CN116024320A - 一种用于检测核酸的荧光定量pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测核酸的荧光PCR方法。该方法通过结合引物激活聚合反应和特异性荧光标记‑探针，能够高选择性和高特异性的检测目标核酸。
Description
相关申请的引用
本申请要求2022年7月13提交的中国申请202210828832.7的优先权。其公开内容在此参考并入。
技术领域
本公开涉及分子生物学领域，特别涉及聚合酶链式反应(polymerase chainreaction)扩增和核酸定量检测的方法。具体地，本公开涉及一种利用引物激活聚合结合荧光探针的定量PCR方法，例如焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis activatedpolymerization,PAP)结合荧光探针的检测核酸的定量PCR方法。
背景技术
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)作为扩增特定的DNA片段的方法广泛地应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、基因克隆和DNA序列测定等各方面。常规PCR反应由于引物和模版DNA的互补有一定的容错性，导致在大量非靶序列DNA存在的情况下会产生非特异性扩增。因此，通常无法使用常规PCR反应检测有大量野生型DNA存在的样品中检测微量或少量突变型序列。
引物激活聚合反应是一类特殊的核酸扩增反应，可以在有强背景DNA存在的样品中精确检测模板DNA，为临床或科研领域检测低频突变或稀有突变提供了一种重要的检测手段。引物激活聚合反应体系中，使用了一类特异性修饰的封闭引物(比如引物3’末端双脱氧核苷酸修饰)，该封闭引物只有在与模板DNA链互补结合，在去封闭剂的作用下解封闭(激活)时，才能在聚合酶介导DNA链合成反应。因此，引物激活聚合反应需要引物精准识别模板被激活再触发聚合反应。与普通PCR相比，此类反应具有特异性修饰引物的高选择性和反应的高特异性两大特点，可以保证扩增产物不是由引物和背景DNA序列结合产生的，大大降低了反应的假阳性。
典型的引物激活聚合反应包括焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysisactivated polymerization,PAP)，该反应使用了3’末端双脱氧核苷酸修饰的封闭引物，在合适的反应体系下，利用DNA聚合酶的焦磷酸解反应串联聚合反应进行核酸扩增(Liu Q,Sommer SS,Biotechniques 2000,29:1072-1076,1078,1080)。封闭引物在无模板或与模板不互补状态下，其3’末端双脱氧核苷酸不能发生焦磷酸解去除封闭，引物不激活则无法进行后续的由DNA聚合酶介导的聚合反应。只有当封闭引物与模板互补时，在焦磷酸盐缓冲液条件下DNA聚合酶发生焦磷酸解反应解除引物3’末端封闭，依赖于DNA模板的DNA聚合酶才能沿着引物延伸发生聚合反应。与普通PCR相比，PAP技术使用3'末端双脱氧核苷酸修饰的封闭引物，利用DNA聚合酶的焦磷酸酶活性激活引物和DNA聚合酶的聚合活性进行聚合反应，焦磷酸解活性的特异性和聚合反应本身的特异性相互叠加形成了PAP反应的高选择性和无可比拟的高特异性。
PCR反应的扩增产物可以用荧光方法加以检测。目前用于检测核酸扩增的荧光方法可以分为两种主要类型：1)非特异性荧光标记-染料法(例如SYBR Green I)，和2)特异性荧光标记-探针法(例如
探针)。在非特异性荧光标记-染料法中，PCR扩增时染料能够非特异性地嵌入双链DNA发出较强的荧光，但非特异性扩增或引物二聚体形成也能产生假信号，而且染料法不能用于多重PCR扩增区分多个靶核酸。特异性荧光标记-探针法利用Taq DNA聚合酶聚合延伸时，其5’–>3’核酸外切酶活性水解结合在模板DNA上的探针，释放荧光基团而发出荧光，具有特异性高、灵敏度高和重复性好的特点，同时通过标记不同荧光基团的探针可以进行多重PCR区分多个靶核酸。
具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I或具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(Taq-F667Y)对ddNTP的掺入活性分别超过E.coli DNA聚合酶I或Taq DNA聚合酶(Taq)的2000多倍(Tabor S and Richardson CC，Proc.Natl.Acad.Sci.,1995,92:6339-6343)。切除N片段(N端280个氨基酸)的Taq(KlenTaq)的DNA复制保真度比全长Taq的高2.8倍(Barnes WM,Gene,1992,112:29-35)。KlenTaq具有5’-3’DNA聚合酶活力，但没有5’-3’DNA外切酶活力。目前在PAP技术中使用的DNA聚合酶，如KlenTaq-s(KlenTaq-s是具有F667Y突变的KlenTaq)，具有焦磷酸酶活性与5’–>3’DNA聚合酶活力，但没有5’-3’的外切酶活性，不能对探针进行酶切，无法使用荧光探针来对PCR反应的扩增产物进行检测。而染料法用于PAP技术有着特异性不好和无法区分多重靶标的缺陷。CN111172245A公开了一种测定核酸的焦磷酸解激活性荧光PCR方法，在PAP反应中使用了一种荧光基团-淬灭基团双标记的封闭引物，该引物的内部区域或5’末端核苷酸带有一个荧光基团，3’末端封闭核苷酸则带有一个淬灭基团，一旦发生焦磷酸解反应解除引物3’末端封闭就会发出荧光。但该方法在发生非特异性扩增或形成引物二聚体时也会产生假信号。
因此，本领域迫切需要开发一种可以结合封闭引物激活聚合反应和特异性荧光标记-探针的高选择性和高特异性的核酸检测方法。
发明概述
本公开的一个方面提供一种结合引物激活聚合反应和特异性荧光标记-探针的核酸检测方法。在某些实施方式中，所述方法包括：
准备PCR反应体系，所述PCR反应体系包含：
(i)包含或怀疑包含靶序列的核酸样品；
(ii)核酸聚合酶或核酸聚合酶组合，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合具有5’–>3’聚合酶活性以及5’–>3’的核酸外切酶活性；
(iii)用于扩增所述靶序列以产生扩增子的引物对，所述引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含位于封闭引物3’端的封闭核苷酸，其中所述封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸；
