JP2006500057A - B−raf遺伝子における突然変異のpcrに基づく診断的検出方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、B−RAF遺伝子における突然変異の検出を目的とするPCRに基づく方法であって、突然変異塩基(複数も可)と相補的であるプライマーを用い、DNAの増幅が行われたか否かを測定することにより突然変異を検出することを含む方法に関するものである。
Description
発明の要旨
本発明は、核酸、特にゲノムDNAにおける特異的突然変異の検出を目的とする好都合なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法に関するものである。
本発明は、核酸、特にゲノムDNAにおける特異的突然変異の検出を目的とする好都合なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法に関するものである。
発明の背景
一部の癌および他の増殖性疾患は、増殖を促進するかまたは細胞分化または正常な細胞死を妨げる形で正常細胞を形質転換する突然変異により誘発されると仮定されている。上記突然変異は、たとえば、細胞生長を促し、細胞分化またはアポトーシス経路を妨げ、活性が高められたかまたは低下した酵素または他の因子を生産するなどの遺伝子を活性化し得る。特定突然変異の存在または不存在は、疾患の適切な処置に関する決定にとっての基礎であり得る。すなわち、上記突然変異を検出できることは、上記疾患の適切な処置にとって非常に重要であり得る。
一部の癌および他の増殖性疾患は、増殖を促進するかまたは細胞分化または正常な細胞死を妨げる形で正常細胞を形質転換する突然変異により誘発されると仮定されている。上記突然変異は、たとえば、細胞生長を促し、細胞分化またはアポトーシス経路を妨げ、活性が高められたかまたは低下した酵素または他の因子を生産するなどの遺伝子を活性化し得る。特定突然変異の存在または不存在は、疾患の適切な処置に関する決定にとっての基礎であり得る。すなわち、上記突然変異を検出できることは、上記疾患の適切な処置にとって非常に重要であり得る。
本発明は、特異的突然変異が核酸の特定セグメントに存在するか否かを測定する診断方法についての基礎としてPCRに信頼を置くものである。PCRは、既知配列の2領域間に存する核酸セグメントのインビトロ増幅についてのよく知られた技術である。一般的に、鋳型核酸をたとえば加熱により変性させ、次いで2つのオリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングさせる。プライマーは、鋳型核酸の反対鎖の配列と相補的であり、増幅される核酸セグメントの両端に位置する。当業者に公知の条件下、適切な核酸ポリメラーゼ、たとえばDNAポリメラーゼに曝露すると、所望の核酸セグメントの新たな2コピーが製造される。このサイクルを数回反復すると、所望の核酸セグメントのコピー数は、理論的には2n倍(nはサイクル数である)で増加する。明らかな通り、幾つかのサイクル後、所望の核酸セグメントの多くの新たなコピーが製造される。
本発明によると、プライマーの一方(以後「検出プライマー」)の3'末端は、鋳型核酸の第一鎖で推測されている突然変異と相補的であり、第二プライマーは、PCRにより製造された場合に増幅産物が検出可能となるように充分に突然変異の上流または下流にある鋳型核酸の反対鎖のセグメントと相補的である。PCR実施条件は、検出プライマーの3'末端が鋳型核酸の第一鎖と相補的であるときのみPCRが進行するように選択される。すなわち、検出プライマーの3'末端が突然変異塩基と相補的である場合、PCRによる核酸セグメントの増幅は、突然変異が鋳型核酸に存在することを示す。
発明の詳細な記載
第一局面において、本発明は、核酸における突然変異の検出方法であって、
(a)検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でエキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼを用いるPCRにより突然変異を含む核酸セグメントの増幅を試み、ただし、検出プライマーの3'末端は、核酸の第一鎖における突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、核酸の反対鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれている場合に検出可能増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)核酸セグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法である。
第一局面において、本発明は、核酸における突然変異の検出方法であって、
(a)検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でエキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼを用いるPCRにより突然変異を含む核酸セグメントの増幅を試み、ただし、検出プライマーの3'末端は、核酸の第一鎖における突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、核酸の反対鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれている場合に検出可能増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)核酸セグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法である。
好ましくは、核酸はDNA、たとえばゲノムDNAである。すなわち、本発明のこの局面は、さらに特定すれば既知配列のDNAにおける特異的突然変異の検出方法であって、
(a)突然変異を含むDNAのセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、DNAセグメントの第一鎖における突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、突然変異塩基を含む核酸セグメントの検出可能な増幅が行われ得るように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法に関するものである。
(a)突然変異を含むDNAのセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、DNAセグメントの第一鎖における突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、突然変異塩基を含む核酸セグメントの検出可能な増幅が行われ得るように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法に関するものである。
