JP4145129B2 - Ｐｃｒクランピング法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型（single nucleotide polymorphisms: SNPs）を検出するためのＰＣＲクランピング法（PCR Clamping）に関し、より具体的には改良されたＰＣＲクランピング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子における一塩基変異多型が注目され、一塩基変異多型の分析が、疾患遺伝子の探索、疾患や薬剤感受性と一塩基変異多型との関連などの研究に進み、さらには、テーラーメード医療を可能とすることが期待されている。
このような注目の中、遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型を検出する方法が種々検討され、提案されている。
ＰＣＲクランピング法は、ＰＮＡ（ペプチド核酸：PNAはPeptide Nucleic Acid又はPolyamide Nucleic Acidの略）をプローブとして用い、該ＰＮＡプローブをＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）に組み合わせた方法である。PNA-directed PCR clampingとも称される。ＰＮＡ骨格構造は、一般的に N-（2-アミノエチル）-グリシン分子によってらせん構造を有し、塩基と骨格構造との立体的距離及び結合している各塩基間の距離は、ＤＮＡにおけるそれらと同じになるように設計されている。このことは、ＤＮＡが相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対し、ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成するように、ＰＮＡも相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対し二重鎖を作ることを意味する。ＰＮＡ／ＤＮＡの結合はＤＮＡ／ＤＮＡの結合よりも強いことが、融解温度（Ｔｍ）の測定結果から明らかになっており、ＰＮＡのＴｍの高さ、結合力の強さを利用した応用が注目されている。
【０００３】
上記ＰＣＲクランピング法の応用の一つとして、一塩基変異多型分析が報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
これは、ＰＮＡが有する相補的なＤＮＡへの高い結合力の強さと、一塩基でも異なればミスマッチの結合を起こしにくい、すなわち高い特異性と、ＰＮＡがＤＮＡポリメラーゼにとってプライマーとして機能しないという性質を利用したもので、ＰＮＡがＰＣＲ反応の阻害剤となる。
ＰＣＲクランピング法による一塩基変異多型分析の概略的な一具体例では、ワイルドタイプＰＮＡプローブとミュータントタイプＤＮＡプライマーセットを用いて、ワイルドタイプＤＮＡとミュータントタイプＤＮＡが共存する検体をＰＣＲ法に供した場合、ワイルドタイプＰＮＡプローブとミュータントタイプＤＮＡプライマーセットの一方とが拮抗し、ワイルドタイプＰＮＡがワイルドタイプＤＮＡにハイブリダイズしてワイルドタイプＤＮＡ断片の増幅は阻害され、一方ミュータントタイプＤＮＡプライマーセットによってミュータントタイプＤＮＡ断片の増幅が進行し、結果的にミュータントタイプＤＮＡの増幅断片のバンドのみが電気泳動法にて確認されることが意図される。この具体例におけるメカニズムを図１に表す。
【０００４】
しかしながら、ＰＣＲクランピング法には以下の欠点がある：▲１▼ＰＣＲクランピング法の実験系デザインには汎用的かつ明確な規則がなく、研究者によって試行錯誤の結果、最適な実験系を作らねばならず、費用と時間を要する、▲２▼検体中における遺伝子の濃度が一定以上の高濃度になった場合に、ＰＮＡプローブによるクランピング効果が充分でなくなり、ＰＣＲクランピング法の原理に基づいて増幅がブロックされるはずのタイプのＤＮＡ断片が増幅されてしまう、という不都合が生じる。
特に上記▲２▼の問題点について、改良する手段が研究者に強く求められている。
【０００５】
【非特許文献１】
ヘンリック オーラム（Henrik Orum）著、「PCR CLAMPING」Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. 1999, p.193-200
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法の実施にあたり、ＰＮＡプローブによるクランピング効果を充分に発揮させ、高感度で判定をより正確に行うことができる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、従来のＰＣＲクランピング法が、ＰＣＲ反応液中に一組のプライマーセット（アッパープライマーとロワープライマー）とＰＮＡプローブを添加して実施するのに対し、更なるプライマーを加えてＰＣＲ法を実施することにより、検体が高濃度の遺伝子を含有するときにもＰＮＡプローブによるクランピング効果を発揮させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の方法によれば、ＰＮＡプローブによるクランピング効果が充分に発揮されることから、上記プライマーセットによって増幅されることが意図されるタイプの遺伝子断片が、検体中における当該タイプの遺伝子の存在又は非存在に応じて正確に、増幅する又は出現しないという結果をもって判定することができる。
【０００８】
本明細書中において一塩基変異多型とは、一塩基のみが変異している多型のほかに、一塩基変異が２ヶ所以上存在する、すなわち２塩基以上で数塩基までの変異による多型や、一塩基以上数塩基までの挿入や欠損による多型を包含する。従って本明細書中で一塩基変異多型部位とは、一塩基のみが変異している部位、一塩基変異が２ヶ所以上存在する部位、一塩基以上数塩基までの挿入や欠損がある部位を包含して意味する。
【０００９】
従って本発明は、次の態様のＰＣＲクランピング法に向けられている。
（１）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；該標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマー；及びミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
（２）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマー、及び該アッパープライマーとプライマーセットをなすロワープライマー；及びミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるアッパープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
【００１０】
（３）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子のミュータントタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマー；及びワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
（４）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマー、及び該アッパープライマーとプライマーセットをなすロワープライマー；及びワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるアッパープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
【００１１】
本明細書中で、ワイルドタイプ型とミュータントタイプ型とは、標的遺伝子の一塩基変異多型が野生型と変異型とに分類できる場合には前者と後者をそれぞれ表し、標的遺伝子の一塩基変異多型が野生型と変異型とに分類して呼称できないときには、一塩基変異多型の一方と他方をそれぞれ表すものとする。
上記（１）の態様で説明すると、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブと、該標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーとは拮抗するものである。上記の「該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列」とは、該一塩基変異多型部位を含まない部分配列であってもよい。上記の「該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列」は、ＰＮＡ配列よりも１〜２０塩基ほど、標的とする配列の３′側へずれた範囲へセッティングすることがより望ましく、特に、ＰＮＡ配列と部分的に重複している配列が好ましい。