(iv)与靶序列或扩增子序列互补的探针，所述探针包含连接荧光基团的第一核苷酸和连接淬灭基团的第二核苷酸，其中所述荧光基团的荧光信号在所述第一核苷酸未从所述探针上水解时被所述淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第一核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述探针上水解，从而使得所述荧光基团的荧光信号不被所述淬灭基团淬灭；和
(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够在所述封闭核苷酸与所述靶序列或所述扩增子杂交时将所述封闭核苷酸从所述封闭引物上去除，使得所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够从所述封闭引物延伸；
将所述PCR反应体系在适当反应条件下进行扩增反应；和
检测所述PCR反应体系的荧光信号。
在某些实施方式中，所述PCR反应体系还包含
(vi)用于扩增第二靶序列以产生第二扩增子的第二引物对，所述第二引物对包含第二封闭引物，所述第二封闭引物包含位于第二封闭引物3’端的第二封闭核苷酸，其中所述第二封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸，以及
(vii)与第二靶序列或第二扩增子序列互补的第二探针，所述第二探针包含连接第二荧光基团的第三核苷酸和连接第二淬灭基团的第四核苷酸，其中所述第二荧光基团的荧光信号在所述第三核苷酸未从所述探针上水解时被所述第二淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第三核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述第二探针上水解，从而使得所述第二荧光基团的荧光信号不被所述第二淬灭基团淬灭。
在另一个方面，本公开提供了一种多重检测核酸方法，所述方法包括：
准备PCR反应体系，所述PCR反应体系包含：
(i)包含或怀疑包含所述多个靶序列的核酸样品；
(ii)核酸聚合酶或核酸聚合酶组合，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合具有5’–>3’聚合酶活性以及5’–>3’的核酸外切酶活性；
(iii)用于分别扩增所述多个靶序列以产生多个扩增子的多个引物对，其中每个引物对包含至少一条各自的封闭引物，所述各自的封闭引物包含位于封闭引物3’端的封闭核苷酸，其中所述封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸；
(vi)分别与所述多个靶序列或扩增子序列互补的多个探针，其中每个探针分别包含连接荧光基团的第一核苷酸和连接淬灭基团的第二核苷酸，其中所述荧光基团的荧光信号在所述第一核苷酸未从所述探针上水解时被所述淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第一核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述探针上水解，其中所述多个探针包含相同或不同的荧光基团；
(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够在所述各自的封闭引物的所述封闭核苷酸与其相应的靶序列或扩增子杂交时将所述封闭核苷酸从所述各自的封闭引物上去除，使得所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够从所述封闭引物延伸；
将所述PCR反应体系在适当反应条件下进行扩增反应；和
检测所述PCR反应体系的荧光信号。
在某些实施方式中，所述封闭核苷酸是2’,3’-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2’,3’SH核苷酸或2’-O-PO3核苷酸。
在某些实施方式中，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合包含去封闭剂的功能。在某些实施方式中，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合还具有焦磷酸酶活性。在某些实施方式中，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合选自下组：(1)具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I，(2)具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(Taq-F667Y)、以及(3)切除了N片段并具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(KlenTaq-s)与具有5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的组合。在某些实施方式中，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合还可以经过修饰，如化学修饰或抗体修饰等，以提高核酸聚合酶扩增的特异性。在某些实施方式中，所述核酸聚合酶为经柠檬酸酐(Citraconic Anhydride)修饰封闭酶活性的Taq-F667Y(Taq-F667Y/CA)。
在某些实施方式中，所述具有5’–>3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶选自下组：TaqDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶I，及各类DNA聚合酶I。
在某些实施方式中，其中所述去封闭剂选自下组：具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I、Taq-F667Y、Taq-F667Y/CA、KlenTaq-s、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、RNase H2和CS5 DNA聚合酶，其中所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或这些突变的组合。
在某些实施方式中，所述探针荧光基团选自下组：FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、和CY7。
在某些实施方式中，所述探针淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB和TAMARA。
