物池包含至5对以上不同靶核酸类型的引物对，其中每种靶核酸引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；
(iii)核酸聚合酶和缓冲液；
(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；
(v)用于预扩增所述靶核酸时所述反应混合物的反应条件。
(b)应用荧光定量PCR单重或多重检测预扩增产物中的靶核酸时，提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)包含(a)多靶核酸预扩增后的核酸产物；
(ii)引物池包含至少1组以上不同靶核酸类型的引物组，每一种靶核酸对应一组引物组，所述引物组包含一对引物对和一个探针，其中每个引物对和探针与所述靶核酸的序列互补或相同；
(iii)核酸聚合酶和缓冲液；
(iv)用于荧光定量PCR检测所述靶核酸时所述反应混合物的反应条件。
在一些实施方案中，所述多靶核酸是单链或双链DNA。在一些实施方案中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。在一些实施方案中，所述方法用于选择性富集样品中的突变核酸，所述样品包含野生型核酸。在一些实施方案中，所述反应混合物包含至少11种以上不同类型的引物对。在一些实施方案中，所述引物中的每一个的长度均为8至100个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同类型的引物对可以互补地结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。在一些实施方案中，其中所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸盐或RNase H2。
本发明第二方面，提供了预扩增RNA多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法，其中所述方法包括：
(a)在一管中同时预扩增RNA多靶核酸时，提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)包含或怀疑包含所述多靶核酸的RNA核酸样品；
(ii)引物池包含至少5对以上不同靶核酸类型的引物对，其中每种靶核酸引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；
(iii)核酸聚合酶和缓冲液；
(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；
(v)用于预扩增所述靶核酸时所述反应混合物的反应条件。
(b)应用荧光定量PCR单重或多重检测预扩增产物中的靶核酸时，提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)包含(a)多靶核酸预扩增后的核酸产物；
(ii)引物池包含至少1组以上不同靶核酸类型的引物组，每一种靶核酸对应一组引物组，所述引物组包含一对引物对和一个探针，其中每个引物对和探针与所述靶核酸的序列互补或相同；
(iii)核酸聚合酶和缓冲液；
(iv)用于荧光定量PCR检测所述靶核酸时所述反应混合物的反应条件。
在一些实施方案中，所述反转录引物是，随机引物或多条基因特异性引物。在一些实施方案中，所述多靶核酸是RNA。在一些实施方案中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。在一些实施方案中，所述反应混合物包含至少10种以上不同类型的引物对。在一些实施方案中，所述引物中的每一个的长度均为8至100个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同类型的引物对可以互补地结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。在一些实施方案中，其中所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸盐或RNase H2。
本发明第三方面，在发明第二方面应用的基础上，提供了同时预扩增RNA和DNA多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法，其中所述方法包括：
(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的RNA和DNA混合核酸样品；
(ii)反转录引物；
(iii)引物池包含至少5对以上不同靶核酸类型的引物对，其中每种靶核酸引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；
(iv)核酸聚合酶；
(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合；
(vi)用于同时预扩增所述RNA和DNA多靶核酸时所述反应混合物的反应条件。
(b)应用荧光定量PCR单重或多重检测预扩增产物中的靶核酸时，提供反应混合物，所述反应混合物包含：
(i)包含(a)多靶核酸预扩增后的核酸产物；
(ii)引物池包含至少1组以上不同靶核酸类型的引物组，每一种靶核酸对应一组引物组，所述引物组包含一对引物对和一个探针，其中每个引物对和探针与所述靶核酸的序列互补或相同；
(iii)核酸聚合酶和缓冲液；
(iv)用于荧光定量PCR检测所述靶核酸时所述反应混合物的反应条件。
在一些实施方案中，所述反转录引物是，随机引物或多条基因特异性引物。在一些实施方案中，所述多靶核酸是RNA和DNA混合核酸。在一些实施方案中，所述封闭基团位于每个封闭引物的3'末端处，所述封闭基团是2',3'-双脱氧核苷酸。在一些实施方案中，所述修饰是在所述引物中引入至少一个错配的核苷酸。在一些实施方案中，所述反应混合物包含至少21种以上不同类型的引物对。在一些实施方案中，所述引物中的每一个的长度均为8至100个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同类型的引物对可以互补地结合不同的靶核酸或同一个靶核酸中的不同序列。在一些实施方案中，其中所述去封闭剂是具有F667Y突变的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸盐或RNase H2。
本发明的主要优点包括
