JP2010519896A - 核酸配列の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(a)その試料を、ハイブリダイゼーション条件下に、当該標的核酸の第1領域にハイブリダイズできる第1オリゴヌクレオチドプライマーで処理し、
(b)工程(a)の混合物を伸長条件(例えば、適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含んでもよい)下に維持して、任意のアニーリングしたプライマーを伸長させ、ここでプライマーの伸長は標的核酸配列の存在に(例えば、変異ヌクレオチドの存在または非存在に)依存しており、
(c)工程(b)の混合物を分解条件下に維持して、存在すれば第1プライマーの伸長産物を分解し、ここで第1プライマーを含む第1プライマー伸長産物の分解は当該第1プライマーの伸長に依存しており、またここで当該第1プライマー伸長産物の分解によって、その標的核酸の存在の(例えば、標的核酸中の変異ヌクレオチドの)指標となる検出可能な信号が発生する工程を含む方法を提供する。
A.試料中の標的核酸
試料とは、核酸を含有しているか、または含有すると推定される任意の物質をいい、一個体または複数個体から単離した組織または体液の試料が挙げられる。本願明細書の、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出すべきオリゴマー断片、オリゴマーコントロール、およびラベルされていないブロッキングオリゴマーをいい、またポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボース含有)や、ポリリボヌクレオチド(D−リボース含有)や、プリンもしくはピリミジン塩基のN−グリコシド、または修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基である他の任意の型のポリヌクレオチドを示す総称たるべきものである。「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の用語間で長さの区別は意図せず、これらの用語は互換的に使用される。これら用語では、分子の一次構造のみを言及する。よって、これらの用語には二本鎖および一本鎖DNA、さらには二本鎖および一本鎖RNAが包含される。オリゴヌクレオチドは、設計されたヌクレオチド配列の領域に対応する、およそ少なくとも6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約10〜12ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約15〜20ヌクレオチドの配列で構成される。
本願明細書で用いる「プライマー」という用語は、自然発生のものでも、または合成により生産したものでも、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に、すなわちヌクレオチドとDNAポリメラーゼなどの重合用薬剤との存在下に好適な温度およびバッファーに置かれた場合に、合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドをいう。このプライマーは、増殖の効率を最大にするにためは好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖であってもよい。このプライマーは、誘導剤の存在下に伸長産物の合成のプライミングをするのに充分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源およびその使用方法を含む多くの因子に依存することになろう。
「ヌクレオシド三リン酸」の用語は、本願明細書でDNAまたはRNAのいずれかにて存在するヌクレオシドをいうのに用いられ、よって塩基としてアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルを組み込み、糖部分がデオキシリボースまたはリボースであるヌクレオシドを含む。一般にデオキシリボヌクレオシドは、DNAポリメラーゼと組み合わせて用いられることになる。しかし、通常の塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルの1つと塩基対を形成できる他の修飾塩基を用いうることが理解されるであろう。このような修飾塩基としては、例えば8−アザグアニンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
開示の方法は、プライマー伸長のための核酸ポリメラーゼ、およびプライマー伸長産物の分解のためのヌクレアーゼ活性を利用する。このヌクレアーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ活性であることが好ましい。このエキソヌクレアーゼ活性は、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性であることが最も好ましい。このようなヌクレアーゼ活性を提供するために好適な酵素には、他の酵素のうち、例えばラムダエキソヌクレアーゼ、T7エキソヌクレアーゼTaqDNAポリメラーゼおよび大腸菌DNAポリメラーゼが包含される。任意の核酸ポリメラーゼが使用可能である。プライマー伸長および分解は、同じ酵素によってもたらされることが好ましく、その候補はTaqDNAポリメラーゼである。増幅用に同じ酵素が使用可能であることも好ましい。DNAポリメラーゼが熱安定性DNAポリメラーゼであることが特に好ましい。
開示の方法は、標的核酸鋳型にアニーリングした第1プライマーの伸長、およびそれに続く第1プライマーの伸長産物の分解を含み、そのため検出可能な信号が発生する。この方法の重要な因子は、アニーリングした第1プライマーを伸長させる能力であり、これが検出可能な信号を発生することができるかどうかを決定する。様々な理由で、例えば、その第1プライマーの3’終端ヌクレオチドが、第1プライマーがアニーリングする標的上の変異(または正常)ヌクレオチドに相補的でなければ、標的鋳型上でアニーリングする第1プライマーは伸長可能でなくてもよい。よって、第1プライマーの2つの型は、第1プライマーの第1型は変異ヌクレオチドに対して特異的に、かつ第1プライマーの第2型は正常ヌクレオチドに対して特異的になるように設計できる。この第1プライマーの両方の型は、相違するようにラベルしてもよく、これにより異なるアレルの正確な分類、または特定のヌクレオチドの有無を求めることができる。
