CN103911445B - 一种as-pcr引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种as-pcr引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种AS-PCR引物设计方法、基因多态性检测方法及试剂盒，所述方法及试剂盒用于对可能包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在。所述AS-PCR引物设计方法包括以下步骤：（i）针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；（ii）对步骤（i）所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团。相较于传统AS-PCR单一的检测位点能力，本发明的基因多态性引物设计方法和检测方法及试剂盒可以模糊识别突变位点,并且可以将探针和引物合二为一,节约了引物合成成本、设计时间，设计也方便易懂，容易掌握。
Description
技术领域
本发明属于核酸诊断试剂领域，具体涉及一种等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）引物设计方法。本发明还涉及一种AS-PCR基因多态性检测方法及试剂盒，所述方法及试剂盒用于对可能（即怀疑）包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在。
背景技术
等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO）是基于杂交的突变检测技术，常用以检测已知突变。设计一段例如15～20bp的寡核苷酸片段，其中包含了发生已知突变的部位，以此为探针，当与固定在膜上的样品DNA杂交时，由于一个碱基的差异会导致Tm值下降5～7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可以鉴定出样品DNA中是否存在突变。
将ASO与PCR相结合的等位基因特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）是目前一种常用于分析基因多态性，特别是单核苷酸多态性（SNP）的方法。多态性（polymorphism）是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性（genetic polymorphism）或基因多态性。从本质上来讲，多态性产生于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。单核苷酸多态性（SNP），即散在的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失、插入和置换，其中以单个碱基置换的情形居多。SNP是目前倍受关注的一类多态性，由于其经常在遗传疾病、疾病易感性、药物不良反应性等研究中具有遗传标记的作用，因此，其检测为疾病诊断和早期诊断，药物学研究等提供了巨大的潜在可能。
在AS-PCR中，PCR的引物之一或者两个引物被设计成在序列变异的位点处退火，使其能够区分同一基因的不同等位基因，这些等位基因类型包括碱基的替换、插入和缺失。AS-PCR利用了DNA聚合酶的保真度：相比于3’端最后一个碱基正确匹配引物而言，3’端最后一个碱基错配的引物在延伸效率上大大降低（通常为1/100至1/100,000）。3’端最后一个碱基错配的引物由此导致延伸困难，PCR扩增减少，因此很容易通过检测区分突变。
传统AS-PCR的引物3’端最后一个碱基特别关键，必须为基因多态性位点。以检测SNP为例，其原理如图1所示。图1A中，针对包含SNP位点的靶序列设计等位基因特异性引物（下称AS引物）1-1、1-2，即，在常规PCR引物设计基础上，使待测SNP位点恰好位于AS引物1-1、1-2的3’末端，即引物1-1与1-2仅3’末端的碱基不同（分别对应野生型和可能的突变型），其余碱基序列一致，其中5’端X代表碱基上的羟基或磷酸基，3’端Y代表碱基上的羟基。图1B中，2-1和2-2分别为等位基因所在的野生型和突变型DNA双链，其中2-1b和2-2b分别为与AS引物配对的模板链。如图1C所示，按照3’端最后一个碱基严格互补配对的原理，实现等位基因的特异性扩增。也就是说，若图1A中的AS引物与图1B中的模板完全互补配对，则形成图1C中3-1、3-2所示双链结构，PCR反应顺利进行，若形成图1C中3-3、3-4所示情况，3’末端碱基错配，则PCR反应不可进行。通过分析PCR扩增结果，判定SNP情况，若引物1-2扩增而引物1-1无明显扩增，则表明存在所述突变。
传统AS-PCR对DNA聚合酶的要求比较高。PCR（非AS-PCR）反应体系中常用的DNA聚合酶有A型和B型两种，A型DNA聚合酶具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，如Taq DNA聚合酶等；B型DNA聚合酶不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，还具有3’端到5’端的DNA外切酶活性，可以即时识别并切除3’端的错配碱基（因错配导致翘起），从而剩下未错配的碱基得以继续扩增，例如pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶，等等。由于传统AS-PCR正需要利用多态性位点的错配引物，故而扩增反应中仅能使用A型DNA聚合酶，不能使用会将错配碱基切除的B型DNA聚合酶。
图2A和2B示意性地示出了A型和B型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况。其中，图2A是A型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况，当引物（3’端为羟基）与模板完全匹配时，在A型DNA聚合酶作用下引物得以扩增（左），而当引物3’端与模板错配时，退火温度下错配部分翘起，不能与模板结合，A型DNA聚合酶不起作用，引物不能扩增（右），利用此特性，传统AS-PCR得以实现等位基因多态性的检测；图2B是B型DNA聚合酶在传统PCR体系中的作用情况，当引物与模板完全匹配时，在B型DNA聚合酶作用下引物得以扩增（左），而当引物3’端与模板错配时，错配部分翘起，B型DNA聚合酶先发挥3’端到5’端的DNA外切酶作用，将错配部分切除，剩下未错配的引物在DNA聚合酶作用下得以继续扩增（右），这样显然无法用于传统AS-PCR中鉴别等位基因多态性。