(1)本发明解决了在一管中多重预扩增不同类型的多靶核酸或不同类型核酸的混合物，靶核酸数目可以大于5、10、20、50、100、200，提高了靶核酸丰度，一管多重预扩增产物可以结合荧光定量PCR进行多孔中高通量靶基因的检测，单孔单重或单孔多重检测靶核酸，检测反应孔数可以大于5、10、20、50、100、200，实现中高通量多靶核酸检测。
(2)本发明使用样品量非常少、过程操作简单和检测时间短。
(3)本发明具有一管多重预扩增产物可以实现上百甚至更多的荧光定量PCR检测反应、一次性检测靶点多、成本非常低、经济又高效等特点；
(4)本发明提供的多重预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR多孔检测的方法具有检测灵敏度高、特异性超强的巨大优势。一管多重预扩增不同类型靶基因间不会产生交叉反应，解决了多重PCR反应中容易出现非特异性反应的难题，同时还保持了非常高的灵敏度达到1.25拷贝/μL。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1多重预扩增DNA类型多靶核酸结合单重荧光定量PCR检测的方法检测病原体
(1)多重预扩增引物对和荧光定量PCR引物组的制备：
从GenBank获取9种DNA病原体包括腺病毒(B组、C组、E组)、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌和结核分枝杆菌的核酸序列，采用Clustalw2 Alignment软件进行同源性比对分析，确定各型靶标的保守序列区域，然后在保守区域内选择合适的序列，采用Primer Primier 3.0软件设计出11对特异的预扩增引物对和11组荧光定量PCR引物组，见表2预扩增DNA病原体引物对和表4荧光定量PCR检测DNA病原体的引物和探针
(2)DNA参考品制备：
根据腺病毒B组、腺病毒C组、腺病毒E组、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌和结核分枝杆菌的各型靶标的保守序列区域，以pcDNA3.1质粒为载体，在多克隆位点以BamHI和EcoRI酶切位点为插入位点，构建所述病原体的质粒11个。每个质粒参考品分别用TE缓冲液以10倍梯度稀释，从5x106拷贝/μl梯度稀释至5x103拷贝/μl，以每个质粒参考品5x103拷贝/μl为母液配制11个DNA病原体质粒混合参考品，其中每个质粒浓度为50拷贝/μl。
(3)多重预扩增DNA多靶核酸：
执行多重聚合酶链式反应(多重PCR)以选择性地扩增11个病原体质粒混合参考品的11个扩增子(从靶核酸区扩增出的产物)，使用表2的DNA病原体预扩增引物。将含有11个引物对(每个引物在其3'末端含有双脱氧核苷酸且引物浓度为0.5μM)的池加入到含有11个病原体质粒混合参考品(各自为50拷贝/μl)和25μL扩增反应混合物的单个PCR管中，加入不含DNA酶/RNA酶的水至50μL终体积，所述扩增反应混合物含有0.2mM dNTP、3mM MgCl2、90nM焦磷酸盐和2个单位的KlenTaq-S DNA聚合酶。将PCR管置于美国ABI Veriti 96孔梯度PCR仪上并运行以下温度曲线以获得DNA多靶核酸扩增的扩增子库：95℃2分钟；95℃15秒，60℃120秒，12个循环；保持在4℃。
(4)单重荧光定量PCR检测DNA病原体
执行单重荧光定量PCR检测11个DNA病原体，使用表4的DNA病原体检测引物和探针。单个病原体检测反应体系：取1μl(3)扩增子为模板，加入2x探针法酶反应液(Biovuetech，Cat.No.9000025)5μl，一种病原体引物组(引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.2uM)以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。11个DNA病原体检测需设置11个反应孔。在美国ABI 7900实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环,60℃收集FAM荧光信号，以ROX为参比荧光。
实验结果如图1所示。其中，图1A-K分别显示了腺病毒B组和阴性、腺病毒C组和阴性、腺病毒E组和阴性、肺炎衣原体和阴性、肺炎支原体和阴性、百日咳杆菌和阴性、肺炎链球菌和阴性、流感嗜血杆菌和阴性、肺炎克雷伯菌和阴性、卡他莫拉菌和阴性、结核分枝杆菌和阴性的检测结果。
实施例2多重预扩增RNA类型多靶核酸结合单重荧光定量PCR检测的方法检测病原体
(1)多重预扩增引物对和荧光定量PCR引物组的制备：
从GenBank获取10种RNA病毒包括偏肺病毒、鼻病毒、甲型流感病毒H1N1、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、人冠状病毒HCoV-HKU1、人冠状病毒HCoV-OC43、人冠状病毒HCoV-NL63和人冠状病毒HCoV-229E的核酸序列，采用Clustalw2 Alignment软件进行同源性比对分析，确定各型靶标的保守序列区域，然后在保守区域内选择合适的序列，采用Primer Primier 3.0软件设计出10对特异的预扩增引物对和10组荧光定量PCR引物组，见表1多重预扩增RNA病原体引物对和表3荧光定量PCR检测RNA病原体的引物和探针。
(2)RNA参考品制备：
根据(1)获取的各型靶标的保守序列区域，以pcDNA3.1质粒为载体，在多克隆位点以AscI和AgeI酶切位点为插入位点，构建(1)所述病毒的质粒10个。以各型病毒质粒为模板，用限制性内切酶AgeI线性化每个质粒，按照TranscriptAid T7 High YieldTranscription Kit(Thermo Scientific)说明书的步骤进行体外转录，转录产物再按照RapidOut DNA Removal Kit(Thermo Scientific)说明书消化DNA后得到纯化的RNA，用Thermo Nanodrop 2000分光光浓度计定量后待用，分装并于-70℃保存，作为体外转录RNA参考品。每种病毒体外转录RNA参考品分别用DEPC处理水以10倍梯度稀释，从5x106拷贝/μl梯度稀释至5x103拷贝/μl，以每种病毒体外转录RNA参考品5x103拷贝/μl为母液配制10种病毒体外转录RNA混合参考品，其中每个病毒RNA浓度为50拷贝/μl。
(3)多重预扩增RNA多靶核酸：