(a)その試料を、標的核酸配列の第1領域に対する第1オリゴヌクレオチドプライマーで処理して、ハイブリダイゼーション条件下にその標的核酸にアニーリングされる第1オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程であって、上記第1プライマーのヌクレオチド配列は、その標的核酸の上記第1領域にそれが実質的に相補的であるようなもので、上記第1領域は変異被疑ヌクレオチドを含んでいる工程、
(b)アニーリングした第1プライマーを、伸長可能であれば伸長させて第1プライマーの伸長産物を合成するのに適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、工程(a)の混合物を維持する工程、および
(c)第1プライマー伸長産物(第1プライマーを含む)を、存在すれば分解条件下に分解する工程であって、それにより検出可能な信号を発生させ、これは標的核酸、もしくは標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在の指標であるか、または検出可能な信号のレベルが標的核酸配列もしくは標的核酸配列上の特定の変異ヌクレオチドの量に相関する、工程を含む。
i)試料を変性条件下に処理して、プライマー伸長産物を、このような伸長産物が形成された場合にその鋳型から分離し、
ii)上記のように生産した一本鎖を、適切なヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、第1プライマー(または2つの型の第1プライマー)、第2プライマーおよび第3プライマーと、同時または順次のいずれかにて接触させ、これにより、可能な場合に、上記のように生産した一本鎖を鋳型として用いてさらに伸長産物が合成され、ここで5’から3’へのヌクレアーゼ活性を有する上記核酸ポリメラーゼを用いて、第1プライマーの伸長産物の分解が第2プライマーの伸長時に起こり、かつ上記第3プライマーは第2プライマーの伸長産物に実質的に相補的な配列を含み、
iii)以上の工程を充分な回数繰り返して、それにより検出ラベルの検出可能な変化を引き起こす、ことを含む。
以下の実験で用いたプライマーはすべて、EUROGENTEC,UKによって合成された。プライマーは、正常BRAF遺伝子断片および突然変異BRAF遺伝子断片(V599Eを保有している)を含むプラスミドから標的DNA配列BRAF遺伝子を増幅するように設計した。この遺伝子断片の配列は、以下の配列を含む。
増幅プライマーおよびプローブは、JKR3ccF2はGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAAGCATCTTTATTATGGCAGAGAGAAであり、JKR3はGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGAであり、JKFamdRはGTTTTACTTACTCTCGTCTCCAC6GAAであって、このプライマーにおいて第11位の「T」はBHQ−1(dT)で、「6」はFam−dRである。
増幅プライマーおよびプローブは、JKR3HexはAACAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA(5’端はHEXでラベル)であり、JKR3DabはCCTTTCTCAGAGCATCTGTT(3’端はDABCYLでラベル)であり、JKF7はGTATGATGAGCAAGCTTTCTCACAAである。
GGA*C*C*C*A*C*T*CCA*T*C*G*AGA6TTC*A(ここで「*」はホスホロチオエート結合であり、「6」はdR−ビオチンである)の配列を有する、ブロッキングプライマーBrafFamWTBでもある第1プライマーを設計した。このホスホロチオエート結合修飾で、プライマーはヌクレアーゼ切断に対して耐性となる。このプライマーを反応で使用すると、その伸長鎖は分解されず、そのため上流プライマーから開始される伸長が阻止される。
Claims (33)
- 試料に含まれる標的核酸または1以上の標的核酸の少なくとも1つの変異ヌクレオチドの有無または量を検出するための方法であって、該方法は、
(a)前記試料を、標的核酸配列の第1領域に対する第1オリゴヌクレオチドプライマーで処理して、ハイブリダイゼーション条件下にその標的核酸にアニーリングされる第1オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程であって、該第1プライマーのヌクレオチド配列は、その標的核酸の該第1領域にそれが実質的に相補的であるようなもので、該第1領域は変異被疑ヌクレオチドを含む診断部分である工程、
(b)アニーリングした第1プライマーを、伸長可能であれば伸長させて第1プライマーの伸長産物を合成するのに適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、工程(a)の混合物を維持する工程、ならびに
(c)第1プライマーの伸長産物を、存在すれば分解条件下に分解する工程であって、それにより前記標的核酸、または標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在および/もしくは量の指標である、検出可能な信号を発生させる工程を含む方法。 - 工程(b)において、アニーリングした第1プライマーは伸長条件下に伸長可能でなく、このため第1プライマーの伸長産物は生じず、これにより工程(c)において分解条件下に第1プライマーの伸長産物の分解が起こらず、そのため検出可能な信号は発生せず、これが前記標的核酸または標的核酸中の変異ヌクレオチドの非存在の指標となる、請求項1記載の方法。