传统AS-PCR技术存在以下缺点：
第一、由于AS引物要针对待测突变型进行设计，故而传统AS-PCR技术仅能对已知的多态性位点进行检测，不能检测未知的突变类型。
第二、传统AS-PCR技术在检测扩增结果方面，一种是采用电泳分析方法，这种方式操作复杂费时，成本高，且技术较难普及；另一种是采用实时荧光定量PCR，这也需要额外合成标记有荧光基团和荧光猝灭基团的荧光探针。
因此，业界存在改良传统AS-PCR技术的需要。
发明内容
本发明正是针对上述传统AS-PCR的缺点作出。
本发明的目的和优点一部分将在下面的描述中列出，另一部分对于本领域普通技术人员来说容易基于下面的描述而想到。
本发明的一个目的是提供一种AS-PCR引物的设计方法，所述方法包括以下步骤：（i）针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；（ii）对步骤（i）所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团。利用本发明上述方法设计的引物可用于确定待测等位基因是否与已知基因类型不同的AS-PCR反应，例如用于区分野生型和突变型，而且与传统AS-PCR引物设计不同，考虑待测等位基因的具体突变类型不再是必须的。
本发明另一个目的是提供一种AS-PCR基因多态性检测方法，所述方法用于对可能包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在，其特征在于所述方法包括以下步骤：（i）针对所述可能包含等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；（ii）对步骤（i）所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团；（iii）使用步骤（ii）所修饰的AS-PCR引物对所述靶序列进行PCR扩增，所述PCR扩增使用B型DNA聚合酶；（iv）分析步骤（iii）的扩增结果确定所述等位基因变体是否存在。
上述AS-PCR引物设计方法和/或AS-PCR基因多态性检测方法中，由于所设计的AS-PCR引物3’端具有能够屏蔽引物直接延伸的基团，当与模板DNA结合时，若引物与模板完全互补，由于引物的3’进行了去羟基化修饰，无法与dNTP发生聚合反应，因此引物不延伸。反之，若引物与模板错配，即不完全互补，则退火时错配部分翘起不与模板结合，此时B型DNA聚合酶的3’端到5’端外切酶活性起作用，将引物3’端翘起的不互补配对的部分切除，剩余引物部分的3’端羟基露出（DNA链上dNTP之间的磷酸二酯键在B型DNA聚合酶作用下水解后，引物3’端产生羟基，水解下的dNTP或DNA链的5’端形成磷酸基），如此，酶切后的引物即可在DNA聚合酶作用下延伸。
因此，与传统AS-PCR相反，本发明的AS-PCR引物只有在错配时才延伸，而与模板链互补时则不延伸，这样就可以不区分突变类型而检测等位基因多态性是否存在。具体而言，如果某一等位基因存在多种可能的突变，例如单个或多个碱基插入、缺失或替换，而人们仅需要检测样品是否存在突变而不必确定具体的突变类型时，则可以仅针对野生型设计AS-PCR引物，若扩增表明样品存在突变，反之不扩增表明样品为野生型。较之传统AS-PCR引物，其在与模板链互补时延伸而发生错配则不延伸，故要针对每一种突变设计引物，本发明的方法的优点显而易见。当然，本发明的引物设计方法也并不排除针对具体突变类型的检测。
在本发明的AS-PCR引物设计方法和/或AS-PCR基因多态性检测方法中，优选地，步骤（i）中所述等位基因变异区域位于所述AS-PCR引物的3’端的第1～6个碱基中，所述引物的长度为18bp～30bp。这样使得B型DNA聚合酶酶切识别区域尽可能靠近引物3’末端，且被酶切后仍具有足够的链长，以免酶切后的引物过短而容易从模板链上脱落，降低扩增效率。
优选地，使在扩增反应中所述AS-PCR引物的5’端到所述等位基因变异区域的Tm值在48℃～52℃。随着Tm增高，引物与模板错配几率增大，随着Tm降低，引物从模板上脱落几率增大。
在本发明的AS-PCR引物设计方法和/或AS-PCR基因多态性检测方法中，步骤（ii）对所述AS-PCR引物3’端的修饰包括但不限于脱羟基、羟基位置修饰氨基、羟基位置修饰羧基、羟基位置修饰巯基或羟基位置修饰磷酸基，等等。更优选地，步骤（ii）对所述AS-PCR引物3’端的羟基位置修饰为标记荧光淬灭基团，并且步骤（ii）进一步包括对所述AS-PCR引物的5’端标记荧光基团。这样，标记的AS-PCR引物可直接用作实时荧光PCR的探针，实现引物和探针的合二为一。标记所述AS-PCR引物5’端的所述荧光基团包括但不限于：FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，等等，标记所述AS-PCR引物3’端的所述荧光淬灭基团包括但不限于：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra、Eclipse，等等。上述荧光基团和荧光猝灭基团及其标记方法是本领域已知的。
图3A和3B示意性地示出了B型DNA聚合酶在本发明的AS-PCR体系中的作用原理。图3A中引物3’端连接有屏蔽引物延伸的基团Y’，图3B中引物5’端连接有荧光基团X0，3’端连接有淬灭基团Y0。当引物与模板完全匹配时，由于3’端羟基被屏蔽，引物无法扩增（左），而当引物3’端碱基与模板错配时，退火温度下错配部分翘起，B型DNA聚合酶先发挥3’端到5’端的DNA外切酶作用，将错配部分切除，剩下未错配的引物在DNA聚合酶作用下得以继续扩增（右）。
在本发明的AS-PCR基因多态性检测方法中，步骤（iii）的所述B型DNA聚合酶包括但不限于pfu DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶，等等。所述B型DNA聚合酶是本领域已知的，并且可以从公开渠道获得，例如，pfu DNA聚合酶可从TAKARA采购；KOD DNA聚合酶可从TOYOBO采购。
本发明另一个目的是提供一种AS-PCR基因多态性检测试剂盒，其中至少包含以下成分：a.上述AS-PCR基因多态性检测方法的步骤（i）-（ii）所设计AS-PCR引物；b.上述AS-PCR基因多态性检测方法的步骤（iii）中使用的B型DNA聚合酶。