执行逆转录多重聚合酶链式反应(多重RT-PCR)以选择性地扩增10种病毒体外转录RNA混合参考品的10个扩增子(从靶核酸区扩增出的产物)，使用表1的RNA病原体预扩增引物。将含有10个引物对(每个引物在其3'末端含有双脱氧核苷酸且引物浓度为0.5μM)的池(参见表1)加入到含有10种病毒体外转录RNA混合参考品(各自为50拷贝/μl)和25μL扩增反应混合物的单个PCR管中，加入不含DNA酶/RNA酶的水至50μL终体积，所述扩增反应混合物含有10uM Random primer(N6)、0.2mM dNTP、3mM MgCl2、90nM焦磷酸盐和2个单位的KlenTaq-S DNA聚合酶。将PCR管置于美国ABI Veriti 96孔梯度PCR仪上并运行以下温度曲线以获得RNA多靶核酸扩增的扩增子库：25℃5分钟；42℃15分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃120秒，12个循环；保持在4℃。
(4)单重荧光定量PCR检测RNA病毒
执行单重荧光定量PCR检测10种RNA病毒，使用表3的RNA病原体检测引物和探针。单个RNA病毒检测反应体系：取1μl(3)扩增子为模板，加入2x探针法酶反应液(Biovuetech，Cat.No.9000025)5μl，一种病毒引物组(引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.2uM)以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。10个RNA病毒检测需设置10个反应孔。在美国ABI7500Fast实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环,60℃收集FAM、VIC、Texas Red、TAMRA和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
实验结果如图2所示。其中，图2A-J分别显示了偏肺病毒和阴性、鼻病毒和阴性、甲型流感病毒H1N1和阴性、副流感病毒1和阴性、副流感病毒2和阴性、副流感病毒3和阴性、人冠状病毒HCoV-HKU1和阴性、人冠状病毒HCoV-OC43和阴性、人冠状病毒HCoV-NL63和阴性、人冠状病毒HCoV-229E和阴性的检测结果。
实施例3多重预扩增RNA和DNA多靶核酸混合物结合单重和多重荧光定量PCR检测的方法检测病原体
(1)RNA和DNA参考品制备：
以实施例2的11个DNA病原体质粒混合参考品(每个病原体质粒DNA浓度为50拷贝/μl)和实施例2的10种RNA病毒体外转RNA混合参考品(每个病毒体外转录RNA浓度为50拷贝/μl)为参考品。
(2)多重预扩增RNA和DNA多靶核酸混合物：
执行逆转录多重聚合酶链式反应(多重RT-PCR)以选择性地扩增21种病原体RNA和DNA混合参考品的21个扩增子(从靶核酸区扩增出的产物)，使用表1的RNA病原体预扩增引物和表2的DNA病原体预扩增引物。将含有21个引物对(每个引物在其3'末端含有双脱氧核苷酸且引物浓度为0.5μM)的池加入到含有21种病原体RNA和DNA混合参考品(每个50拷贝/μl)和25μL扩增反应混合物的单个PCR管中，加入不含DNA酶/RNA酶的水至50μL终体积，所述扩增反应混合物含有10uM Random primer(N6)、0.2mM dNTP、3mM MgCl2、90nM焦磷酸盐和2个单位的KlenTaq-S DNA聚合酶。将PCR管置于美国ABI Veriti 96孔梯度PCR仪上并运行以下温度曲线以获得RNA和DNA多靶核酸扩增的扩增子库：25℃5分钟；42℃15分钟；95℃2分钟；95℃15秒，60℃120秒，12个循环；保持在4℃。
(3)单重和多重荧光定量PCR检测RNA和DNA病原体
(a)执行单重荧光定量单重PCR检测21种RNA和DNA病原体，使用表3的RNA病原体检测引物探针和表4的DNA病原体检测引物探针。单个病原体检测反应体系：取1μl(3)扩增子为模板，加入2x探针法酶反应液(Biovuetech，Cat.No.9000025)5μl，一种病原体引物组(引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.2uM)以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。21种病原体检测需设置21个反应孔。在美国ABI 7500Fast实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环,60℃收集FAM、VIC、Texas Red、TAMRA和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
(b)执行多重荧光定量PCR检测6种RNA病原体，使用表3的RNA病原体检测引物探针。单孔多种病原体检测反应体系：取1μl(3)扩增子为模板，加入2x探针法酶反应液(Biovuetech，Cat.No.9000025)5μl，引物池包含三种不同病原体的引物组组合(每个引物浓度为0.3μM，每个探针浓度为0.2uM)以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。6种病原体检测设置2个反应孔，孔1引物池为人冠状病毒HCoV-NL63、人冠状病毒HCoV-OC43和人冠状病毒HCoV-229E的引物组组合，孔2引物池为鼻病毒、偏肺病毒和副流感病毒1的引物组组合。在美国ABI 7500fast实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环,60℃收集FAM、VIC、Texas Red、TAMRA和CY5荧光信号，以ROX为参比荧光。
荧光定量多重PCR的实验结果如图3所示。其中，图3A、3B分别显示了荧光定量多重PCR检测人冠状病毒HCoV-OC43、人冠状病毒HCoV-NL63和人冠状病毒HCoV-229E及阴性的检测结果；图3B显示了荧光定量多重PCR检测鼻病毒、偏肺病毒和副流感病毒1及阴性的检测结果。
实施例4多重预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测方法的灵敏性评价
(1)灵敏性参考品制备：
为评价方法的检测灵敏性，以浓度为5x104拷贝/μl的病原体质粒DNA参考品为母液配制11种DNA病原体质粒混合参考品，其中每个病原体质粒浓度为500拷贝/μl，以TE缓冲液稀释至以下梯度浓度，作为灵敏性参考品：
50拷贝/μl灵敏度参考品；
5拷贝/μl灵敏度参考品；
2.5拷贝/μl灵敏度参考品；
1.25拷贝/μl灵敏度参考品。
(2)预扩增DNA多靶核酸和荧光定量PCR检测DNA病原体同实施例1。