上記（２）〜（４）の態様についても同様のことがいえる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
先ず、従来のＰＣＲクランピング法における、一般的なプライマーセットとＰＮＡプローブのデザインの一例を概略的に図２に示す。図２は、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を用いて示した。
本発明では、従来のＰＣＲクランピング法に、更なる追加のプライマーを用いてＰＣＲクランピング法を実施する。本発明のＰＣＲクランピング法におけるＰＮＡプローブ、プライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を、図３に概略的に示す。図３も、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を用いて示したものである。図２及び図３で、ロワープライマーは“Ｌｏプライマー”と示され、アッパープライマーは“Ｕｐプライマー”と示される。図３で、本発明で更に用いるロワープライマーを“Ｌｏプライマー２”と示す。図３に本発明の上記態様（１）又は（３）を当てはめると、図３中の“Ｌｏプライマー２”は、「ミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマー」又は「ワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマー」である。
【００１３】
本発明を上記態様（１）の例で、図２及び図３を参照しながら以下に説明する。検体中にワイルドタイプ型の遺伝子が存在するとき、標的遺伝子のワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型相当部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブを使用すれば、本来であれば、ワイルドタイプ型の遺伝子が完全にブロックされる。よって、上記ＰＮＡプローブと拮抗するミュータントタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマーとのセット（図２及び図３の“Ｌｏプライマー”と“Ｕｐプライマー”とのプライマーセット）によって、ワイルドタイプ型の遺伝子断片が増幅されることはない。したがって、ＰＣＲの結果、図３で示した317塩基対（317bp）の断片が発生が確認されたとき、即、検体中にミュータントタイプ型遺伝子ＤＮＡが存在するという判定をすることができるのが理想である。
ところが、検体中にワイルドタイプ型の遺伝子が比較的多量に存在するとき、上記のプライマーセットによって実際、ワイルドタイプ型の遺伝子断片の増幅が起こる。これでは、検体中におけるミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在にかかわらず、上記プライマーセットによって増幅された長さの断片が現れることになり、図３で示した317bp断片の増幅が電気泳動によるバンドとして確認されたときに、それがワイルドタイプ型遺伝子に由来するものか又はミュータントタイプ型遺伝子によるものか、この結果からは判断できず、結局、検体中におけるミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在が判定できない。
【００１４】
本発明では、さらに追加のプライマー、すなわち図３で示す“Ｌｏプライマー２”を存在させることによって、ワイルドタイプ型遺伝子に由来する図３で示した317bpの断片の増幅を阻害することができることを見出した。そして、結果として317bpの断片の増幅の有無が、検体中におけるミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在の判定につながる。PCRの結果、ワイルドタイプ型遺伝子に由来する図３に例示する598bpの断片の増幅が起こったとしても、上記プライマーセットによる特定の長さの断片、すなわち317bpの増幅断片の有無によってミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在が判定できることは、たいへんに有利である。
本発明の上記態様（２）〜（４）でも同様のことがいえる。
本発明の方法を適用することができる標的遺伝子は、特に制限されるものではない。
【００１５】
次に、ＰＣＲクランピング法におけるＰＮＡプローブ及びプライマーについて説明する。
ＰＮＡとＤＮＡの構造比較は、以下に示すとおりである。ＰＮＡは、４種の各塩基が結合しているＰＮＡモノマーのオリゴマー又はポリマーである。すなわち、ＰＮＡモノマーは塩基とN-(2-アミノエチル)−グリシンという二つの部分からなり、これが一つのユニットとして繰り返されてＰＮＡとなる。そしてＰＮＡにおけるモノマーは、以下に示すように塩基に応じて４種類となる。
【００１６】
【化１】
【化２】
【００１７】
本発明において使用するＰＮＡプローブは常法によって製造することができる。ＰＮＡの結合の強さはアンチパラレルの相補的塩基配列のセッティングで最大となる。従って、ＰＮＡプローブは標的とするＤＮＡ配列に対して、以下のようなアンチパラレルの相補的塩基配列をセッティングすることが好ましい。
ＰＮＡプローブの長さは１２〜１８塩基が適当であり、好ましくはそのＴｍ値が６５〜７５℃のものである。また、標的とする配列に対してＰＮＡプローブをセッティングする位置は、標的とする一塩基変異多型部位がＰＮＡプローブのほぼ中央に相当するようにすればよい。
【００１８】
本発明で用いるプライマーは通常ＤＮＡである。
図３で“Ｌｏプライマー”と“Ｕｐプライマー”として例示するプライマーセットにおけるプライマーについて、その長さは１４〜２４塩基が適当であり、好ましくはそのＴｍ値がＰＮＡプローブのＴｍ値よりも低い方が望ましい。該プライマーセットによって増幅が意図される断片の長さは100〜1000塩基対の範囲が適当である。
ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマー（上記態様(1)及び(3)）或いはＰＮＡプローブと拮抗するアッパープライマー（上記態様(2)及び(4)）の配列は、標的とする配列の一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列であってもよいし、あるいは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列であってもよく、すなわち該一塩基変異多型部位を含まない部分配列の逆相補鎖配列であってもよい。ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマー又はアッパープライマーが、その標的とする配列の一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列であるとき、その標的とする配列の一塩基変異多型部位の３′側近傍の部分配列の逆相補鎖配列であることが好ましい。
ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマー或いはアッパープライマーをセッティングする位置は一般的に、ＰＮＡ配列と比べて１〜２０塩基ほど、標的とする配列の３′側へずれた範囲が望ましく、特にＰＮＡ配列と部分的に重複していることが好ましい。
図３では、ＰＮＡプローブと拮抗する“Ｌｏプライマー”（ロワープライマー）が、ＰＮＡ配列よりも多少、標的とする配列の３′側へずれてセットされている状態を表している。
なお、ALDH2のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を検出するために用いるＰＣＲクランピング用の配列の一例を、テンプレート配列とともに図４に示す。
【００１９】
図３で“Ｌｏプライマー２”と例示した、本発明で用いる更なるプライマーは、その長さが１４〜２４塩基が適当であり、“Ｌｏプライマー”（ロワープライマー）のＴｍ値と同程度のＴｍ値であることが望ましい。当該更なるプライマーをセッティングする位置は、後に用いる電気泳動法が識別することができるバンドの長さに応じて変動させることができるが、ＰＮＡプローブのセッティング位置から100〜1500塩基の範囲で離れていてもよく、好ましくは300〜1000塩基の範囲で離れているものである。