在某些实施方式中，所述靶序列包含突变核苷酸，所述封闭核苷酸与所述突变核苷酸互补。
在某些实施方式中，所述封闭引物还可能包含错配核苷酸，所述错配核苷酸在所述封闭引物与所述靶序列杂交时不与靶序列互补。在某些实施方式中，所述错配核苷酸和所述探针互补。在某些实施方式中，所述错配核苷酸与封闭核苷酸相距2-18个核苷酸。
在某些实施方式中，所述封闭引物的长度为8至70个核苷酸。
在某些实施方式中，所述的方法进一步包括检测所述扩增子的扩增Ct值。
在某些实施方式中，所述核酸样品包含修饰或没有修饰的单链DNA、双链DNA、RNA、cDNA或其组合。
应理解，在本公开范围内中，上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1示意了引物激活聚合结合探针检测核酸的原理。
图2A显示了Taq-F667Y用于引物激活聚合结合探针的荧光PCR单重扩增突变型质粒和野生型质粒的结果。
图2B显示了Taq-F667Y/CA用于引物激活聚合结合探针的荧光PCR单重扩增突变型质粒和野生型质粒的结果。
图2C显示了KlenTaq-s与Taq组合用于引物激活聚合结合探针的荧光PCR单重扩增突变型质粒和野生型质粒的结果。
图3A显示了Taq-F667Y用于引物激活聚合结合探针的荧光PCR多重扩增突变型质粒和野生型质粒的结果。
图3B显示了Taq-F667Y/CA用于引物激活聚合结合探针的荧光PCR多重扩增突变型质粒和野生型质粒的结果。
图3C显示了KlenTaq-s与Taq组合用于引物激活聚合结合探针的荧光PCR多重扩增突变型质粒和野生型质粒的结果。
发明详述
本公开在一个方面提供了一种新的引物激活聚合结合探针的用于检测核酸的荧光PCR方法，包括单重荧光PCR和多重荧光PCR。单重荧光PCR结合引物激活聚合反应包括至少一个封闭引物的引物对及探针的组合，可以高选择性和高特异性地检测相应的靶序列。多重荧光PCR结合引物激活聚合反应包括N对引物对(N>1)，每一引物对含有至少一个封闭引物，和N个探针组合，而使用多个荧光基团-淬灭基团双标记探针可进行多重荧光PCR，利用不同的荧光基团和扩增Ct值以检测多个靶序列。
以下对本公开的描述仅打算说明本公开的各种实施方式。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。所属领域的技术人员将显而易见，可在不脱离本公开的范围的情况下得到各种等效物、进行改变和修改，且应理解所述等效实施例将包含在本文中。本文引用的所有参考文献，包含出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
术语
如本文所用，“一”和“所述”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“一蛋白”意指一种蛋白或多于一种蛋白。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
如本文所用，术语“聚合酶链式反应”或“PCR反应”是指一种核酸扩增反应，其用于扩增包含特定序列的核酸。常规的PCR反应体系中包括：模板DNA、核酸聚合酶、引物、dNTP、Mg2+，以及缓冲液。常规PCR反应包括一系列循环的变温步骤，每个循环起始于在高温(经常是95℃左右)将模版DNA变性为单链，然后在低温(经常是60℃左右)中使引物与单链模版DNA按碱基互补配对的原则结合，再调温至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，使得DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，从而使得模版DNA的量在每个循环中倍增。
如本文所用，术语“荧光PCR反应”是指将PCR反应与荧光检测技术相结合，使得能够根据监测到的荧光信号的强度来定量监测核酸扩增的方法。
如本文所用，术语“荧光基团”、“荧光分子”可互换使用，是指可产生荧光的基团或分子。当荧光基团吸收短波长的光能后，可发射出更长波长的荧光。每个荧光基团具有特征性的吸收光谱和特征性的发射光谱。荧光基团最有效吸收能量的特定波长称为峰值吸收，而荧光团最有效发射荧光的波长称为峰值发射。在一些实施方式中，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、和CY7。
如本文所用，术语“淬灭基团”、“淬灭分子”或“淬灭剂”可互换使用，是指减低荧光基团输出荧光强度的基团或分子。其具有特征性的吸收光谱和吸收峰值。为了使通过荧光共振能量转移(FRET)的机理起作用，其淬灭基团的吸收光谱要与荧光基团的发射光谱相重叠，并且其距离荧光基团足够近，例如不超过30个核苷酸。在一些实施方式中，所述淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB和TAMARA。
如本文所用，术语“焦磷酸化反应”或“焦磷酸化”是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在具体的实施方式中，在焦磷酸的存在下，聚合酶可从双链DNA上将3'末端核苷酸去除而生成一个三磷酸核苷和一个3'末端去除了这个核苷酸的双链DNA：[dNMP]n+PPi→[dNMP]n-1+dNTP(Deutscher and Kornberg,1969)。
如本文所用，术语“引物”是用于核酸扩增反应(或核苷酸聚合作用)起始时，一种用于刺激合成的具有特定核苷酸序列的大分子，其与反应物以氢键形式连接。在具体的实施方式中，引物成对出现(即引物对)，其通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与待扩增区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与待扩增区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。在一些实施方式中，所述引物对中每个引物的长度各自独立地为8至70个核苷酸；较佳地，8至50个核苷酸；最佳地，8至30个核苷酸。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合形式或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以具有任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、调控区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性的或环状的。