(3)灵敏度检测结果见表5。
表5.检测DNA病原体的灵敏度检测结果
由检测结果可知，本方法同时检测腺病毒B组、腺病毒C组、腺病毒E组、肺炎衣原体、肺炎支原体、百日咳杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌和结核分枝杆菌的最低检测限为2.5拷贝/μL，除腺病毒C组与肺炎链球菌外，其余DNA病原体检测限甚至能检测到1.25拷贝/μL，表明本方法具有非常高的灵敏度。
实施例5多重预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测方法的特异性
特异性参考品制备：
为评价方法的检测特异性，分别以每种DNA和RNA病原体参考品5x104拷贝/μl为母液配制成以下RNA和DNA病原体混合的特异性参考品,共18个混合模板池，每个混合模板池分别缺少一种病原体参考品，见表6，其中每种病原体浓度为500拷贝/μl。
表6. 18个混合模板池
(2)预扩增多靶核酸和荧光定量PCR检测病原体同实施例3。
(3)特异性检测结果见表7。
表7.特异性检测结果
由检测结果可知，在特定的DNA和RNA混合模板池中，当不含有某一种模板时，本方法中的荧光定量PCR检测这一模板就会给出阴性的结果(Ct＝40)。也就是说，模板池中众多的模板(扩增子库)与该病原体引物之间不会发生任何交叉反应，表明本检测方法具有极高的特异性。
实施例6多重预扩增DNA多靶核酸结合单重荧光定量PCR检测的方法检测EGFR突变
(1)多重预扩增引物对和荧光定量PCR引物组的制备：
从COSMIC获取12种常见人EGFR突变包括c.2573T>G(p.L858R)、c.2582T>A(p.L861Q)、c.2369C>T(p.T790M)、c.2303G>T(p.S768I)、c.2240_2254del15(p.L747_T751delLREAT)、c.2237_2251del15(p.E746_T751>A)、c.2240_2257del18(p.L747_P753>S)、c.2239_2248TTAAGAGAAG>C(p.L747_A750>P)、c.2237_2255>T(p.E746_S752>V)、c.2236_2250del15(p.E746_A750delELREA)、c.2235_2249del15(p.E746_A750delELREA)、c.2300_2308dup(p.A767_V769dup)的核酸序列，采用Primer Primier 3.0软件设计出12对特异的预扩增引物对和12组荧光定量PCR引物组，预扩增引物对见表8，突变检测荧光定量PCR引物组见表9。
表8.多重预扩增EGFR突变引物对
表9.荧光定量PCR检测EGFR突变的引物和探针
(2)DNA参考品制备：
根据12种常见人EGFR突变包括c.2573T>G(p.L858R)、c.2582T>A(p.L861Q)、c.2369C>T(p.T790M)、c.2303G>T(p.S768I)、c.2240_2254del15(p.L747_T751delLREAT)、c.2237_2251del15(p.E746_T751>A)、c.2240_2257del18(p.L747_P753>S)、c.2239_2248TTAAGAGAAG>C(p.L747_A750>P)、c.2237_2255>T(p.E746_S752>V)、c.2236_2250del15(p.E746_A750delELREA)、c.2235_2249del15(p.E746_A750delELREA)、c.2300_2308dup(p.A767_V769dup)的突变核酸序列及包含对应上述所有突变位点的全长野生型核酸序列，以pcDNA3.1质粒为载体，在多克隆位点以BamHI和EcoRI酶切位点为插入位点，构建所述突变质粒12个和1个野生型质粒。野生型质粒参考品以TE缓冲液稀释至104拷贝/μl，每个突变质粒参考品分别用上述104拷贝/μl野生型质粒稀释液稀释至100拷贝/μl，制成12个突变频率为1％的质粒参考品。
(3)多重预扩增EGFR突变多靶核酸：
执行多重聚合酶链式反应(多重PCR)以选择性地扩增12个在野生型质粒背景下EGFR突变质粒中的12个扩增子(从靶核酸区扩增出的产物)而不扩增野生质粒，使用表8多重预扩增EGFR突变引物对。将含有12个引物对(每个引物在其3'末端含有双脱氧核苷酸且引物浓度为0.5μM)的池(参见表8)分别加入到含有12个EGFR突变质粒参考品(各自为12个104拷贝/μl、突变频率1％)及野生质粒参考品和25μL扩增反应混合物的单个PCR管中，加入不含DNA酶/RNA酶的水至50μL终体积，所述扩增反应混合物含有0.2mM dNTP、3mM MgCl2、90nM焦磷酸盐和2个单位的KlenTaq-S DNA聚合酶。将PCR管置于美国ABI Veriti 96孔梯度PCR仪上并运行以下温度曲线以获得DNA多靶核酸扩增的扩增子库：95℃2分钟；95℃15秒，65℃120秒，12个循环；保持在4℃。
(4)单重荧光定量PCR检测EGFR突变
执行单重荧光定量PCR检测12个EGFR突变，使用表9荧光定量PCR检测EGFR突变的引物探针。单个病原体检测反应体系：取1μl(3)扩增子为模板，加入2x探针法酶反应液(Biovuetech，Cat.No.9000025)5μl，一种病原体引物组(引物浓度为0.3μM，探针浓度为0.2uM)，见表9以及补充不含DNA酶/RNA酶的水至总体积10μL。11个DNA病原体检测需设置11个反应孔。在美国ABI7900实时荧光定量PCR仪上运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，60℃60秒，40个循环,60℃收集FAM荧光信号，以ROX为参比荧光。
实验结果如图4所示。
(5)结果见表10
表10. 12个EGFR突变的检测结果
结果表明：本发明中的方法通过一管中多重选择性预扩增EGFR突变多靶核酸，提高了EGFR突变多靶核酸的丰度，结合荧光定量PCR能够轻松地检测到1％的EGFR突变含量甚至更低丰度的EGFR突变，且Ct值低信号强，能够很好的区分突变型和野生型模板，在基因突变检测方面具有优异的检测灵敏性和特异性。
讨论：
1.本发明提供了一种在一管中既可以多重预扩增DNA或RNA靶核酸又可以多重预扩增DNA或RNA靶核酸混合物的方法