【００２０】
ＰＣＲクランピング法におけるＰＣＲ反応条件は、アニーリングステップが２工程からなり、先ず比較的高温でＰＮＡプローブのアニーリングステップ、次に比較的低温でＤＮＡプライマーのアニーリングステップを設ける他は、常法の条件に従って行うことができる。
使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に制限されず、Taq ＤＮＡポリメラーゼやExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一般に、突然変異の導入を防ぎ最終産物の収量を増加させるために、ExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用するのが好ましい。その他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能であって、例えば Pfu turbo（Stratagene製）などを使用することができる。
ＰＣＲ反応溶液の組成は常法に従うことができる。例えば、反応時 0.2〜0.3 mM デオキシヌクレオチド３リン酸、0.1〜10pmol/μl 各プライマー、0.5〜50pmol/μl ＰＮＡプローブ、0.1〜0.5unit/μl ExTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa社）、酵素に添付されているバッファー 1/10量程度である。
【００２１】
テンプレートＤＮＡとしては、例えば一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を有するプラスミドを用いることができ、該プラスミドは適当なものを選択することができ、市販のプラスミド調製キットを用いることが可能である。クローニングした大腸菌を増菌培養し、集菌後、溶菌操作によりプラスミドを含むＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてプラスミドＤＮＡを選択的に分離精製する。
ＰＣＲ産物をテンプレートとすることもでき、市販のＰＣＲ産物精製キットを用いることが可能である。ＰＣＲ反応液をバッファーで平衡化した逆相担体に保持させ、各溶出バッファーを用いてＰＣＲ産物を選択的に分離精製する。
また、ゲノムＤＮＡをテンプレートとすることもでき、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることが可能である。培養細胞、血液、口内膜、髪の毛、爪などからその組織や細胞を回収し細胞膜を溶解してＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてゲノムＤＮＡを選択的に分離精製する。
反応溶液におけるテンプレートＤＮＡ溶液は、1/20〜1/10量ほどが適当である。また、検体中におけるテンプレートＤＮＡ濃度はコピー数１０4以上が適当であり、少なくとも１０9程度まで問題ない。
【００２２】
ＰＣＲクランピング法におけるＰＣＲ反応の各ステップの反応時間、温度、サイクル数は適宜選択できる。変性ステップは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖へと変性させるのに十分な条件を適宜選択し実施すればよい。一般に変性ステップは９０〜９８℃ １０〜６０秒の範囲で実施され、さらに９２〜９６℃ ２０〜４０秒がより好ましい。
変性のステップに続くアニーリングステップは、ＰＮＡプローブアニーリングのため一般的に６０〜８０℃ ３０〜９０秒、より好ましくはＰＮＡプローブのＴｍ値−５℃で設定し、次にＤＮＡプライマーのアニーリングのため一般的に４５〜６０℃ ３０〜９０秒、より好ましくはそのＴｍ値付近の温度である。さらに伸長ステップは一般的に６８〜７２℃ ３０〜１２０秒である。サイクル数は一般に２５〜４０の範囲である。
図５に、ＰＣＲクランピング法の典型的な反応条件を図示する。
【００２３】
こうして増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動などで解析することができる。具体的には電気泳動後、適当な色素などでＤＮＡを染色し、ＵＶで写真撮影などを行うことができる。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例をもって、本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
〔参考例〕
アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）の一塩基変異多型の検出を従来のＰＣＲクランピング法で実施した。
ALDH2の一塩基変異多型部位（変異点）：114（Ｇ又はＡ）
ALDH2の該一塩基変異多型部位を含む部分的な配列は、図４の上部に示したとおりである。
材料の調製
以下のＤＮＡプライマーセット及びＰＮＡプローブを用意した。
［Ｇ型検出用プライマーセット（Ｇ）及びＰＮＡプローブ（Ａ）］
ロワープライマー 5′cagttttcac ttcagtgtat 3′(20mer）（配列番号１）
アッパープライマー 5′atctcttgaa ccccagatg 3′(19mer） (配列番号２）
ＰＮＡプローブ(Ａ) N′ttcactttag tgtatgc (17mer)
［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］
ロワープライマー 5′cagttttcac tttagtgtat 3′（20mer）(配列番号３）
アッパープライマー 5′atctcttgaa ccccagatg 3′(19mer） (配列番号４)
ＰＮＡプローブ(Ｇ) N′ttcacttcag tgtatgc (17mer)
これらのプライマーセットで増幅される断片の長さは317塩基対である。
【００２５】
テンプレートＤＮＡには、pGEM（登録商標）-T Easy Vector(3015bp)プラスミドを用いて、ALDH2のＧ型及びＡ型のそれぞれの配列をインサートしたものを用意した。ここで用いたpGEM-T Easy Vectorを図６に示し、及びＧ型及びＡ型の各々のインサート配列を図７及び図８に示す（配列番号５及び６参照）。図７及び８で四角で囲んだ箇所が一塩基変異多型部位である。
【００２６】
ＰＣＲ法の実施
以下のＰＣＲ条件を採用した。
なお、この反応系においてテンプレートが１０4コピー存在する。
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおりに行った。
９６℃ ２分→｛９６℃ ３０秒、７５℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分｝×４０サイクル→７２℃ ５分
ＰＣＲを行った後、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供した。その後、エチジウムブロマイドによりＤＮＡを染色してＵＶで写真撮影した。結果を図９に示す。図９中、用いたテンプレートＤＮＡ、プライマーセット、ＰＮＡプローブは上記説明に従ってＧ、Ａにて表した。
図９に示された結果より、ＰＮＡプローブがクランピング効果を発揮していることが判る。
【００２７】
次にＧ型テンプレートＤＮＡを用い、反応系におけるテンプレート量を１０3〜１０7コピー数で変動させた他は、上記と同様にＰＣＲ法を実施した。結果を図１０に表す。図１０の結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用いたとき、本来ならば317塩基対の増幅断片のバンドは観察されないはずであるが、テンプレート量が多くなってくるとその増幅断片のバンドが観察される。１０5コピー数ではバンドがわずかに観察され、１０6〜１０7コピー数でははっきりとバンドが認められる。
【００２８】
【実施例１】
本発明に従って、上記参考例で使用した［Ｇ型検出用プライマーセット（Ｇ）及びＰＮＡプローブ（Ａ）］及び［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］を用い、以下の、更なるロワープライマー（プライマー２）を添加して、Ｇ型テンプレートＤＮＡを用いテンプレート量を１０3〜１０8コピー数で変動させ、ＰＣＲクランピング法を実施した。
更なるロワープライマー（プライマー２）の配列：
5′aggcttaaaa tgggaaatta gtag 3′（24mer）（配列番号７）
使用したアッパープライマーとプライマー２によって増幅される断片の長さ（以下、産物長ともいう）は598塩基対である。
【００２９】