- 前記第1プライマーの3’末端ヌクレオチドが変異被疑ヌクレオチドに相補的であって、第1プライマーがその変異被疑ヌクレオチドを含む標的領域にアニーリングすると、アニーリングした第1プライマーは伸長可能となり、また第1プライマーが正常ヌクレオチドを含む標的領域にアニーリングすると、アニーリングした第1プライマーは伸長可能とならない、請求項1または2記載の方法。
- 前記変異被疑ヌクレオチドは、SNPまたは1以上の突然変異ヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記分解は、鋳型に依存する分解として行なわれる、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記分解条件は、ヌクレアーゼ活性を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ活性である、請求項6記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ活性は、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性である、請求項6記載の方法。
- 前記5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性は、DNAポリメラーゼによってもたらされる、請求項8記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼは、工程(b)で使用されるものと同じである、請求項9記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼは、TaqDNAポリメラーゼである、請求項9記載の方法。
- 前記ヌクレオシド三リン酸の少なくとも1つはラベルされ、これによりその第1プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生する、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記第1プライマーはラベルされ、これによりその第1プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生する、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)は、標的核酸配列の第1領域に対する第1オリゴヌクレオチドプライマー、および標的核酸配列の同じ鎖の第2領域に対する第2オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニールされる第1および第2オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作る工程を含み、
該第1プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第1領域に実質的に相補的になるようなものであり、
該第2プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の前記第2領域に実質的に相補的になるようなものであって、かつ
その標的核酸の第2領域は、標的核酸の第1領域の5’に位置するようになっている、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。 - 工程(b)はさらに、アニーリングした第1および第2プライマーを、適切なヌクレオシド三リン酸および核酸ポリメラーゼを含む伸長条件下に、伸長可能であれば伸長させて、第1および第2プライマーの伸長産物を合成する工程を含み、工程(c)では、第2プライマーの伸長の結果として第1プライマーの伸長産物の分解が起こる、請求項14記載の方法。
- 工程(a)はさらに、標的核酸配列の第1領域に対する少なくとも2つの型の第1オリゴヌクレオチドプライマーで試料を処理して、ハイブリダイゼーション条件下に標的核酸にアニーリングされる第1オリゴヌクレオチドプライマーを含む二重鎖の混合物を作ることを含み、
該第1プライマーのヌクレオチド配列は、それが標的核酸の該第1領域に実質的に相補的であるようなものであり、かつ
第1プライマーの該第1型の3’末端ヌクレオチドは、変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ
第1プライマーの該第2型の3’末端ヌクレオチドは、対応する正常ヌクレオチドに相補的であって、
これにより工程(b)で、標的核酸配列中の変異被疑ヌクレオチドを含む第1領域に、第1プライマーの該第1型がアニーリングする場合は第1プライマーの第1型の伸長産物が合成され、一方、標的核酸中の対応する正常ヌクレオチドを含む第1領域に、第1プライマーの該第1型がアニーリングする場合は伸長産物が合成されず、かつ
これにより工程(b)で、標的核酸配列中の正常ヌクレオチドを含む第1領域に、第1プライマーの該第2型がアニーリングする場合は第1プライマーの第2型の伸長産物が合成され、一方、標的核酸中の対応する変異ヌクレオチドを含む第1領域に、第1プライマーの該第2型がアニーリングする場合は伸長産物は合成されない、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。 - 第1プライマーの前記第1型と第2型とは分解可能である、請求項16記載の方法。
- 第1プライマーの前記第2型は分解可能でなく、第1プライマーの第2型は、修飾されたヌクレオチドまたは修飾された結合または非ヌクレオチドを含み、これにより前記第1プライマーの第2型の伸長産物が、第2プライマーから開始される伸長を阻止し、それにより変異被疑ヌクレオチドを含む標的核酸を濃縮する、請求項16記載の方法。
- 工程(a)、(b)および(c)は、PCR反応の一部であり、
試料を変性条件下に処理して、プライマー伸長産物を、このような伸長産物が形成されたその鋳型から分離し、