与现有技术中所公开的扩增靶核酸的方法相比，现有技术中仅针对多重预扩增DNA靶核酸进行了研究，应用在测序平台上，但未进一步研究和阐述多重预扩增RNA靶核酸或DNA与RNA的混合靶核酸。本发明进一步优化扩增方法，通过优化的预扩增引物，实现在一管中多重预扩增多靶核酸。其中，靶核酸可以是不同类型的核酸(RNA靶核酸或DNA靶核酸)或不同类型核酸的混合物，靶核酸数目可以大于5、10、20、50、100、200。
2.本发明通过多重预扩增多靶核酸，扩增产物用于单重或多重荧光定量PCR多孔检测，实现中高通量靶基因的检测。
一管多重预扩增多靶核酸后，扩增产物既可以应用于测序、电泳、质谱和干化学反应等领域，也可以应用于荧光定量PCR检测，但现有技术中并无扩增产物应用于荧光定量PCR的相关研究。本发明中的方法涉及在一管中多重预扩增多靶核酸，提高靶核酸丰度，结合单重或多重荧光定量PCR多孔检测预扩增产物中的靶核酸。其中，检测反应孔数可以大于5、10、20、50、100、200，即本发明验证了多重预扩增多靶核酸应用于荧光定量PCR检测的可行性，同时测试了一管多重预扩增产物进行单重荧光定量PCR和多重荧光定量PCR检测。特别地，一管产物足够上百甚至更多孔的荧光定量PCR检测反应，从而实现了中高通量靶基因的检测。
3.一管中多重预扩增多靶核酸反应结合荧光定量PCR检测的方法是两步法反应，需要第一步多重预扩增后开管，取扩增产物进行第二步的荧光定量PCR检测反应。开管操作不当，易导致环境和仪器设备的污染，因此对操作要求比较高。本发明人目前正在进行一步法研究。具体地，在一管中进行多重预扩增多靶核酸检测，并直接得出结果，从而进一步优化本发明的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海翔琼生物技术有限公司
<120> 预扩增多靶核酸结合荧光定量PCR检测的方法
<130> P2021-0842
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<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggctcgctcc cgtaaac 17
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgccaggtcc gctaca 16
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caccgcttcg tggactt 17
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggcggtaaac atattaggaa cca 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgtgcttagt ggtgggggtg 20
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttgttggtgg aggaggtgtt tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggctggacgg gcaatc 16
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aggcccgaat cacacca 17
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gctgcttgta gttcmtctaa c 21
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cgaaataaac ggtgttgtaa cg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gctaagacta aagtagatgt tacc 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacgcccaca tttgctaatg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
actacgccat gagtgttatc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcaagaagg ggctgcttt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cgggagctcc gtaatttaca tggtgcagct gcc 33
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tcctccggcc cctgaatg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
attgtcacca taagcaattg at 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggatgggacc gactactttg ggtgtccg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
accacaactg cctgtcttat c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
atgcagtggg gttttcggag acaatccacg cccta 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tgttgccagt tccttcttca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
tggttattct gtcacaccat ttg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
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<210> 65
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
attcttatgg tggagcgtct att 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aacctgaaca catttaccct taaac 25
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