ＰＣＲサイクル条件及びその後の分析方法は上記参考例と同様である。
【００３０】
結果を図１１に示す。図１１に示された結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用いたときテンプレート量が多くなっても（１０5〜１０8コピー数）、317塩基対のバンドは発現しないことが明らかである。よって、テンプレート量が多いときでも、プライマー２を添加することによってＰＮＡプローブのクランピング効果を充分に発揮させることができる。
【００３１】
【実施例２】
実施例１と同じ操作を行い、但し、更なるロワープライマー（プライマー２）の濃度を変動させてＰＣＲクランピング法を実施した。なお、テンプレートとしては、Ｇ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用いた。
ＰＣＲサイクル条件及びその後の分析方法は上記参考例と同様である。
結果を図１２に示す。図１２の結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用いたとき、プライマー２の濃度が比較的高いと317塩基対のバンドが現われないが、プライマー２の濃度が低いと317塩基対のバンドが観察される傾向がある。このことから、テンプレート量に応じて、ＰＮＡプローブのクランピング効果が十分に発揮されるようにプライマー２の濃度を変動させることが望ましいと考えられる。
【００３２】
【実施例３】
実施例１と同様に操作を行い、但し、更なるロワープライマー（プライマー２）をセッティングする位置を変動させ種々のプライマー２を使用して、ＰＣＲクランピング法を実施した。なお、テンプレートとして、Ｇ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用いた。
用いた各種プライマー２▲１▼〜▲８▼の塩基配列と産物長を以下の表１にまとめる。
【００３３】
【表１】
【００３４】
ＰＣＲサイクル条件及びその後の分析方法は上記参考例と同様である。
結果を図１３に示す。図１３の結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用い、さらに各種プライマー２を用いることによって、317塩基対のバンドが発現せず、ＰＮＡプローブのクランピング効果を充分に発揮させることができることが判る。
【００３５】
【実施例４】
更なるロワープライマー（プライマー２）によるクランピング効果の向上の観察
Ｇ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用い、上記参照例で説明した［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］を用い、但し、そのロワープライマーをセッティングする位置を多少変動させた各種のロワープライマーを用い、及びプライマー２を不使用或いは使用してＰＣＲクランピング法を実施し、両者を比較した。なお、用いたプライマー２は実施例１で用いたのと同じである。
【００３６】
ＰＣＲサイクル条件及びその後の分析方法は上記参考例と同様である。
なお、使用したロワープライマーNo.１〜16の各塩基配列と、テンプレートの部分配列、ＰＮＡプローブとの位置関係を表２に表す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
上記ロワープライマーNo.１〜13、15及び16の配列をそれぞれ、配列番号１５〜２９とする。
結果を図１４に示す。図１４中、プライマー２不使用及び使用をそれぞれ、「プライマー２−」（上段）及び「プライマー２＋」（下段）と表す。ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマーの配列によって、ＰＣＲクランピング効果が異なるが、プライマー２を添加してＰＣＲクランピング法を行うことによって、317塩基対前後の断片のバンドは観察されず、クランピング効果が向上していることが判る。
【００３９】
【実施例５】
使用するPCR装置として機種Ａ〜Ｄの４種を用いて、テンプレートとしてＧ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用い、ＰＮＡプローブの使用の有無、更なるプライマー（プライマー２）の使用の有無により条件を変えて、ＰＣＲ法を行った。
使用したプライマーセット、プローブ、プライマー２は以下のとおりである。
［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］
ロワープライマー 5′cagttttcac tttagtgtat 3′（20mer）(配列番号３）
アッパープライマー 5′atctcttgaa ccccagatg 3′(19mer）(配列番号４)
ＰＮＡプローブ(Ｇ) N′ttcacttcag tgtatgc (17mer)
更なるロワープライマー（プライマー２）の配列：
5′aggcttaaaa tgggaaatta gtag 3′（24mer）（配列番号７）
【００４０】
ＰＣＲサイクル条件及びその後の分析方法は上記参考例と同様である。
【００４１】
結果を図１５に示す。図１５中、ＰＮＡプローブの使用及び不使用を＋、−で表し、プライマー２の使用及び不使用もまた＋、−で表す。機種Ｄの３レーンに見られるようにＰＣＲ装置の機種によってはＰＮＡプローブによるクランピング効果が充分でない（317塩基対のバンドがかすかに観察される）。しかしながら、プライマー２を添加してＰＣＲクランピング法を実施することによって、317塩基対のバンドが観察されず、クランピング効果が発揮される（機種Ｄの４レーン参照）。
【００４２】
【実施例６】
大腸菌遺伝子（大腸菌由来のβ-glucuronidaseの部分配列）における一塩基変異多型の検出をＰＣＲクランピング法により実施した。
大腸菌遺伝子の一塩基変異多型部位（変異点）：1558（野生型：Ｔ、変異型：Ｇ）
材料
以下のＤＮＡプライマーセット、ＰＮＡプローブ及び更なるアッパープライマー（プライマー２という）を準備した。
［変異型検出用プライマーセット］
アッパープライマー（1552）：5′aattgagcag cgttg 3′(15mer)（配列番号30）
ロワープライマー（2055）：5′agacgcgtgg ttac 3′(14mer)(配列番号31)
このプライマーセットで増幅される断片の長さは約500塩基対（ターゲットト増幅バンドサイズ約500bp)である。
ＰＮＡプローブ（1552）：5′aattgatcag cgttg 3′(15mer)
【００４３】
更なるアッパープライマー（プライマー２）
▲１▼1447：5′tcttaatgag gagt 3′（14mer）（配列番号３２）
▲２▼1363：5′tctcttccat gggt 3′（14mer）（配列番号３３）
▲３▼1294：5′ctatatcacg ctgt 3′（14mer）（配列番号３４）
▲４▼1224：5′tacgctcgaa cgaa 3′（14mer）（配列番号３５）
▲５▼1094：5′gggctggtga taac 3′（14mer）（配列番号３６）
▲６▼1062：5′taaccgcatc ctga 3′（14mer）（配列番号３７）
【００４４】
テンプレート：
野生型の１０10コピー/μlのＰＣＲ産物を１０1〜１０9倍希釈して、１０10〜１０1コピー/μlまで段階的に準備した。
テンプレート配列は以下のとおりである（配列番号３８参照）。
1021 gtcgtttgct cagggattac gcgcgatgat tggcggtatc ttaaccgcat cctga→ttctc
1081 tctctttttc ggcgggctgg tgataac→tgt gcccgcgttt catatcgtaa tttctctgtg
1141 caaaaattat ccttcccggc ttcggagaat tccccccaaa atattcactg tagccatatg
1201 tcatgagagt ttatcgttcc caatacgctc gaacgaa→cgt tcggttgctt attttatggc
1261 ttctgtcaac gctgttttaa agattaatgc gatctatatc acgctgt→ggg tattgcagtt
1321 tttggttttt tgatcgcggt gtcagttctt tttatttcca tttctcttcc atgggt→ttct
1381 cacagataac tgtgtgcaac acagaattgg ttaactaatc agattaaagg ttgaccagta