前記のように生産した一本鎖を、適切なヌクレオシド三リン酸、5’から3’へのヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ、1以上の型の第1プライマー、第2プライマーおよび第3プライマーと、同時または順次のいずれかにて接触させ、前記または各第1プライマーは、第1プライマーの伸長産物の分解により検出可能な信号が発生するようにラベルされ、これにより、可能な場合、前記のように生産した一本鎖を鋳型として用いてさらに伸長産物が合成され、かつ5’から3’へのヌクレアーゼ活性を有する該核酸ポリメラーゼによって成し遂げられる、第1プライマーの伸長産物の分解が第2プライマーの伸長時に起こり、かつ該第3プライマーは、第2プライマーの伸長産物に実質的に相補的な配列を含み、
以上の工程を充分な回数繰り返して、それにより前記標的核酸または標的核酸中の変異ヌクレオチドの存在下に前記または各第1プライマーの分解から、検出可能な信号をもたらすことを含む、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。 - 前記第1プライマーは、5’終端でない位置でラベルされる、請求項13または請求項19記載の方法。
- 前記第1プライマーは、5’終端から少なくとも3ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項20記載の方法。
- 前記第1プライマーは、5’終端から少なくとも6ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項21記載の方法。
- 前記第1プライマーは、5’終端から少なくとも9ヌクレオチド離間したところでラベルされる、請求項22記載の方法。
- 前記第1プライマーは、相互作用性対である第1および第2ラベルを含む、請求項13または請求項19記載の方法。
- 前記第1プライマーは、(a)前記標的核酸配列の第1領域に相補的なプライミング部分を含み、かつさらに(b)前記標的核酸配列に相補的でない、非核酸またはヌクレオチドの配列の第1尾部を5’端に含む、請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 前記第1プライマーはさらに、前記第1尾部に結合し、かつその第1プライマーのプライミング部分に相補的な領域に隣接する標的核酸配列に実質的に相補的である、非核酸またはヌクレオチドの配列の第2尾部を含む、請求項25記載の方法。
- 前記第1プライマーは、第1尾部で二本鎖部分を含み、前記第1尾部に相補的な尾部相補体オリゴヌクレオチドが前記第1尾部配列にアニーリングされ、
該第1プライマーは第1ラベルでラベルされ、かつ該尾部相補体オリゴヌクレオチドは第2ラベルでラベルされ、そして
該第1ラベルと第2ラベルとは相互作用性対である、請求項25または請求項26記載の方法。 - 前記第1プライマーは、その第1プライマーにハイブリダイズできる第1相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第1プライマーは、前記第1相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記第1プライマーおよび前記第1相補体オリゴヌクレオチドは、第1ラベルと第2ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記第1プライマーは、前記第1相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。 - 前記第2プライマーは、第2プライマーにハイブリダイズできる第2相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第2プライマーは、前記第2相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記プライマーおよびその相補体オリゴヌクレオチドは、第1ラベルと第2ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記プライマーは、前記相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項16〜19のいずれかに記載の方法。 - 前記第3プライマーは、第3プライマーにハイブリダイズできる第3相補体オリゴヌクレオチドと、二本鎖二重鎖を形成できる領域を含んでおり、
前記第3プライマーは、前記第3相補体オリゴヌクレオチドに対するよりも強い親和性で前記標的核酸にハイブリダイズでき、かつ
前記プライマーおよびその相補体オリゴヌクレオチドは、第1ラベルと第2ラベルとからなる相互作用性ラベル対の一方のメンバーで各々ラベルされ、
前記標的核酸の増幅に伴い、前記プライマーは、前記相補体オリゴヌクレオチドよりも前記標的ヌクレオチドの増幅産物に優先的にハイブリダイズするようになっており、それにより前記相互作用性ラベル対は分離される、請求項19記載の方法。 - 前記第1ラベルと第2ラベルとは、各々フルオロフォアおよびクエンチャーである、請求項24または請求項27〜30のいずれかに記載の方法。
- 前記2つの型の第1プライマーに、前記第1プライマーの両方の型が伸長された場合にその第1プライマーの伸長産物の分解の際に識別可能な信号を発生する異なるラベルが付けられている、請求項17記載の方法。
- 試料に含まれる少なくとも1以上の核酸の有無を検出するためのキットであって、該キットは、
(a)標的核酸配列の診断領域に対する第1プライマー、あるいは標的核酸配列の1以上の診断領域の各々に対する第1および第2型の第1プライマー、ならびに
前記第1プライマーにアニーリングしているその診断領域を含む標的配列を増幅するための対応する第2および第3プライマー
を含み、前記第1プライマーの第1型の3’末端ヌクレオチドは変異被疑ヌクレオチドに相補的であり、かつ/または前記第1プライマーの第2型の3’末端ヌクレオチドは対応する正常ヌクレオチドに相補的であって、使用時にその第1プライマーの前記末端ヌクレオチドが前記標的核酸中の対応するヌクレオチドに相補的であれば第1プライマーの伸長産物が合成されて、その後前記第1プライマーの伸長産物は分解され、それにより検出可能な信号が発生するようになっており、かつその第1プライマーの前記末端ヌクレオチドが前記標的核酸配列中の対応するヌクレオチドに相補的でなければ伸長産物は合成されないようになっているキット。
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