相较于传统AS-PCR单一的检测位点能力，本发明的突变识别引物设计方法和检测方法及试剂盒可以模糊识别突变位点，即用野生型作为突变检测序列，而不必考虑具体突变类型。这在复杂的人肿瘤基因变异检测中，如人EGFR（表皮生长因子受体）基因第19外显子发生的40种以上的突变，或者人C-KIT（酪氨酸激酶的亚类之一）基因第11外显子25种以上的突变，仅需设计一条或几条与突变热点区域序列对应的野生型标记引物即可。因此相较于传统AS-PCR节约了引物合成成本、设计时间，设计也方便易懂，容易掌握。
本发明的另一优点是可以将引物与探针合二为一，实现了AS-PCR的实时检测，相较于传统AS-PCR的杂交或电泳检测方式，减少了操作步骤，且闭管检测，极大降低后PCR产物污染的可能性；而相较于将探针和引物分开设计的传统实时荧光AS-PCR，本发明也大大降低了合成成本。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，对所附图的说明如下：
图1示意性地示出了传统AS-PCR检测SNP的原理；
图2A-2B示意性地示出了A型和B型DNA聚合酶在PCR体系中的作用情况，其中，图2A是A型DNA聚合酶在PCR体系中的作用情况，图2B是B型DNA聚合酶在PCR体系中的作用情况；
图3A和3B示意性地示出了B型DNA聚合酶在本发明的AS-PCR体系中的作用原理；
图4A和4B为根据本发明方法检测得到的杂合型和纯合型样品的典型扩增结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1.人亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性AS-PCR检测：
PCR的具体步骤条件可参考《分子克隆实验指南（第三版）》（第8章“聚合酶链式反应体外扩增DNA”，597-701页，科学出版社，2002年8月）的记载。
1.1.人MTHFR基因多态性AS-PCR引物设计：
人MTHFR-01用于检测SNP（GTCTGCGGGAG A/C CGATTTCAT）位点T等位基因、人MTHFR-02用于检测SNP（GTCTGCGGGAG A/CCGATTTCAT）位点C等位基因、人MTHFR-03为下游引物。
人MTHFR-01：5'-AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC–3'
人MTHFR-02：5'-AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT–3'
人MTHFR-03：5'-gaaagatcccggggacgatg-3'
1.2.引物修饰：
人MTHFR-01：5'（FAM）-AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGC–（BHQ1）3'
人MTHFR-02：5'（VIC）-AAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGT–（BHQ1）3'
1.3.模板合成：
合成人MTHFR序列1作为模板DNA（斜体加粗部分为引物结合序列）：
CTTCATCCCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGCCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGGTGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAGCTCCCTCCACCCCACTCTCACCGCACCGTCCTCGCACAG
合成人MTHFR的序列2作为模板DNA：
CTTCATCCCTCGCCTTGAACAGGTGGAGGCCAGCCTCTCCTGACTGTCATCCCTATTGGCAGGTTACCCCAAAGGCCACCCCGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTGACCTGAAGCACTTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAGTCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGGCTGACACATTCTTCCGCTTTGTGAAGGCATGCACCGACATGGGCATCACTTGCCCCATCGTCCCCGGGATCTTTCCCATCCAGGTGAGGGGCCCAGGAGAGCCCATAAGCTCCCTCCACCCCACTCTCACCGCACCGTCCTCGCACAG
1.4.配液：按照下面浓度配制反应液：2mM dNTP、2.5mM Mg2+、1U/反应pfu DNA聚合酶、10mM pH8.3Tris、50mM KCl、0.1pmol/ul引物人MTHFR-01、0.1pmol/ul引物人MTHFR-02、0.1pmol/ul引物人MTHFR-03、模板DNA，加水至体积为20ul。
序列1和序列2的模板DNA分别进行了梯度稀释后（1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul），用于荧光PCR扩增。
模板用量：ddH2O（即0）、2pg/反应、20pg/反应、200pg/反应、2000pg/反应。
1.5.使用的循环参数：95摄氏度5分钟
（95摄氏度10秒 58摄氏度45秒）10个循环
（95摄氏度10秒 60摄氏度45秒）35个循环
1.6.荧光定量PCR检测：使用Bio-rad CFX96荧光PCR仪。
1.7.结果：浓度分别为0pg/ul、1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul的样品的Ct值见下表1。
表1
“/”表示阴性样品，无此SNP位点；“N”表示检测结果为阴性；模板加入量（序列1+序列2）指MTHFR序列1和MTHFR序列2放入PCR反应中的量。
1.8.结果判定方法：若Ct（VIC，C）和Ct（FAM，T）都大于35，则说明样品浓度低或有抑制，需重做。若Ct（VIC，C）或Ct（FAM，T）中有一个Ct值小于32，则按如下结果判定：
i）、Ct（VIC，C）-Ct（FAM，T）<-3，则判断SNP位点为CC纯合型；
ii）、Ct（VIC，C）-Ct（FAM，T）>3，则判断SNP位点为TT纯合型；