1441 ttattatctt aatgaggagt→cccttatgtt acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat
1501 caaaaaactc gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg g AATTGAT(g)CA
1561 GCGTTG→gtgg gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa
1621 cgatcagttc gccgatgcag atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga
1681 agtctttata ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac
1741 tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac
1801 gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt
1861 ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga
1921 aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg ggatccatcg
1981 cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca
2041 tgtcgcgcaa gact←gtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt
上記配列中、下線部分の上の６箇所は各プライマー２の配列に相当するところであり、最下段の下線部はロワープライマーがハイブリダイズする箇所である。さらに大文字部分はアッパープライマー及びＰＮＡプローブの配列に相当するところである。
上記の方法をイメージすると次のようになる。
【００４５】
【化３】
【００４６】
なお、上記イメージの中で、"Up"とはアッパープライマーを意味し、"Lo"とはロワープライマーを意味する。
ＰＣＲ温度条件は以下のとおりである。
９６℃ １分→｛９６℃ １分→５７℃ １分→４５℃ ３０秒→６７℃ １分｝×３０サイクル→４℃
ＰＣＲを行った後、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供した。その後、エチジウムブロマイドによりＤＮＡを染色してＵＶで写真撮影した。
【００４７】
上記の材料と方法により、以下の実験を行った。
［実験１］
テンプレートとして１０8コピー/μlを用い、プライマー２として▲１▼〜▲６▼を用い、また、プライマー２を用いないものをコントロールとして、ＰＣＲクランピング法を実施した。
その結果を図１６に示す。図１６の結果から、各種プライマー２を使用することで、500bpのバンドは観察されずクランピング効果が発揮されていることが判る。他方、コントロール（Cont.）ではＰＣＲクランピング効果が発揮されていないことが判る。
［実験２］
テンプレート濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲１▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図１７に示す。図１７の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
［実験３］
テンプレート濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲２▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図１８に示す。図１８の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
【００４８】
［実験４］
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲３▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図１９に示す。図１９の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
［実験５］
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲４▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図２０に示す。図２０の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
［実験６］
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲５▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図２１に示す。図２１の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
[実験７]
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲６▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図２２に示す。図２２の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
【００４９】
【発明の効果】
本発明のＰＣＲクランピング法によれば、たとえ検体中にテンプレートＤＮＡが比較的高濃度で存在したとしても、ＰＮＡプローブによるクランピング効果を充分に発揮させることができ、その結果、標的遺伝子ＤＮＡにおける一塩基変異多型の存在を、高感度でより正確な判定をもって検出することができる。
【００５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲクランピング法の原理を概略的に表す図である。
【図２】従来のＰＣＲクランピング法における、一般的なプライマーセットとＰＮＡプローブのデザインの一例を概略的に表す図である。
【図３】本発明のＰＣＲクランピング法におけるＰＮＡプローブ、プライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を概略的に表す図である。
【図４】 ALDH2のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を検出するために用いるＰＣＲクランピング法用の配列の一例を表す図である。
【図５】ＰＣＲクランピング法の典型的な反応条件を示す図である。
【図６】本発明の実施例でＰＣＲクランピング法のテンプレートに用いたベクター配列を表す図である。
【図７】本発明の実施例でＰＣＲクランピング法のテンプレートに用いた、ALDH2の一塩基変異多型Ｇ型のインサート配列である。
【図８】本発明の実施例でＰＣＲクランピング法のテンプレートに用いた、ALDH2の一塩基変異多型Ａ型のインサート配列である。
【図９】参考例において従来の典型的なＰＣＲクランピング法を実施し、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１０】参考例においてテンプレート量を変動させてＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１１】本発明に従ったＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１２】本発明に従ったＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１３】本発明に従ったＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１４】本発明に従って更なるプライマー（プライマー２）を用いることによる作用効果を表す写真である。
【図１５】ＰＣＲ装置として種々の機種を用いたときの、本発明に従って更なるプライマー（プライマー２）を用いることによる作用効果を表す写真である。