如本文所用，术语“包含靶序列的核酸”、“靶核酸”、“待测核酸”或“目标核酸”可互换使用，是指在荧光PCR方法中进行特异性扩增的核酸片段，或在PCR反应体系中可引发可检测信号的核酸片段，或利用核酸检测方法能够特异性地检测出的核酸片段。本公开的待测核酸可以是具有特定位点突变的核酸片段，也可以是复杂背景下的微量的特定核酸片段。在一些实施方式中，所述待测核酸并非单一的待测核酸片段，其可包括N种不同的待测核酸。在一些实施方式中，本公开的待测核酸包括：修饰或没有修饰的单链DNA、双链DNA、RNA、cDNA或其组合。在一些实施方式中，所述靶核酸包括野生型或突变型。
如本文所用，术语“核苷酸”是核酸的基本组成单位。核苷酸以一個含氮鹼基為核心，加上一個五碳醣和一個或者多个磷酸基團組成。含氮碱基有五种，分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。五碳糖为去氧核糖的核苷酸称为去氧核糖核苷酸(DNA的单体)，五碳糖为核糖的核苷酸称为核糖核苷酸(RNA的单体)。在本公开中，核苷酸包括但不限于脱氧核糖核苷酸胸腺嘧啶(dTMP)、脱氧核糖核苷腺嘌呤(dAMP)、脱氧核糖核苷酸鸟嘌呤(dGMP)、脱氧核糖核苷酸胞嘧啶(dCMP)、脱氧核糖核苷酸尿嘧啶(dUMP)等，或修饰的上述核苷酸。
如本文所用，术语“核酸聚合酶”是用于引物激活聚合反应体系中的核酸聚合酶，其用于聚合或延伸脱氧核糖核酸。本公开中使用的核酸聚合酶包括E.coli DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶以及它们的突变体。在某些实施方式中，本公开使用的核酸聚合酶还具有5'-3'外切酶活性。在某些实施方式中，本公开中使用的核酸聚合酶包括具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I，具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(Taq-F667Y)、以及切除了N片段并具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(KlenTaq-s)。
核酸检测方法
本公开的一个方面提供了一种引物激活聚合结合荧光探针的PCR方法。引物激活聚合反应，例如经典PAP反应，一般使用无5'-3'外切酶活性的DNA聚合酶，如KlenTaq-s进行引物激活聚合反应。而常用的特异性荧光标记-探针，例如
探针反应，需要通过具有5'-3'外切酶活性的DNA聚合酶水解探针来产生荧光信号。因此，经典PAP反应一般无法和荧光探针相结合。本公开提供的方法通过结合封闭引物激活聚合反应和特异性荧光标记-探针(如
探针)，解决了经典PAP反应无法结合荧光探针这一重要缺陷，既保证了扩增的特异性，又维持了荧光PCR的扩增效率。
引物激活聚合反应是在体系中包含被特异性修饰的封闭引物的聚合酶链式反应。核酸聚合酶在封闭引物未解封闭(即未激活)时无法介导DNA链的合成。因此，在聚合酶介导DNA链的合成反应之前，首先需要对封闭引物进行解封闭，以触发聚合反应。而引物激活聚合反应保证解封闭反应只有在体系中有模板DNA序列存在时才会发生，大大降低了反应的假阳性。
在某些实施方式中，引物激活聚合反应是焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysisactivated polymerization,PAP)。PAP使用3’末端封闭引物(例如双脱氧核苷酸)，利用DNA聚合酶的焦磷酸解反应串联聚合反应进行核酸扩增(Liu Q,Sommer SS,Biotechniques2000,29:1072-1076,1078,1080)。封闭引物的3’末端在无模板或与模板不互补状态下不能发生焦磷酸解反应，导致DNA聚合酶无法延伸。只有当封闭引物的3’末端与模板互补时，在焦磷酸盐缓冲液条件下DNA聚合酶发生焦磷酸解反应，去除引物3’末端封闭，DNA聚合酶才能沿着引物延伸而发生聚合反应。因此，在某些实施方式中，本公开提供了一种结合PAP和特异性荧光标记-探针的核酸检测方法。
封闭引物是指3’端被封闭以阻断核酸聚合酶延伸的引物。在某些实施方式中，封闭引物的3’端通过封闭核苷酸加以封闭。封闭核苷酸是任何具有特定结构能够阻断核酸聚合酶延伸的核苷酸核酸。封闭核苷酸的例子包括但不限于双脱氧核苷酸(例如2’,3’-双脱氧核苷酸)、核糖核苷酸、2’,3’SH核苷酸和2’-O-PO3核苷酸。
封闭引物可以通过去封闭剂在特定条件下(例如3’端封闭核苷酸与模板DNA互补)去封闭(即激活)。去封闭剂可以是任何能够在封闭核苷酸与靶序列杂交时将所述封闭核苷酸从封闭引物上去除的组分。根据封闭核苷酸的不同，去封闭剂包括但不限于改造的DNA聚合酶具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I(参见Tabor,S.和Richardson,C.C.(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA,92,6339–6343)，Taq-F667Y(参见Tabor,S.和Richardson,C.C.(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA,92,6339–6343；Li等，Proc Natl Acad Sci U S A.1999Aug 17；96(17):9491–9496)，Taq-F667Y/CA(参见US6399304B1)、KlenTaq-s、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、RNase H2和具有特定突变的CS5 DNA聚合酶(所述突变包括G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G或这些突变的组合)，及其组合。在一些实施方式中，本公开中的引物激活步骤是通过焦磷酸解激活反应实现的。在这种情况下，去封闭剂包括(1)Taq-F667Y，Taq-F667Y/CA、KlenTaq-s、或其它改造的DNA聚合酶和(2)焦磷酸盐。
在一些实施方式中，本公开提供的核酸检测方法使用的是具有荧光基团-淬灭基团双标记的探针，可以通过荧光信号检测体系中的靶序列。
本公开提供的核酸检测方法可以通过图1所示的释例性实施方式加以理解。