iii)、-1<Ct（VIC，C）-Ct（FAM，T）<1，则判断SNP位点为CT杂合型。
试验证实，各样品检测结果均与测序背景一致；其中样品1结果为阴性，样品2为SNP位点为C的纯合型样品，样品3为SNP位点为T的纯合型样品，样品4和5为杂合型样品。参见图4，图4A为纯合型样品的典型扩增曲线，其两条引物之一有扩增；图4B为杂合型样品的典型扩增曲线，其两条引物均有扩增。
实施例2.人TfR rs41295879基因多态性引物设计和其应用：
2.1.人TfR引物设计：
人TfR-01用于检测SNP（AAAATCC A/G GTGTAGGCA）位点G等位基因、人TfR-02用于检测SNP（AAAATCC A/G GTGTAGGCA）位点A等位基因、人TfR-03为下游引物。
人TfR-01：5'-CCTGGAGCTGCAAAATCCAG–3'
人TfR-02：5'-CCTGGAGCTGCAAAATCCGG–3'
人TfR-03：5'-CACCAATATTCAAAAGAATCAA-3'
2.2.引物修饰：
人TfR-01：5'（FAM）-CCTGGAGCTGCAAAATCCAG–（BHQ1）3'
人TfR-02：5'（VIC）-CCTGGAGCTGCAAAATCCGG–（BHQ1）3'
2.3.模板合成：
合成人TfR序列1作为模板DNA：
AGCTGATTATATAAGTTCTTTCTTCCTCTTTTTTCTTTTTTAAAGATCACTATGTTGTAGTTGGGGCCCAGAGAGATGCATGGGGCCCTGGAGCTGCAAAATCCAGTGTAGGCACAGCTCTCCTATTGAAACTTGCCCAGATGTTCTCAGATATGGTCTTAAAAGGTAGAGTACAAATTTTGATTCTTTTGAATATTGGTGCACTGCATACAGTTCTAGATGTTATACTGTGCTTTGCTCACTTTGCCTGCATTCCTGTGGTTCTCATGCTAGACTCTAGTTCTTAAATACAAGGCAGATT
合成人TfR序列2作为模板DNA：
AGCTGATTATATAAGTTCTTTCTTCCTCTTTTTTCTTTTTTAAAGATCACTATGTTGTAGTTGGGGCCCAGAGAGATGCATGGGGCCCTGGAGCTGCAAAATCCGGTGTAGGCACAGCTCTCCTATTGAAACTTGCCCAGATGTTCTCAGATATGGTCTTAAAAGGTAGAGTACAAATTTTGATTCTTTTGAATATTGGTGCACTGCATACAGTTCTAGATGTTATACTGTGCTTTGCTCACTTTGCCTGCATTCCTGTGGTTCTCATGCTAGACTCTAGTTCTTAAATACAAGGCAGATT
2.4.配液：按照下面浓度配制反应液：2mM dNTP、2.5mM Mg2+、1U/反应KOD DNA聚合酶、10mM pH8.3Tris、50mM KCl、0.1pmol/ul引物TfR-01、0.1pmol/ul引物人TfR-02、0.1pmol/ul引物人TfR-03、模板DNA，加水至体积为20ul。
其中序列1和序列2的模板DNA分别进行了梯度稀释后（1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul），用于荧光PCR扩增。
模板用量：ddH2O、2pg/反应、20pg/反应、200pg/反应、2000pg/反应。
2.5.使用的循环参数：95摄氏度5分钟
（95摄氏度10秒 58摄氏度45秒）10个循环
（95摄氏度10秒 60摄氏度45秒）35个循环
2.6.荧光定量PCR仪仪器：Bio-rad CFX96荧光PCR仪。
2.7.结果：浓度分别为0pg/ul、1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul的样品的Ct值见下表2。
表2
“/”表示阴性样品，无此SNP位点；“N”表示检测结果为阴性；模板加入量（序列1+序列2）指人TfR序列1和人TfR序列2放入PCR反应中的量。
2.8.结果判定方法：若Ct（VIC，A）和Ct（FAM，G）都大于35，则说明样品浓度低或有抑制，需重做。若Ct（VIC，A）或Ct（FAM，G）中有一个Ct值小于32，则按如下结果判定：
i）、Ct（VIC，A）-Ct（FAM，G）<-3，则判断SNP位点为AA纯合型；
ii）、Ct（VIC，A）-Ct（FAM，G）>3，则判断SNP位点为GG纯合型；
iii)、-1<Ct（VIC，A）-Ct（FAM，G）<1，则判断SNP位点为AG杂合型。
试验证实，各样品检测结果均与测序背景一致；其中样品1结果为阴性，样品2为SNP位点为A的纯合型样品，样品3、5为SNP位点为G的纯合型样品，样品4为杂合型样品。
实施例3.人TfR rs3817672基因多态性引物设计和其应用：
3.1.人TfR引物设计：
人TfR-04用于检测SNP（ACAGACTTCACC A/G GCACCATCAAGT）位点G等位基因、人TfR-05用于检测SNP（ACAGACTTCACC A/GGCACCATCAAGT）位点A等位基因、人TfR-06为下游引物。
人TfR-04：5'-GGACAGCACAGACTTCACCAGC–3'
人TfR-05：5'-GGACAGCACAGACTTCACCGGC–3'
人TfR-06：5'-CCACAGTGTCACCATTATTGTTTC-3'
3.2.引物修饰：
人TfR-04：5'（FAM）-GGACAGCACAGACTTCACCAGC–（BHQ1）3'
人TfR-05：5'（VIC）-GGACAGCACAGACTTCACCGGC–（BHQ1）3'
3.3.模板合成：
合成人TfR序列3作为模板DNA：
ACTTCCCTGCAGCACGTCGCTTATATTGGGATGACCTGAAGAGAAAGTTGTCGGAGAAACTGGACAGCACAGACTTCACCAGCACCATCAAGTGAGTGCCAGCTGCTGTGCAAGTATCTAGACAAGTAATTCAAGAATTATGATAGGCCACGGGGAAACAATAATGGTGACACTGTGGGGAATGGCTTGTTAGAGAAGACAAGACTTGTCATGTTTAGCTAAAGAGGGGAAGGGGCCTGTAAAAAACTGAAACTATACTGG
合成人TfR序列4作为模板DNA：