【図１６】実施例６の［実験１］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図１７】実施例６の［実験２］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図１８】実施例６の［実験３］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図１９】実施例６の［実験４］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図２０】実施例６の［実験５］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図２１】実施例６の［実験６］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図２２】実施例６の［実験７］の結果を表す電気泳動の写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型（single nucleotide polymorphisms: SNPs）を検出するためのＰＣＲクランピング法（PCR Clamping）に関し、より具体的には改良されたＰＣＲクランピング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、遺伝子における一塩基変異多型が注目され、一塩基変異多型の分析が、疾患遺伝子の探索、疾患や薬剤感受性と一塩基変異多型との関連などの研究に進み、さらには、テーラーメード医療を可能とすることが期待されている。
このような注目の中、遺伝子ＤＮＡの一塩基変異多型を検出する方法が種々検討され、提案されている。
ＰＣＲクランピング法は、ＰＮＡ（ペプチド核酸：PNAはPeptide Nucleic Acid又はPolyamide Nucleic Acidの略）をプローブとして用い、該ＰＮＡプローブをＰＣＲ法（Polymerase Chain Reaction）に組み合わせた方法である。PNA-directed PCR clampingとも称される。ＰＮＡ骨格構造は、一般的に N-（2-アミノエチル）-グリシン分子によってらせん構造を有し、塩基と骨格構造との立体的距離及び結合している各塩基間の距離は、ＤＮＡにおけるそれらと同じになるように設計されている。このことは、ＤＮＡが相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対し、ＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を形成するように、ＰＮＡも相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対し二重鎖を作ることを意味する。ＰＮＡ／ＤＮＡの結合はＤＮＡ／ＤＮＡの結合よりも強いことが、融解温度（Ｔｍ）の測定結果から明らかになっており、ＰＮＡのＴｍの高さ、結合力の強さを利用した応用が注目されている。
【０００３】
上記ＰＣＲクランピング法の応用の一つとして、一塩基変異多型分析が報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
これは、ＰＮＡが有する相補的なＤＮＡへの高い結合力の強さと、一塩基でも異なればミスマッチの結合を起こしにくい、すなわち高い特異性と、ＰＮＡがＤＮＡポリメラーゼにとってプライマーとして機能しないという性質を利用したもので、ＰＮＡがＰＣＲ反応の阻害剤となる。
ＰＣＲクランピング法による一塩基変異多型分析の概略的な一具体例では、ワイルドタイプＰＮＡプローブとミュータントタイプＤＮＡプライマーセットを用いて、ワイルドタイプＤＮＡとミュータントタイプＤＮＡが共存する検体をＰＣＲ法に供した場合、ワイルドタイプＰＮＡプローブとミュータントタイプＤＮＡプライマーセットの一方とが拮抗し、ワイルドタイプＰＮＡがワイルドタイプＤＮＡにハイブリダイズしてワイルドタイプＤＮＡ断片の増幅は阻害され、一方ミュータントタイプＤＮＡプライマーセットによってミュータントタイプＤＮＡ断片の増幅が進行し、結果的にミュータントタイプＤＮＡの増幅断片のバンドのみが電気泳動法にて確認されることが意図される。この具体例におけるメカニズムを図１に表す。
【０００４】
しかしながら、ＰＣＲクランピング法には以下の欠点がある：▲１▼ＰＣＲクランピング法の実験系デザインには汎用的かつ明確な規則がなく、研究者によって試行錯誤の結果、最適な実験系を作らねばならず、費用と時間を要する、▲２▼検体中における遺伝子の濃度が一定以上の高濃度になった場合に、ＰＮＡプローブによるクランピング効果が充分でなくなり、ＰＣＲクランピング法の原理に基づいて増幅がブロックされるはずのタイプのＤＮＡ断片が増幅されてしまう、という不都合が生じる。
特に上記▲２▼の問題点について、改良する手段が研究者に強く求められている。
【０００５】
【非特許文献１】
ヘンリック オーラム（Henrik Orum）著、「PCR CLAMPING」Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. 1999, p.193-200
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法の実施にあたり、ＰＮＡプローブによるクランピング効果を充分に発揮させ、高感度で判定をより正確に行うことができる方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、従来のＰＣＲクランピング法が、ＰＣＲ反応液中に一組のプライマーセット（アッパープライマーとロワープライマー）とＰＮＡプローブを添加して実施するのに対し、更なるプライマーを加えてＰＣＲ法を実施することにより、検体が高濃度の遺伝子を含有するときにもＰＮＡプローブによるクランピング効果を発揮させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明の方法によれば、ＰＮＡプローブによるクランピング効果が充分に発揮されることから、上記プライマーセットによって増幅されることが意図されるタイプの遺伝子断片が、検体中における当該タイプの遺伝子の存在又は非存在に応じて正確に、増幅する又は出現しないという結果をもって判定することができる。
【０００８】
本明細書中において一塩基変異多型とは、一塩基のみが変異している多型のほかに、一塩基変異が２ヶ所以上存在する、すなわち２塩基以上で数塩基までの変異による多型や、一塩基以上数塩基までの挿入や欠損による多型を包含する。従って本明細書中で一塩基変異多型部位とは、一塩基のみが変異している部位、一塩基変異が２ヶ所以上存在する部位、一塩基以上数塩基までの挿入や欠損がある部位を包含して意味する。
【０００９】
従って本発明は、次の態様のＰＣＲクランピング法に向けられている。
（１）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；該標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマー；及びミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
（２）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマー、及び該アッパープライマーとプライマーセットをなすロワープライマー；及びミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるアッパープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
【００１０】
（３）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子のミュータントタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマー；及びワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
（４）標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマー、及び該アッパープライマーとプライマーセットをなすロワープライマー；及びワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるアッパープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
【００１１】
本明細書中で、ワイルドタイプ型とミュータントタイプ型とは、標的遺伝子の一塩基変異多型が野生型と変異型とに分類できる場合には前者と後者をそれぞれ表し、標的遺伝子の一塩基変異多型が野生型と変異型とに分類して呼称できないときには、一塩基変異多型の一方と他方をそれぞれ表すものとする。