プライマーは、鋳型核酸の反対鎖の配列に相補的であり、増幅される核酸セグメントの両端に位置するオリゴヌクレオチドである。プライマーは、少なくとも約14ヌクレオチド長、好ましくは約16〜24ヌクレオチド長、たとえば20〜24ヌクレオチド長であるべきである。本発明のこの局面の基礎は、突然変異を含むと考えられている核酸セグメント、たとえばDNAセグメントにおける突然変異塩基と相補的であることが知られている3'末端を有する検出プライマーの使用である。PCRは、3'末端の塩基が鋳型核酸鎖における突然変異点に存在する塩基と相補的でなければ、検出プライマーの3'末端で伸長が行なわれない条件下で実施される。すなわち、検出プライマーの3'末端が鋳型核酸における突然変異点に存在する塩基と相補的でなければ、大した量の核酸セグメント増幅は起こらない。したがって、検出プライマーの3'末端が突然変異と相補的である場合、核酸セグメントの増幅は、突然変異が存在することを示す。
PCRは2本のプライマーが両端に位置する鋳型核酸セグメントを増幅するため、本発明にしたがって増幅される核酸セグメントは2本のプライマーにより画定される。したがって、第二プライマーは、核酸の反対鎖と相補的であり、増幅産物が容易に検出され得るように突然変異の充分に上流または下流に位置するように選択される。一般に、増幅される核酸セグメントは、少なくとも約70塩基対を含むべきである。核酸セグメントは、少なくとも70塩基対長、ただし6000塩基対長を越えない、たとえば約100〜1000または150〜500塩基対長であるように増幅されるのが好ましい。それぞれの場合において、核酸セグメントは検出される突然変異を含む。
本発明方法によると、PCRは、検出プライマーの3'末端にある塩基が鋳型核酸における対応塩基と相補的でなければ、増幅があまり行われない条件下で実施される。上記条件は、一般的に標準であるが、使用されている条件下で3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼの使用を必要とする。3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたない上記核酸ポリメラーゼは、当業者には公知であり、市販されている。それらの例としては、Taq、Vent(エキソ−)[ニューイングランド・バイオラボズ]、Deep Vent(エキソ−)[ニューイングランド・バイオラボズ]、9°Nポリメラーゼ[ニューイングランド・バイオラボズ]およびMasterAmp(登録商標)AmpliTherm(登録商標)[エピセントレ]ポリメラーゼがあり、これらは全て市販されている。核酸はDNAであり、DNAポリメラーゼは、Taq、VENT(エキソ−)、DEEP VENT(エキソ−)、9°NおよびMASTERAMP AMPLITHERM DNAポリメラーゼから選択されるDNAポリメラーゼ、特にTaq DNAポリメラーゼであるのが好ましい。
一般的に、本発明方法によると、約20〜40サイクルのPCRを実施する。好ましくは、約25〜35サイクル、特に35サイクルのPCRを実施する。
核酸セグメントの増幅が行なわれているか否かは、当業者に公知の方法により検出される。上記検出方法には、特にゲル電気泳動があり、DNA染色はたとえば臭化エチジウム方法により行なわれる。
本発明方法によると、検出プライマーの3'末端にある塩基が鋳型核酸における対応塩基と相補的である場合のみ増幅が行われる。すなわち、検出プライマーの3'末端が突然変異と相補的である場合、増幅産物の存在は、突然変異が鋳型核酸鎖に存在することを示しており、増幅産物の不存在は、鋳型核酸が突然変異を含まないことを示している。
すなわち、本発明は、核酸における特異的突然変異の検出方法であって、
(a)検出プライマーおよび第二プライマーの存在下で3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼを用いるPCRにより突然変異を含む核酸セグメントの増幅を試み、ただし、検出プライマーの3'末端は、核酸の第一鎖における突然変異点にある突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、核酸の反対鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれている場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)核酸セグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)核酸セグメントが増幅されている場合には突然変異が存在することを示すものとする
方法を包含する。
(a)検出プライマーおよび第二プライマーの存在下で3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたない核酸ポリメラーゼを用いるPCRにより突然変異を含む核酸セグメントの増幅を試み、ただし、検出プライマーの3'末端は、核酸の第一鎖における突然変異点にある突然変異塩基と相補的であることが既知であり、第二プライマーは、核酸の反対鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれている場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)核酸セグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)核酸セグメントが増幅されている場合には突然変異が存在することを示すものとする
方法を包含する。
当業者であれば、PCRに適切な第二プライマーの選択に使用される基準については理解できるはずである。一般に、第二プライマーは、反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に増幅産物が突然変異を含み、容易に検出され得るほどの充分なヌクレオチドを含むように充分に突然変異の上流または下流に位置する。好ましくは、第二プライマーは、それが少なくとも約14ヌクレオチド長、および好ましくは約16〜24ヌクレオチド長、たとえば20〜24ヌクレオチド長であるように選択され、増幅産物は、少なくとも約70塩基対、たとえば70〜6000塩基対、好ましくは100〜1000塩基対、たとえば150〜500塩基対を含み、好ましくは検出プライマーの場合と類似した融解点を有する。
本発明の別の局面は、B−RAF遺伝子における突然変異の検出に関するものである。B−RAFは、RAS−RAF−MEK−ERKキナーゼ経路で機能するセリン/トレオニンキナーゼである。ヒトB−RAF遺伝子のヌクレオチド配列は既知である。B−RAFは、通例、試験された黒色腫セルラインの59%を含む、ヒト癌において幾つかの体細胞点突然変異の一つにより活性化されることが最近報告されている。Davies et al.、Nature、第417巻、949〜954頁(2002)参照。癌患者のB−RAF遺伝子からこれらの突然変異が検出できることから、たとえば、B−RAFキナーゼを阻害するかまたは突然変異キナーゼの発現を制限する化合物による処置を含む合理的な処置の選択肢がもたらされる。