图1显示了引物激活聚合结合探针检测核酸的实施方式。检测体系中可能包含或可能包含待测核酸样品、核酸聚合酶、用于扩增靶序列以产生扩增子的引物组、荧光探针以及去封闭剂。引物组中包含至少一个封闭引物的引物对。荧光探针连接荧光基团(R)和淬灭基团(Q)。在自然状态下，探针的荧光基团(R)所发射的荧光能量被淬灭基团(Q)吸收，体系中检测不到荧光信号。当封闭引物结合到靶序列DNA时，在去封闭剂作用下封闭引物去封闭3’末端双脱氧核苷酸激活引物。在DNA聚合酶介入发生聚合反应，聚合延伸过程中，DNA聚合酶通过5’-3’核酸外切酶活性水解结合在靶序列DNA或扩增子的上的探针，探针的荧光基团(R)脱落游离，荧光基团(R)所发射的荧光能量不能被淬灭基团(Q)所吸收，从而能够在系统中检测到荧光信号。当封闭引物与靶序列不匹配或无靶序列时，去封闭剂无法将封闭引物的封闭核苷酸去除，核酸聚合酶不能从封闭引物延伸进行扩增。
在一些实施方式中，探针序列和靶序列(或和靶序列互补的序列)互补，如图1所示。在一些实施方式中，引物或封闭引物的序列与靶序列部分有部分不互补，而探针序列可以设计成和引物或封闭引物中与靶序列不互补的部分互补。即探针序列可以和扩增子的序列互补，同样可以进行本公开提供的检测方法。
在一些实施方式中，封闭引物的长度为8至70个核苷酸。在一些实施方式中，封闭引物的长度为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个核苷酸。
在一些实施方式中，封闭引物可以被进一步修饰以减少不需要的核酸的扩增。优选地，所述修饰是在引物中引入至少一个错配的核苷酸，该错配核苷酸在封闭引物与靶序列杂交时不与靶序列互补。在一些实施方式中，所述错配核苷酸位于具有封闭核苷酸的5’侧。优选地，其中所述错配核苷酸与封闭核苷酸相距2-18个核苷酸。
如前所述，本公开的方法中可以通过荧光信号检测包含靶序列的模板核酸。可以理解，在有些实施方式中，反应体系中检测到的荧光信号可能是反应背景或“噪音”。如本领域所公知，可以通过基线，即初始循环周期的荧光信号的水平，和阈值，即明显高于基线信号的荧光信号的水平，从背景中区分出扩增信号。
在一些实施方式中，本公开的方法进一步包括检测扩增子的扩增Ct值的步骤。Ct(Threshold cycle，阈值周期数)是指荧光信号穿过阈值的循环周期数。在一些实施方式中，可通过荧光PCR特异性扩增靶核酸的荧光扩增信号或检测Ct值来定量检测靶核酸。因此，本公开的检测方法可以是定性的或定量的。
多重荧光PCR检测方法
在某些实施方式中，本公开提供的方法可以同时检测样品中的多个靶序列。因此，本公开在另一个方面提供了多重的核酸检测方法。
在一些实施方式中，不同的靶序列可以通过不同的荧光信号加以区分。在一些实施方式中，本公开的反应体系中的引物池含有的不同引物组与具有不同荧光基团-淬灭基团组合的多重探针。其中，可在同一反应体系(或检测体系)中针对不同的靶序列，设计带有不同荧光基团的探针，以便在一个反应中区分多个靶序列的扩增产物；而淬灭基团可以根据荧光基团的不同选择相同的通用淬灭基团或不同的淬灭基团。在一些实施方式中，使用N种不同的荧光信号可在一个反应里区分N+1种扩增产物。在一些实施方式中，可在一个反应里区分2、3、4，或5种扩增产物
本公开提供了一种新的检测核酸的荧光PCR方法，通过结合引物激活聚合反应和特异性荧光标记-探针，既保证了荧光PCR扩增的特异性，又维持了荧光PCR扩增效率。
本公开的荧光PCR方法即可以进行单重反应，也可以使用带有不同荧光基团的多个荧光基团-淬灭基团双标记探针，以便在一个反应中区分多个模板实现单管多重荧光PCR反应，克服染料法SYBR荧光PCR不能多重反应且特异性差的难题，简化操作，减少试剂消耗，增加检测灵敏度。
本公开将PAP技术与探针荧光PCR技术相结合，既继承了PAP技术高灵敏度、高选择性、高特异性的特点，又具备了检测核酸定量定性的功能。一管多重PAP结合探针的荧光PCR反应不会产生交叉反应，解决了多重PCR反应中容易出现非特异性反应的难题，避免假阳性结果的产生。
本公开的方法操作简单方便，结果可以实时观察，无需开管和PCR后处理，不会产生PCR产物污染。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：材料和方法
1.1引物的制备：
根据COSMIC数据库获取的人表皮生长因子受体基因EGFR的2种突变核酸序列：T790M(2369C>T)和L858R(2573T>G)，采用Primer Primier 3.0软件设计扩增突变序列的特异性引物和探针。
1.2模板的制备：
从COSMIC数据库获取人表皮生长因子受体基因EGFR的2种突变核酸序列：T790M(2369C>T)和L858R(2573T>G)，通过化学合成T790M(2369C>T)和L858R(2573T>G)的突变核酸序列和分别与之对应的野生型基因片段，分别插入pUC57载体，构建突变型和野生型重组质粒DNA。将重组质粒DNA转化入大肠杆菌繁殖后，提取后重组质粒DNA经260nm处的紫外吸收定量。每个质粒分别用TE缓冲液稀释成10000拷贝/μl的浓度。
1.3引物激活结合探针的荧光PCR方法检测靶核酸：
每个反应混合物均包含50mM Tris pH 8.0，0.2mM dNTP，3mM MgCl2，90nM焦磷酸盐，具有2个单位的Taq-F667Y或2个单位的Taq-F667Y/CA或DNA聚合酶组合(2个单位的KlenTaq-s和1个单位的Taq混合)，每个封闭引物浓度为0.5μM，探针浓度0.2uM，野生型基因组DNA和/或质粒DNA，加入不含DNA酶/RNA酶的水至20μL终体积，使用宏石SLAN 96S PCR仪进行扩增，运行以下程序：95℃10分钟；95℃15秒，65℃120秒，40个循环，65℃收集FAM或/和ROX荧光信号。
实施例2：基于引物激活结合探针的荧光PCR方法单重检测的EGFR基因突变
2.1Taq-F667Y检测突变
一个单重荧光PCR反应检测T790M(2369C>T)突变使用了一个上游封闭引物(SEQID NO:1)和一个下游封闭引物(SEQ ID NO:2)和一个探针(SEQ ID NO:4)的引物组合(表1)。另一个单重荧光PCR反应检测T790M(2369C>T)突变使用了一个上游封闭引物(SEQ IDNO:1)和一个下游未封闭引物(SEQ ID NO:3)和一个探针(SEQ ID NO:4)的引物组合(表1)。
另一个单重荧光PCR反应检测L858R(2573T>G)突变使用了一个上游封闭引物(SEQID NO:5)和一个下游封闭引物(SEQ ID NO:6)和一个探针(SEQ ID NO:8)的引物组合(表1)。另一个单重荧光PCR反应检测L858R(2573T>G)突变使用了一个上游封闭引物(SEQ IDNO:5)和一个下游未封闭引物(SEQ ID NO:7)和一个探针(SEQ ID NO:8)的引物组合(表1)。