tcgggcccac gttcctcacc ctagtatgga tgg 33
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
aacgtgtcgt taaattgcag aac 23
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atgccgggca agatgaaggt caaggccacc aa 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
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<210> 74
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ggctcgctcc cgtaaac 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
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<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cctgtgatgc tggatgtga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
agctgaggcc cgatcacttg gtgctggc 28
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tgaagggcat actgacgagc 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
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<210> 84
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tgctttagga gcacgacgag ccaatgcga 29
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gggttcttca ggctcaggtc 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
gaggtgtttc cgtcactcgt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
agtgagtggg tggcttgtgg ggcagt 26
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gacgggcaat ccttcagctt 20
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
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<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gtagttgcgg gttgatcgt 19
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gtagatgtta ccagccgtaa tgc 23
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
aacgcccaca tttgctaatg g 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
aagccaacac caacaccgcc tgc 23
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
actacgccat gagtgttatc g 21
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<211> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gcgacggtga acaggttt 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
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<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tcacaccaag gtcgtacagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
atacgcttcg cgacgatcgc acctgccc 28
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tggtcgccaa cgtctaca 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gtagttgcgg gttgatcgt 19
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ttcaacgtca ggccggctgc accaacga 28
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
catgtcaaga tcacagaatt tgggcg 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gtcaagatca cagaatttgg gctggccaaa ca 32
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
tgcctcacct ccaccgtcca gctcatcat 29
<210> 111
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
tattgtcttt gtgttcccgg aca 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tccatgtgcc cctccttctg 20