本発明のこの局面によると、B−RAF遺伝子における突然変異は、上記のPCRに基いた方法より検出される。すなわち、本発明は、さらにB−RAFにおける特異的突然変異の検出方法であって、
(a)突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、B−RAF遺伝子の第一DNA鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、そして
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法に関するものである。
(a)突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、B−RAF遺伝子の第一DNA鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、そして
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法に関するものである。
好ましくは、検出プライマーの3'末端は突然変異塩基と相補的であり、突然変異が存在するときのみ顕著な増幅が行われる。すなわち、本発明は、さらにB−RAF遺伝子における特異的突然変異の検出方法であって、
(a)突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でエキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、B−RAF遺伝子の第一DNA鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)増幅産物の存在または不存在を検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でエキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、B−RAF遺伝子の第一DNA鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)増幅産物の存在または不存在を検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
上記で示されているところによると、プライマーは、少なくとも約14ヌクレオチドを含むべきであり、好ましくは16〜24ヌクレオチドを含む。すなわち、プライマーは、その3'末端に表1に具体的に示された14程度のヌクレオチドを含むべきである。しかしながら、有用なプライマーは、5'末端に追加的ヌクレオチドを含むことが多い。オリゴヌクレオチドがプライマーとして機能するのに充分なヌクレオチドを含むこと、および3'末端にあるヌクレオチドは突然変異と相補的であることが既知であることが専ら重要である。
すなわち、本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1388A突然変異の検出方法であって、
(a)G1388A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号1を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1388A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号1を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1388T突然変異の検出方法であって、
(a)G1388T突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号2を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1388T突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号2を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1394C突然変異の検出方法であって、
(a)G1394C突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号3を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1394C突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号3を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1394A突然変異の検出方法であって、
(a)G1394A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号4を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1394A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号4を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1394T突然変異の検出方法であって、
(a)G1394T突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号5を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1394T突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号5を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1403C突然変異の検出方法であって、
(a)G1403C突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号6を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1403C突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号6を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1403A突然変異の検出方法であって、
(a)G1403A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号7を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1403A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号7を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1753A突然変異の検出方法であって、