上記（１）の態様で説明すると、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブと、該標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマーとは拮抗するものである。上記の「該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列」とは、該一塩基変異多型部位を含まない部分配列であってもよい。上記の「該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列」は、ＰＮＡ配列よりも１〜２０塩基ほど、標的とする配列の３′側へずれた範囲へセッティングすることがより望ましく、特に、ＰＮＡ配列と部分的に重複している配列が好ましい。
上記（２）〜（４）の態様についても同様のことがいえる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
先ず、従来のＰＣＲクランピング法における、一般的なプライマーセットとＰＮＡプローブのデザインの一例を概略的に図２に示す。図２は、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を用いて示した。
本発明では、従来のＰＣＲクランピング法に、更なる追加のプライマーを用いてＰＣＲクランピング法を実施する。本発明のＰＣＲクランピング法におけるＰＮＡプローブ、プライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を、図３に概略的に示す。図３も、アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を用いて示したものである。図２及び図３で、ロワープライマーは“Ｌｏプライマー”と示され、アッパープライマーは“Ｕｐプライマー”と示される。図３で、本発明で更に用いるロワープライマーを“Ｌｏプライマー２”と示す。図３に本発明の上記態様（１）又は（３）を当てはめると、図３中の“Ｌｏプライマー２”は、「ミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマー」又は「ワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマー」である。
【００１３】
本発明を上記態様（１）の例で、図２及び図３を参照しながら以下に説明する。検体中にワイルドタイプ型の遺伝子が存在するとき、標的遺伝子のワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型相当部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブを使用すれば、本来であれば、ワイルドタイプ型の遺伝子が完全にブロックされる。よって、上記ＰＮＡプローブと拮抗するミュータントタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマーとのセット（図２及び図３の“Ｌｏプライマー”と“Ｕｐプライマー”とのプライマーセット）によって、ワイルドタイプ型の遺伝子断片が増幅されることはない。したがって、ＰＣＲの結果、図３で示した317塩基対（317bp）の断片が発生が確認されたとき、即、検体中にミュータントタイプ型遺伝子ＤＮＡが存在するという判定をすることができるのが理想である。
ところが、検体中にワイルドタイプ型の遺伝子が比較的多量に存在するとき、上記のプライマーセットによって実際、ワイルドタイプ型の遺伝子断片の増幅が起こる。これでは、検体中におけるミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在にかかわらず、上記プライマーセットによって増幅された長さの断片が現れることになり、図３で示した317bp断片の増幅が電気泳動によるバンドとして確認されたときに、それがワイルドタイプ型遺伝子に由来するものか又はミュータントタイプ型遺伝子によるものか、この結果からは判断できず、結局、検体中におけるミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在が判定できない。
【００１４】
本発明では、さらに追加のプライマー、すなわち図３で示す“Ｌｏプライマー２”を存在させることによって、ワイルドタイプ型遺伝子に由来する図３で示した317bpの断片の増幅を阻害することができることを見出した。そして、結果として317bpの断片の増幅の有無が、検体中におけるミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在の判定につながる。PCRの結果、ワイルドタイプ型遺伝子に由来する図３に例示する598bpの断片の増幅が起こったとしても、上記プライマーセットによる特定の長さの断片、すなわち317bpの増幅断片の有無によってミュータントタイプ型遺伝子の存在、不存在が判定できることは、たいへんに有利である。
本発明の上記態様（２）〜（４）でも同様のことがいえる。
本発明の方法を適用することができる標的遺伝子は、特に制限されるものではない。
【００１５】
次に、ＰＣＲクランピング法におけるＰＮＡプローブ及びプライマーについて説明する。
ＰＮＡとＤＮＡの構造比較は、以下に示すとおりである。ＰＮＡは、４種の各塩基が結合しているＰＮＡモノマーのオリゴマー又はポリマーである。すなわち、ＰＮＡモノマーは塩基とN-(2-アミノエチル)−グリシンという二つの部分からなり、これが一つのユニットとして繰り返されてＰＮＡとなる。そしてＰＮＡにおけるモノマーは、以下に示すように塩基に応じて４種類となる。
【００１６】
【化１】
本発明において使用するＰＮＡプローブは常法によって製造することができる。ＰＮＡの結合の強さはアンチパラレルの相補的塩基配列のセッティングで最大となる。従って、ＰＮＡプローブは標的とするＤＮＡ配列に対して、以下のようなアンチパラレルの相補的塩基配列をセッティングすることが好ましい。
【００１８】
本発明で用いるプライマーは通常ＤＮＡである。
図３で“Ｌｏプライマー”と“Ｕｐプライマー”として例示するプライマーセットにおけるプライマーについて、その長さは１４〜２４塩基が適当であり、好ましくはそのＴｍ値がＰＮＡプローブのＴｍ値よりも低い方が望ましい。該プライマーセットによって増幅が意図される断片の長さは100〜1000塩基対の範囲が適当である。
ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマー（上記態様(1)及び(3)）或いはＰＮＡプローブと拮抗するアッパープライマー（上記態様(2)及び(4)）の配列は、標的とする配列の一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列であってもよいし、あるいは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列であってもよく、すなわち該一塩基変異多型部位を含まない部分配列の逆相補鎖配列であってもよい。ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマー又はアッパープライマーが、その標的とする配列の一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列であるとき、その標的とする配列の一塩基変異多型部位の３′側近傍の部分配列の逆相補鎖配列であることが好ましい。
ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマー或いはアッパープライマーをセッティングする位置は一般的に、ＰＮＡ配列と比べて１〜２０塩基ほど、標的とする配列の３′側へずれた範囲が望ましく、特にＰＮＡ配列と部分的に重複していることが好ましい。
図３では、ＰＮＡプローブと拮抗する“Ｌｏプライマー”（ロワープライマー）が、ＰＮＡ配列よりも多少、標的とする配列の３′側へずれてセットされている状態を表している。
なお、ALDH2のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を検出するために用いるＰＣＲクランピング用の配列の一例を、テンプレート配列とともに図４に示す。
【００１９】
図３で“Ｌｏプライマー２”と例示した、本発明で用いる更なるプライマーは、その長さが１４〜２４塩基が適当であり、“Ｌｏプライマー”（ロワープライマー）のＴｍ値と同程度のＴｍ値であることが望ましい。当該更なるプライマーをセッティングする位置は、後に用いる電気泳動法が識別することができるバンドの長さに応じて変動させることができるが、ＰＮＡプローブのセッティング位置から100〜1500塩基の範囲で離れていてもよく、好ましくは300〜1000塩基の範囲で離れているものである。