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gcaggcggca cacgtggggg ttgtccacga 30
<210> 114
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
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<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
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<210> 116
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
agttaaaatt cccgtcgcta tcaaggc 27
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ccccacacag caaagcagaa act 23
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
aagttaaaat tcccgtcgct atcaaggaat c 31
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ccccacacag caaagcagaa act 23
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
agttaaaatt cccgtcgcta tcaaggaac 29
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
ccccacacag caaagcagaa act 23
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
gaaagttaaa attcccgtcg ctatcaaggt 30
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ccccacacag caaagcagaa act 23
<210> 124
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
gagaaagtta aaattcccgt cgctatcaag a 31
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ccccacacag caaagcagaa act 23
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ggtgagaaag ttaaaattcc cgtcgctatc aaa 33
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ccccacacag caaagcagaa act 23
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
tccatgtgcc cctccttctg 20
<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ttgtccacgc tggccacg 18
<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
gatcacagaa tttgggcg 18
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
ctgggtgcgg aagagaaaga ataccatg 28
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
tgacctaaag ccacctcctt 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
gaatttgggc tggccaaaca 20
<210> 134
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
ctgggtgcgg aagagaaaga ataccatg 28
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
tgacctaaag ccacctcctt 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
acctccaccg tccagctcat ctt 23
<210> 137
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
agctcatgcc cttcggctgc ctcctgga 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
tgtctttgtg ttcccggaca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
tccatgtgcc cctccttctg 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
cgtgcctctc cctccctcca gga 23
<210> 141
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
ggcacacgtg ggggttgtcc acaa 24
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
ccgtcgctat caaggaatct 20
<210> 143
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 28
<210> 144
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
cccacacagc aaagcagaa 19
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
ccgtcgctat caaggcatct 20