(a)G1753A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号8を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1753A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号8を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるT1782G突然変異の検出方法であって、
(a)T1782G突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号9を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)T1782G突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号9を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるG1783C突然変異の検出方法であって、
(a)G1783C突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号10を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)G1783C突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号10を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるT1787G突然変異の検出方法であって、
(a)T1787G突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号12を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)T1787G突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号12を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるT1796A突然変異の検出方法であって、
(a)T1796A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号13を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)T1796A突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号13を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
さらに本発明は、ヒトB−RAF遺伝子におけるTG1796−97AT突然変異の検出方法であって、
(a)TG1796−97AT突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号14を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
(a)TG1796−97AT突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、配列番号14を有する3'末端を含む検出プライマーおよび第二プライマーの存在下でPCRによる増幅にかけ、ただし、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に検出可能な増幅産物が製造されるように選択されるものとし、
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出し、そして
(c)B−RAF遺伝子のセグメントが増幅されているときには特異的突然変異が存在することを示すものとする
方法に関するものである。
本発明のこの局面によると、第二プライマーは、それが反対側DNA鎖のセグメントと相補的であり、PCRが行なわれる場合に増幅産物が容易に検出され得るほどの充分なヌクレオチドを含むように充分に突然変異の上流または下流に位置するように選択される。好ましくは、第二プライマーは、それが少なくとも約14ヌクレオチド長、および好ましくは約16〜24ヌクレオチド長、たとえば20〜24ヌクレオチド長であるように選択され、増幅産物は、少なくとも約70塩基対、たとえば70〜6000塩基対、好ましくは100〜1000塩基対、たとえば150〜500塩基対を含み、好ましくは検出プライマーの場合と類似した融解点を有する。
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様において、表3に示した検出プライマーは、対応する突然変異について表4に示した第二プライマーと連係的に使用される。
表1、2、3および5に列挙した各検出プライマーは、表に報告されている対応するB−RAF突然変異を検出する目的で本発明にしたがって使用され得る。本発明はまた、表1、2、3および5に列挙した対応する突然変異を検出するための検出プライマーを用いる本明細書記載のPCR方法に関するものである。
プライマーは、少なくとも14ヌクレオチドおよび好ましくは16〜24ヌクレオチド、たとえば23、22、21、20、19ヌクレオチドを含むべきである。本発明によると、配列番号57から誘導された有用なプライマーは、5'末端にそれより少ないヌクレオチドを含み得、その3'末端には表5で特定された14ヌクレオチドを当然含む。ヌクレオチドが、プライマーとして機能するのに充分なヌクレオチドを含むこと、および3'末端にあるヌクレオチドが突然変異と相補的であることが既知であることは重要である。
本発明の他の一実施態様では、検出プライマー配列番号57が、突然変異T1796−97A(V599E)を検出するため第二プライマー配列番号58と共に使用される。
本発明のさらなる実施態様では、検出プライマー配列番号41が、突然変異T1796−97A(V599E)を検出するため第二プライマー配列番号55と共に使用される。
別の局面において、本発明は、突然変異ヒトB−RAF遺伝子のPCR増幅用オリゴヌクレオチドプライマーに関するものである。すなわち、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13または配列番号14を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
本発明のこの局面の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28を含む。
本発明のこの局面の特に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41または配列番号42により構成される。
さらなる局面において、本発明は、配列番号57、59、60、61および62を有するオリゴヌクレオチドプライマーに関するものである。