当荧光PCR反应体系使用Taq-F667Y，该酶同时具有焦磷酸酶活性、5’->3’DNA聚合酶活性，5’->3’核酸外切酶活性。当用20000个T790M或L858R突变质粒拷贝为模板，分别用上述T790M和L858R的不同引物组合扩增对应的突变基因片段时，产生了荧光扩增信号；当用20000个T790M或L858R的野生型质粒拷贝为模板进行扩增时，发现T790M引物组(两条封闭引物的引物对和探针或一条封闭引物的引物对和探针)出现了较弱的非特异性扩增信号，其中一条封闭引物的引物对和探针的引物组表现更糟糕，而L858R引物组(两条封闭引物的引物对和探针或一条封闭引物的引物对和探针)均无荧光扩增信号(表2，图2A)。基于引物激活结合探针的荧光PCR方法使用Taq-F667Y，对至少一条封闭引物的引物对和探针的引物组合能够进行单重检测，在野生型模板下，T790M(2369C>T)的突变检测会产生非特异性扩增，同时两条封闭引物的引物对和探针的引物组比一条封闭引物的引物对和探针的引物组显示出更好的特异性。
2.2Taq-F667Y/CA检测突变
检测的引物组组合同2.1。
荧光PCR反应体系使用具有Taq-F667Y/CA，该酶经过柠檬酸酐(CitraconicAnhydride(Sigma Aldrich 125318-25g))修饰封闭酶活性，通过高温激活酶活性，同时具有焦磷酸酶活性、5’->3’DNA聚合酶活性和5’->3’核酸外切酶活性。当用20000个T790M或L858R突变质粒拷贝为模板，分别用上述T790M和L858R的不同引物组合扩增对应的突变基因片段时，产生了荧光扩增信号；当用20000个T790M或L858R的野生型质粒拷贝为模板进行扩增时，发现T790M引物组和L858R引物组均无荧光扩增信号(表2，图2B)。基于引物激活结合探针的荧光PCR方法使用Taq-F667Y/CA，对至少一条封闭引物的引物对和探针的引物组合进行单重检测，发现在使用Taq-F667Y/CA时该荧光PCR方法具有很高的扩增特异性，表明Taq-F667Y经过柠檬酸酐修饰后变成Taq-F667Y/CA能够大幅提高Taq-F667Y扩增的特异性。
2.3KlenTaq-s和Taq的组合检测突变
检测的引物组组合同2.1。
荧光PCR反应体系使用KlenTaq-s和Taq的组合，利用KlenTaq-s的焦磷酸酶活性，5’->3’DNA聚合酶活性，结合Taq酶的5’->3’DNA聚合酶活性和5’->3’核酸外切酶活性，当用20000个T790M或L858R突变质粒拷贝为模板，分别用上述T790M和L858R的不同引物组合扩增对应的突变基因片段时，产生了荧光扩增信号；当用20000个T790M或L858R的野生型质粒拷贝为模板进行扩增时，均无荧光扩增信号(表2，图2C)。基于封闭引物激活结合探针的荧光PCR方法使用KlenTaq-s和Taq的组合时，对至少一条封闭引物的引物对和探针的引物组合进行单重检测，发现该荧光PCR方法具有很好的特异性，表明KlenTaq-s和Taq的组合和Taq-F667Y/CA扩增特异性相当。
实施例3：基于引物激活结合探针的荧光PCR方法多重检测的EGFR基因突变
3.1Taq-F667Y检测突变
一个双重荧光PCR同时检测T790M和L858R突变，使用了T790M引物组合(上游封闭引物(SEQ ID NO:1)和下游封闭引物(SEQ ID NO:2)和探针(SEQ ID NO:4))和L858R引物组合(上游封闭引物(SEQ ID NO:5)和下游封闭引物(SEQ ID NO:6)和探针(SEQ ID NO:8))组成的引物池。
另一个双重荧光PCR同时检测T790M和L858R突变，使用了T790M引物组合(上游封闭引物(SEQ ID NO:1)和下游未封闭的引物(SEQ ID NO:3)和探针(SEQ ID NO:4))和L858R引物组合(上游封闭引物(SEQ ID NO:5)和下游未封闭的引物(SEQ ID NO:7)和探针(SEQID NO:8))组成的引物池。
荧光PCR反应体系使用具有Taq-F667Y，该酶同时具有焦磷酸酶活性、5’->3’DNA聚合酶活性和5’->3’核酸外切酶活性，当用20000个T790M和20000个L858R突变质粒拷贝作为混合模板，分别用上述不同引物池扩增对应的突变基因片段时，产生了荧光扩增信号；当用20000个T790M和20000个L858R的野生型质粒拷贝作为混合模板进行扩增时，发现T790M引物组(两条封闭引物的引物对和探针或一条封闭引物的引物对和探针)都出现了非特异性扩增信号，其中一条封闭引物的引物对和探针的T790M引物组表现更糟糕，而L858R引物组(两条封闭引物的引物对和探针或一条封闭引物的引物对和探针)均无荧光扩增信号(表2，图3A)。基于引物激活结合探针的荧光PCR方法使用Taq-F667Y，不管是单重或多重反应，在野生型模板下，对T790M(2369C>T)的突变检测都会产生非特异性扩增，但是两条封闭引物的引物对和探针的引物组比一条封闭引物的引物对和探针的引物组在特异性上有所改进。。
3.2Taq-F667Y/CA检测突变
检测的引物组组合同3.1。
荧光PCR反应体系使用具有Taq-F667Y CA，该酶经过柠檬酸酐修饰封闭酶活性，通过高温激活酶活性，同时具有焦磷酸酶活性、5’->3’DNA聚合酶活性和5’->3’核酸外切酶活性，当用20000个T790M和20000个L858R突变质粒拷贝作为混合模板，分别用上述不同引物池扩增对应的突变基因片段时，产生了荧光扩增信号；当用20000个T790M和20000个L858R的野生型质粒拷贝作为混合模板进行扩增时，两条封闭引物的引物对和探针的引物组均无荧光扩增信号，而T790M引物组(一条封闭引物的引物对和探针)有微弱非特异性扩增信号(Ct 38.19)(表2，图3B)。基于引物激活结合探针的荧光PCR方法使用修饰的Taq DNA聚合酶，如柠檬酸酐修饰的Taq-F667Y/CA，进行单重或多重检测，比未修饰的Taq-F667Y有更高的扩增特异性，两条封闭引物的引物对和探针的引物组比一条封闭引物的引物对和探针的引物组有更好的特异性。
3.3KlenTaq-s和Taq的组合检测突变
检测的引物组组合同3.1。
荧光PCR反应体系使用KlenTaq-s和Taq酶的组合，利用KlenTaq-s的焦磷酸酶活性和DNA聚合酶活性，Taq酶的DNA聚合酶活性和5’->3’核酸外切酶活性，当用20000个T790M和20000个L858R突变质粒拷贝作为混合模板，分别用上述T790M和L858R的不同引物池扩增对应的突变基因片段时，产生了荧光扩增信号；当用20000个T790M和20000个L858R的野生型质粒拷贝作为混合模板进行扩增时，两条封闭引物的引物对和探针的引物组均无荧光扩增信号，而T790M引物组(一条封闭引物的引物对和探针)有非特异性扩增信号(表2，图3C)。基于引物激活结合探针的荧光PCR方法使用使用Klen Taq-s和Taq的组合时，进行多重检测，两条封闭引物的引物对和探针的引物组比一条封闭引物的引物对和探针的引物组有更好的特异性，其结果与Taq-F667Y/CA近似。基于引物激活结合探针的荧光PCR方法使用KlenTaq-s和Taq的组合时，进行单重或多重检测，该荧光PCR方法具有很好的特异性，表明KlenTaq-s和Taq的组合和Taq-F667Y/CA扩增特异性相当。