<210> 146
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 28
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccacacagc aaagcagaa 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
ccgtcgctat caaggaatcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 28
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
cccacacagc aaagcagaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
ccgtcgctat caaggaacca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccgtcgctat caaggttccg 20
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aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 28
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cccacacagc aaagcagaa 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 28
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccacacagc aaagcagaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
ccgtcgctat caaaacatct 20
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<211> 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgag 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
cccacacagc aaagcagaa 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
tccatgtgcc cctccttctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
cgtgcctctc cctccctcca gga 23
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
ttgtccacgc tggccacg 18
Claims (11)
1.一种多重预扩增结合荧光定量PCR检测多种靶核酸的方法，包括：
(a)提供一待检测的样品；
(b)对(a)中所述样品，使用第一引物池在第一反应体系中对所述样品中的靶核酸进行多重预扩增，获得预扩增反应混合物；其中，所述第一引物池包含N对预扩增靶核酸的引物对，所述N≥5(较佳地，5≤N≤500；更佳地，20≤N≤400)；
(c)对上一步骤中的反应混合物，通过荧光定量PCR在M个检测体系中检测靶核酸，其中M≥1(较佳地≥5、10、20、50、100、200)，
其中，M/N＝1-50，较佳地，M/N＝2-20；
其中，每个检测体系中有1-6种靶核酸，较佳地2-3种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR包括单重或多重PCR。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸选自下组：单链DNA、双链DNA、cDNA、RNA、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应体系包含：
(i)包含或怀疑包含所述靶核酸的核酸样品；
(ii)第一引物池，其包含至少5、10、20、50、100、200对以上不同预扩增靶核酸的引物对，其中每种引物对的至少一个引物与所述靶核酸的一部分互补，并且每个引物对具有至少一个封闭引物，所述封闭引物包含能够阻断聚合酶延伸的封闭基团；
(iii)第一核酸聚合酶和第一缓冲液；
(iv)去封闭剂，所述去封闭剂能够使所述靶核酸通过所述封闭引物由所述核酸聚合酶进行聚合。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一引物池包含选自下表A中的引物对：
表A
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测体系包含：
(i)包含步骤(b)中的预扩增反应混合物；
(ii)第二引物池，其包含L种不同靶核酸的引物组，其中每种靶核酸各自独立地对应一组引物组，所述引物组包含配合使用的荧光PCR的引物对和探针，其中荧光PCR的引物对和探针各自独立地与所述靶核酸的部分序列互补或相同；
(iii)第二核酸聚合酶和第二缓冲液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二引物池包括选自下表B中的荧光PCR的引物对和探针：
表B.
8.一种检测病原体靶核酸的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包含一特异性引物对集，所述引物对集为选自表A的引物对。
9.如权利要求8所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针。
10.如权利要求8或9中所述的检测试剂的用途，其特征在于，所述试剂
(a)用于制备检测病原体靶核酸的试剂盒；或
(b)用于制备检测EGFR蛋白突变靶核酸的试剂盒。
11.一种用于(a)检测病原体靶核酸；或(b)检测EGFR蛋白突变靶核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
一容器A以及位于所述容器内的预扩增靶核酸的引物对集；和/或
一容器B以及位于所述容器内的用于荧光定量PCR检测的特异性引物对集和探针；和使用说明书。
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