以下の実施例は、本発明をさらに制限するのではなく、さらに説明することを意図したものである。
実施例1:ヒトB−RAF遺伝子におけるT1796A突然変異の検出
検出プライマー:配列番号41、第二プライマー:配列番号55
ゲノムDNAを、GENELUTE哺乳類ゲノムDNAキット(シグマカタログ番号G1N350)を用いて黒色腫セルラインからのヒト細胞から単離する。ロシュによるPCRコアキット(カタログ番号1578 553)を用いることにより50マイクロリットルの総容量でPCR機(MJリサーチ、モデルPTC100)においてPCR反応を実施する。PCR反応混合物は、5マイクロリットルの10×反応緩衝液、1マイクロリットルの10mMのdNTP、100〜1000ngの鋳型DNA、0.5マイクロリットルのTaqポリメラーゼ(2.5〜5U)、1マイクロリットルの各プライマーの31μMストックを含む。
検出プライマー:配列番号41、第二プライマー:配列番号55
ゲノムDNAを、GENELUTE哺乳類ゲノムDNAキット(シグマカタログ番号G1N350)を用いて黒色腫セルラインからのヒト細胞から単離する。ロシュによるPCRコアキット(カタログ番号1578 553)を用いることにより50マイクロリットルの総容量でPCR機(MJリサーチ、モデルPTC100)においてPCR反応を実施する。PCR反応混合物は、5マイクロリットルの10×反応緩衝液、1マイクロリットルの10mMのdNTP、100〜1000ngの鋳型DNA、0.5マイクロリットルのTaqポリメラーゼ(2.5〜5U)、1マイクロリットルの各プライマーの31μMストックを含む。
PCR条件は以下の通りである:3分間95℃、35サイクルの[1分間94℃、30秒間50℃、1分間72℃]、10分間72℃、次いで4℃で浸漬。
増幅後、8マイクロリットルのPCR反応混合物を、2マイクロリットルの核酸試料ローディング緩衝液[バイオラッド、カタログ番号161−0767]と混合する。10マイクロリットルの試料を、0.3μg/mLの臭化エチジウム[ピアスカタログ番号17898]を含む1.5%アガロース[ギブコ−BRLカタログ番号15510−027]ゲルにローディングする。分子量標準[100bpのDNAラダー、インビトロゲン、カタログ番号10380−012]を、隣接レーンでローディングする。DNAを、TAE緩衝液(0.04Mのトリス−酢酸、0.01MのEDTA、0.02Mの氷酢酸pH8.4)[ロシュカタログ番号1666690]中での電気泳動により分離する。電気泳動条件は、30〜40分間120Vである。分離後、ゲルをUV光線に曝露し、アルファイメージャー2000ドキュメンテーションシステムで写真を撮影する。
一般的に、ゲルから2つのバンドが検出される。速く移動するバンドは100bpマーカーに先行し、プライマーを表す。T1796A突然変異体特異的PCR増幅から生じるDNAは、152bpの予測サイズを有し、予測通り100bp標準および200bp標準間で移動する。PCR増幅産物は、配列決定により確認される。PCR増幅産物の存在は、T1796A突然変異が鋳型DNAに存在することを立証する。
実施例2:ヒトB−RAF遺伝子におけるT1796A突然変異の検出
検出プライマー配列番号57および第二プライマー配列番号58を用いて、黒色腫セルラインからのヒト細胞から単離したゲノムDNAで実施例1の方法を実施した。
検出プライマー配列番号57および第二プライマー配列番号58を用いて、黒色腫セルラインからのヒト細胞から単離したゲノムDNAで実施例1の方法を実施した。
T1796A突然変異体特異的PCR増幅から生じるDNAは、142bpの予測サイズを有し、予測通り100bp標準および200bp標準間で移動する。PCR増幅産物は、配列決定により確認される。PCR増幅産物の存在は、T1796A突然変異が鋳型DNAに存在することを立証する。
実施例3:黒色腫および結腸癌患者からのDNAサンプルからのヒトB−RAF遺伝子におけるT1796A突然変異の検出
100名の黒色腫患者および100名の結腸癌患者からのゲノムDNAを、実施例1および実施例2記載の方法にしたがって分析した。プライマー配列番号41および配列番号55による実施例1の方法は、プライマー配列番号57および配列番号58による実施例2における方法と同じ結果をもたらす。
100名の黒色腫患者および100名の結腸癌患者からのゲノムDNAを、実施例1および実施例2記載の方法にしたがって分析した。プライマー配列番号41および配列番号55による実施例1の方法は、プライマー配列番号57および配列番号58による実施例2における方法と同じ結果をもたらす。
黒色腫患者の62.9%および結腸癌患者の8.2%は、V599E突然変異を有する。
Claims (9)
- B−RAF遺伝子における特異的突然変異の検出方法であって、
(a)突然変異を含むB−RAF遺伝子のセグメントを、検出プライマーおよび第二プライマーの存在下において3'→5'エキソヌクレアーゼ活性をもたないDNAポリメラーゼを用いるPCRによる増幅にかけ、ただし、検出プライマーの3'末端は、B−RAF遺伝子の第一DNA鎖における突然変異塩基と相補的であり、第二プライマーは、B−RAF遺伝子の反対側DNA鎖のセグメントと相補的であって、PCRが行なわれる場合に検出可能増幅産物が製造されるように選択されるものとし、そして
(b)DNAセグメントが増幅されているか否かを検出する
ことを含む方法。 - 検出プライマーが配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14を含む、請求項1記載の方法。
- 配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
- 配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27または28を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
- 配列番号29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41または42を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
- 配列番号57、59、60、61または62を含むオリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項1記載の方法にしたがって検出プライマーとして使用される、請求項4記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項1記載の方法にしたがって検出プライマーとして使用される、請求項5記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
- 請求項1記載の方法にしたがって検出プライマーとして使用される、請求項6記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
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