综合比较Taq-F667Y、Taq-F667Y/CA、KlenTaq-s和Taq的组合酶，优选Taq-F667Y/CA和KlenTaq-s和Taq的组合酶；比较两条封闭引物的引物对和探针的引物组和一条封闭引物的引物对和探针的引物组，优选两条封闭引物的引物对和探针的引物组。
表1.用于EGFR基因突变检测的引物组合
表2.单重和双重荧光PCR检测EGFR基因突变的结果
表2注释：
a.检测无Ct值，用40代替，表示检测不到扩增反应的产物。
在本公开提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本公开的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本公开作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (33)
1.一种检测核酸的荧光PCR方法，所述方法包括：
准备PCR反应体系，所述PCR反应体系包含：
(i)包含或怀疑包含靶序列的核酸样品；
(ii)核酸聚合酶或核酸聚合酶组合，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合具有5’–>3’聚合酶活性以及5’–>3’的核酸外切酶活性；
(iii)用于扩增所述靶序列以产生扩增子的引物对，所述引物对包含至少一个封闭引物，所述封闭引物包含位于封闭引物3’端的封闭核苷酸，其中所述封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸；
(iv)与靶序列或扩增子序列互补的探针，所述探针包含连接荧光基团的第一核苷酸和连接淬灭基团的第二核苷酸，其中所述荧光基团的荧光信号在所述第一核苷酸未从所述探针上水解时被所述淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第一核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述探针上水解，从而使得所述荧光基团的荧光信号不被所述淬灭基团淬灭；和
(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够在所述封闭核苷酸与所述靶序列或所述扩增子杂交时将所述封闭核苷酸从所述封闭引物上去除，使得所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够从所述封闭引物延伸；
将所述PCR反应体系在适当反应条件下进行扩增反应；和
检测所述PCR反应体系的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭核苷酸是2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO3核苷酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合包含去封闭剂的功能。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合还具有焦磷酸酶活性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合选自下组：(1)具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I，(2)具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(Taq-F667Y)、以及(3)切除了N片段并具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(KlenTaq-s)与具有5’->3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸聚合酶为经柠檬酸酐(CitraconicAnhydride)修饰的Taq-F667Y(Taq-F667Y/CA)。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述具有5’–>3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶I。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述去封闭剂选自下组：具有F762Y突变的E.coliDNA聚合酶I、Taq-F667Y、Taq-F667Y/CA、KlenTaq-s、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、RNase H2和CS5DNA聚合酶，其中所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或这些突变的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶序列包含突变核苷酸，所述封闭核苷酸与所述突变核苷酸互补。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针荧光基团选自下组：FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、和CY7。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB和TAMARA。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭引物还可能包含错配核苷酸，所述错配核苷酸在所述封闭引物与所述靶序列杂交时不与靶序列互补。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述错配核苷酸和所述探针互补。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述错配核苷酸与封闭核苷酸相距2-18个核苷酸。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述封闭引物的长度为8至70个核苷酸。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品包含修饰或没有修饰的单链DNA、双链DNA、RNA、cDNA或其组合。