ACTTCCCTGCAGCACGTCGCTTATATTGGGATGACCTGAAGAGAAAGTTGTCGGAGAAACTGGACAGCACAGACTTCACCGGCACCATCAAGTGAGTGCCAGCTGCTGTGCAAGTATCTAGACAAGTAATTCAAGAATTATGATAGGCCACGGGGAAACAATAATGGTGACACTGTGGGGAATGGCTTGTTAGAGAAGACAAGACTTGTCATGTTTAGCTAAAGAGGGGAAGGGGCCTGTAAAAAACTGAAACTATACTGG
3.4.配液：按照下面浓度配制反应液：2mM dNTP、2.5mM Mg2+、1U/反应KOD DNA聚合酶、10mM pH8.3Tris、50mM KCl、0.1pmol/ul引物人TfR-04、0.1pmol/ul引物人TfR-05、0.1pmol/ul引物人TfR-06、模板DNA，加水至体积为20ul。
其中模板DNA分别进行了梯度稀释后（1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul），用于荧光PCR扩增。
模板用量：0个/反应、2pg/反应、20pg/反应、200pg/反应、2000pg/反应。
3.5.使用的循环参数：95摄氏度5分钟
（95摄氏度10秒 58摄氏度45秒）10个循环
（95摄氏度10秒 60摄氏度45秒）35个循环
3.6.荧光定量PCR仪仪器：Bio-rad CFX96荧光PCR仪。
3.7.结果：浓度分别为ddH2O、1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul的Ct值见下表3。
表3
“/”表示阴性样品，无此SNP位点；“N”表示检测结果为阴性；加入量（序列3+序列4）指人TfR序列3和人TfR序列4放入PCR反应中的量。
3.8.结果判定方法：若Ct（VIC，A）和Ct（FAM，G）都大于35，则说明样品浓度低或有抑制，需重做。若Ct（VIC，A）或Ct（FAM，G）中有一个Ct值小于32，则按如下结果判定：
i）、Ct（VIC，A）-Ct（FAM，G）<-3，则判断SNP位点为AA纯合型；
ii）、Ct（VIC，A）-Ct（FAM，G）>3，则判断SNP位点为GG纯合型；
iii)、-1<Ct（VIC，A）-Ct（FAM，G）<1，则判断SNP位点为AG杂合型。
试验证实，各样品检测结果均与测序背景一致；其中样品1结果为阴性，样品2、4为SNP位点为G的纯合型样品，样品3为SNP位点为A的纯合型样品，样品5为杂合型样品。
实施例4.人EGFR基因变异引物设计和其应用：
本实施例针对人EGFR基因第19外显子的突变热点区可能发生的多种突变进行不区分突变类型的突变检测，其中选取了64种突变类型，合成模板序列进行验证。
4.1.人EGFR引物设计：
人EGFR-01用于检测SNP位点突变基因、人EGFR-02用于检测总的EGFR基因数量、人EGFR-03为下游引物。（SNP类型见表4，E-1为EGFR野生型DNA序列，E-2～E-65为发生突变的基因序列，其中带下划线为基因缺失的区域，斜体为基因突变后与野生型有区别的序列区域）
表4：EGFR的突变类型
| E-1 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-2 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-3 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-4 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUU CCA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-5 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUC CCC AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-6 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUA CCG AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-7 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-8 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAU CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-9 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAC CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-10 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CAC CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-11 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CAA CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-12 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CGA CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-13 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CGT CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-14 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CGC CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-15 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CGG CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-16 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AGA CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-17 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AGG CCT AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-18 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUN GCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-19 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG ATN CCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-20 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUN CCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-21 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUN UCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-22 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG TTN UCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-23 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CTN UCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-24 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GTN UCN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-25 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUN AGN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-26 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG TTN AGN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-27 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CTN AGN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-28 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GTN AGN AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-29 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-30 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CAG TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-31 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-32 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-33 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-34 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUG TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-35 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CCA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-36 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CCC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-37 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CCG TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-38 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG CCT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-39 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-40 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG TCA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-41 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG TCC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-42 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG TCG TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-43 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG TCT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-44 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AGT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-45 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AGC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-46 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-47 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-48 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-49 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG UUT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-50 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG UUC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-51 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GGN TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-52 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-53 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-54 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GTN TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-55 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GCN TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-56 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG AUA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-57 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GCN TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-58 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAT TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-59 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAC TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-60 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GUN TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-61 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-62 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
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| E-65 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTC AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
人EGFR-01：5'-AAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTA–3'
人EGFR-02：5'-GTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTA–3'
人EGFR-03：5'-ATCGAGGATTTCCTTGTTG-3'
4.2.引物修饰：
人EGFR-01：5'（FAM）-AAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTA–（BHQ1）3'
人EGFR-02：5'（VIC）-GTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTA–（BHQ1）3'
4.3.模板合成：
合成人EGFR序列E-1～E-65作为模板DNA：
| E-1 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC AAG GAA TTA AGA GAA GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
| E-2 | GGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATC GCA ACA TCT CCG AAA GCCAACAAGGAAATCCTCGAT |