17.根据权利要求1所述的方法，所述PCR反应体系还包含
(vi)用于扩增第二靶序列以产生第二扩增子的第二引物对，所述第二引物对包含第二封闭引物，所述第二封闭引物包含位于第二封闭引物3’端的第二封闭核苷酸，其中所述第二封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸，以及
(vii)与第二靶序列或第二扩增子序列互补的第二探针，所述第二探针包含连接第二荧光基团的第三核苷酸和连接第二淬灭基团的第四核苷酸，其中所述第二荧光基团的荧光信号在所述第三核苷酸未从所述探针上水解时被所述第二淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第三核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述第二探针上水解，从而使得所述第二荧光基团的荧光信号不被所述第二淬灭基团淬灭。
18.一种检测核酸的荧光PCR方法，所述方法包括：
准备PCR反应体系，所述PCR反应体系包含：
(i)包含或怀疑包含所述多个靶序列的核酸样品；
(ii)核酸聚合酶或核酸聚合酶组合，所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合具有5’–>3’聚合酶活性以及5’–>3’的核酸外切酶活性；
(iii)用于分别扩增所述多个靶序列以产生多个扩增子的多个引物对，其中每个引物对包含各自的封闭引物，所述各自的封闭引物包含位于封闭引物3’端的封闭核苷酸，其中所述封闭核苷酸可以阻断所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合的延伸；
(iv)分别与所述多个靶序列或相应扩增子序列互补的多个探针，其中每个探针分别包含连接荧光基团的第一核苷酸和连接淬灭基团的第二核苷酸，其中所述荧光基团的荧光信号在所述第一核苷酸未从所述探针上水解时被所述淬灭基团淬灭，并且其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够在延伸的过程中将所述第一核苷酸从与靶序列或扩增子结合的所述探针上水解，其中所述多个探针包含相同或不同的荧光基团；
(v)去封闭剂，所述去封闭剂能够在所述各自的封闭引物的所述封闭核苷酸与其相应的靶序列或扩增子杂交时将所述封闭核苷酸从所述各自的封闭引物上去除，使得所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合能够从所述封闭引物延伸；
将所述PCR反应体系在适当反应条件下进行扩增反应；和
检测所述PCR反应体系的荧光信号。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述封闭核苷酸是2',3'-双脱氧核苷酸、核糖核苷酸残基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO3核苷酸。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合包含去封闭剂的功能。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合还具有焦磷酸酶活性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述核酸聚合酶或核酸聚合酶组合选自下组：(1)具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I，(2)具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(Taq-F667Y)、以及(3)切除了N片段并具有F667Y突变的Taq DNA聚合酶(KlenTaq-s)与具有5’->3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的组合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述核酸聚合酶为经柠檬酸酐(CitraconicAnhydride)修饰封闭酶活性的Taq-F667Y(Taq-F667Y/CA)。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述具有5’–>3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶I。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述去封闭剂选自下组：具有F762Y突变的E.coli DNA聚合酶I、Taq-F667Y、Taq-F667Y/CA、KlenTaq-s、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、RNaseH2和CS5 DNA聚合酶，其中所述CS5 DNA聚合酶具有选自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突变或这些突变的组合。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述靶序列包含突变核苷酸，所述封闭核苷酸与所述突变核苷酸互补。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述探针荧光基团选自下组：FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5、和CY7。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB和TAMARA。
29.根据权利要求18所述的方法，其中所述封闭引物还可能包含错配核苷酸，所述错配核苷酸在所述封闭引物与所述靶序列杂交时不与靶序列互补。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述错配核苷酸和所述探针互补。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述错配核苷酸与封闭核苷酸相距2-18个核苷酸。
32.根据权利要求18所述的方法，其中所述封闭引物的长度为8至70个核苷酸。
33.根据权利要求18所述的方法，其中所述核酸样品包含修饰或没有修饰的单链DNA、双链DNA、RNA、cDNA或其组合。
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