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4.4.配液：按照下面浓度配制反应液：2mM dNTP、2.5mM Mg2+、1U/反应KOD DNA聚合酶、10mM pH8.3Tris、50mM KCl、0.1pmol/ul引物人EGFR-01、0.1pmol/ul引物人EGFR-02、0.1pmol/ul引物人EGFR-03、模板DNA，加水至体积为20ul。
其中模板DNA分别进行了梯度稀释后（1pg/ul、10pg/ul、100pg/ul、1000pg/ul），用于荧光PCR扩增。
模板用量：ddH2O、2pg/反应、20pg/反应、200pg/反应、2000pg/反应。
4.5.使用的循环参数：95摄氏度5分钟
（95摄氏度10秒 58摄氏度45秒）10个循环
（95摄氏度10秒 60摄氏度45秒）35个循环
4.6.荧光定量PCR仪仪器：Bio-rad CFX96荧光PCR仪。
4.7.结果：取50pg/ul的合成DNA做模板，检测的Ct值见下表4。
4.8.结果判定方法：若Ct（VIC，W）和Ct（FAM，M）都大于35，则说明样品浓度低或有抑制，需重做。若Ct（VIC，W）或Ct（FAM，M）中有一个Ct值小于32，则按如下结果判定。
i）、Ct（VIC，W）-Ct（FAM，M）<-6，则判断EGFR为野生；
ii）、Ct（VIC，W）-Ct（FAM，M）>-6，则判断EGFR发生突变。
试验证实，各样品检测结果与实际情况一致。证明了按照本发明的方法，针对人EGFR基因的突变热点区域，仅采用针对野生型位点设计的AS-PCR引物，即可检测出该基因突变热点区域各种突变类型。
值得说明的是，尽管以上优选实施方式是以探针与引物合二为一设计的荧光PCR（荧光猝灭基团屏蔽引物3’端羟基）为例进行实验检测的，但本领域技术人员根据其所掌握的背景知识以及本发明的技术员可充分理解，本发明所提出的引物设计原理同样适用于传统电泳检测或者传统的荧光PCR检测，这也同样得到了实验验证，以上所举实施方式由于具有最为简化的试验操作步骤，是最优选的实施方式。
因此，以上所述仅为本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，本发明要求保护的范围由权利要求书以及其等同替换方式所限定，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种AS-PCR引物的设计方法，所述方法包括以下步骤：
(i)针对包含待测等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；
(ii)对步骤(i)所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团，
其中，步骤(ii)获得的经修饰的AS-PCR引物用于使用B型DNA聚合酶进行的PCR反应，使得所述经修饰的AS-PCR引物在与模板链错配时延伸，而与模板链互补时不延伸，
其中，所述B型DNA聚合酶是指不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，还具有3’端到5’端的DNA外切酶活性的DNA聚合酶。
2.一种AS-PCR基因多态性检测方法，所述方法用于对可能包含等位基因变异区域的靶序列进行检测以确定等位基因变体是否存在，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(i)针对所述可能包含等位基因变异区域的靶序列设计AS-PCR引物；
(ii)对步骤(i)所设计的AS-PCR引物进行修饰，使所述AS-PCR引物的3’端最后一个碱基带有能够屏蔽所述AS-PCR引物直接延伸的基团；
(iii)使用步骤(ii)获得的经修饰的AS-PCR引物对所述靶序列进行PCR扩增，所述PCR扩增使用B型DNA聚合酶；
(iv)分析步骤(iii)的扩增结果确定所述等位基因变体是否存在，
其中，所述B型DNA聚合酶是指不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，还具有3’端到5’端的DNA外切酶活性的DNA聚合酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(i)中所述等位基因变异区域位于所述AS-PCR引物的3’端的第1～6个碱基中，所述引物的长度为18bp～30bp。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中使在扩增反应中所述AS-PCR引物的5’端到所述等位基因变异区域的Tm值为48℃～52℃。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(ii)对所述AS-PCR引物的3’端的修饰包括脱羟基、羟基位置修饰氨基、羟基位置修饰羧基、羟基位置修饰巯基或羟基位置修饰磷酸基。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(ii)对所述AS-PCR引物的3’端的修饰为标记荧光淬灭基团，并且步骤(ii)进一步包括对所述AS-PCR引物的5’端标记荧光基团。
7.根据权利要求6所述的方法，其中标记所述AS-PCR引物5’端的所述荧光基团选自下列物质所构成的组：FAM、VIC、HEX、ROX、Taxas Red或CY5，标记所述AS-PCR引物3’端的所述荧光淬灭基团选自下列物质所构成的组：BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyle、Temra或Eclipse。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述B型DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶或KOD DNA聚合酶。
9.一种AS-PCR基因多态性检测试剂盒，其中至少包含以下成分：
a.根据权利要求2至8中任一项所述的方法步骤(i)-(ii)所设计的AS-PCR引物；
b.根据权利要求2至8中任一项所述的方法步骤(iii)中使用的B型DNA聚合酶；
其中，所述B型DNA聚合酶是指不但具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，还具有3’端到5’端的DNA外切酶活性的DNA聚合酶。
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