【００２０】
ＰＣＲクランピング法におけるＰＣＲ反応条件は、アニーリングステップが２工程からなり、先ず比較的高温でＰＮＡプローブのアニーリングステップ、次に比較的低温でＤＮＡプライマーのアニーリングステップを設ける他は、常法の条件に従って行うことができる。
使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであれば特に制限されず、Taq ＤＮＡポリメラーゼやExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。一般に、突然変異の導入を防ぎ最終産物の収量を増加させるために、ExTaq ＤＮＡポリメラーゼを使用するのが好ましい。その他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することも可能であって、例えば Pfu turbo（Stratagene製）などを使用することができる。
ＰＣＲ反応溶液の組成は常法に従うことができる。例えば、反応時 0.2〜0.3 mM デオキシヌクレオチド３リン酸、0.1〜10pmol/μl 各プライマー、0.5〜50pmol/μl ＰＮＡプローブ、0.1〜0.5unit/μl ExTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa社）、酵素に添付されているバッファー 1/10量程度である。
【００２１】
テンプレートＤＮＡとしては、例えば一塩基変異多型部位を含むＤＮＡ配列を有するプラスミドを用いることができ、該プラスミドは適当なものを選択することができ、市販のプラスミド調製キットを用いることが可能である。クローニングした大腸菌を増菌培養し、集菌後、溶菌操作によりプラスミドを含むＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてプラスミドＤＮＡを選択的に分離精製する。
ＰＣＲ産物をテンプレートとすることもでき、市販のＰＣＲ産物精製キットを用いることが可能である。ＰＣＲ反応液をバッファーで平衡化した逆相担体に保持させ、各溶出バッファーを用いてＰＣＲ産物を選択的に分離精製する。
また、ゲノムＤＮＡをテンプレートとすることもでき、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることが可能である。培養細胞、血液、口内膜、髪の毛、爪などからその組織や細胞を回収し細胞膜を溶解してＤＮＡを抽出する。逆相担体にそのＤＮＡ抽出液を保持させ、各溶出バッファーを用いてゲノムＤＮＡを選択的に分離精製する。
反応溶液におけるテンプレートＤＮＡ溶液は、1/20〜1/10量ほどが適当である。また、検体中におけるテンプレートＤＮＡ濃度はコピー数１０4以上が適当であり、少なくとも１０9程度まで問題ない。
【００２２】
ＰＣＲクランピング法におけるＰＣＲ反応の各ステップの反応時間、温度、サイクル数は適宜選択できる。変性ステップは、２本鎖ＤＮＡを１本鎖へと変性させるのに十分な条件を適宜選択し実施すればよい。一般に変性ステップは９０〜９８℃ １０〜６０秒の範囲で実施され、さらに９２〜９６℃ ２０〜４０秒がより好ましい。
変性のステップに続くアニーリングステップは、ＰＮＡプローブアニーリングのため一般的に６０〜８０℃ ３０〜９０秒、より好ましくはＰＮＡプローブのＴｍ値−５℃で設定し、次にＤＮＡプライマーのアニーリングのため一般的に４５〜６０℃ ３０〜９０秒、より好ましくはそのＴｍ値付近の温度である。さらに伸長ステップは一般的に６８〜７２℃ ３０〜１２０秒である。サイクル数は一般に２５〜４０の範囲である。
図５に、ＰＣＲクランピング法の典型的な反応条件を図示する。
【００２３】
こうして増幅された断片は、アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動などで解析することができる。具体的には電気泳動後、適当な色素などでＤＮＡを染色し、ＵＶで写真撮影などを行うことができる。
【００２４】
【実施例】
以下に実施例をもって、本発明を詳細に説明する。本発明はこれらの記載に限定されるものではない。
〔参考例〕
アルデヒドデヒドロゲナーゼII（ALDH2）の一塩基変異多型の検出を従来のＰＣＲクランピング法で実施した。
ALDH2の一塩基変異多型部位（変異点）：114（Ｇ又はＡ）
ALDH2の該一塩基変異多型部位を含む部分的な配列は、図４の上部に示したとおりである。
材料の調製
以下のＤＮＡプライマーセット及びＰＮＡプローブを用意した。
［Ｇ型検出用プライマーセット（Ｇ）及びＰＮＡプローブ（Ａ）］
ロワープライマー 5′cagttttcac ttcagtgtat 3′(20mer）（配列番号１）
アッパープライマー 5′atctcttgaa ccccagatg 3′(19mer） (配列番号２）
ＰＮＡプローブ(Ａ) N′ttcactttag tgtatgc (17mer)
［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］
ロワープライマー 5′cagttttcac tttagtgtat 3′（20mer）(配列番号３）
アッパープライマー 5′atctcttgaa ccccagatg 3′(19mer） (配列番号４)
ＰＮＡプローブ(Ｇ) N′ttcacttcag tgtatgc (17mer)
これらのプライマーセットで増幅される断片の長さは317塩基対である。
【００２５】
テンプレートＤＮＡには、pGEM（登録商標）-T Easy Vector(3015bp)プラスミドを用いて、ALDH2のＧ型及びＡ型のそれぞれの配列をインサートしたものを用意した。ここで用いたpGEM-T Easy Vectorを図６に示し、及びＧ型及びＡ型の各々のインサート配列を図７及び図８に示す（配列番号５及び６参照）。図７及び８で四角で囲んだ箇所が一塩基変異多型部位である。
【００２６】
ＰＣＲ法の実施
以下のＰＣＲ条件を採用した。
ＰＣＲサイクル条件は以下のとおりに行った。
９６℃ ２分→｛９６℃ ３０秒、７５℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ １分｝×４０サイクル→７２℃ ５分
ＰＣＲを行った後、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供した。その後、エチジウムブロマイドによりＤＮＡを染色してＵＶで写真撮影した。結果を図９に示す。図９中、用いたテンプレートＤＮＡ、プライマーセット、ＰＮＡプローブは上記説明に従ってＧ、Ａにて表した。
図９に示された結果より、ＰＮＡプローブがクランピング効果を発揮していることが判る。
【００２７】
次にＧ型テンプレートＤＮＡを用い、反応系におけるテンプレート量を１０3〜１０7コピー数で変動させた他は、上記と同様にＰＣＲ法を実施した。結果を図１０に表す。図１０の結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用いたとき、本来ならば317塩基対の増幅断片のバンドは観察されないはずであるが、テンプレート量が多くなってくるとその増幅断片のバンドが観察される。１０5コピー数ではバンドがわずかに観察され、１０6〜１０7コピー数でははっきりとバンドが認められる。
【００２８】
【実施例１】
本発明に従って、上記参考例で使用した［Ｇ型検出用プライマーセット（Ｇ）及びＰＮＡプローブ（Ａ）］及び［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］を用い、以下の、更なるロワープライマー（プライマー２）を添加して、Ｇ型テンプレートＤＮＡを用いテンプレート量を１０3〜１０8コピー数で変動させ、ＰＣＲクランピング法を実施した。
更なるロワープライマー（プライマー２）の配列：
5′aggcttaaaa tgggaaatta gtag 3′（24mer）（配列番号７）
使用したアッパープライマーとプライマー２によって増幅される断片の長さ（以下、産物長ともいう）は598塩基対である。
【００２９】
【００３０】
結果を図１１に示す。図１１に示された結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用いたときテンプレート量が多くなっても（１０5〜１０8コピー数）、317塩基対のバンドは発現しないことが明らかである。よって、テンプレート量が多いときでも、プライマー２を添加することによってＰＮＡプローブのクランピング効果を充分に発揮させることができる。
【００３１】
【実施例２】
実施例１と同じ操作を行い、但し、更なるロワープライマー（プライマー２）の濃度を変動させてＰＣＲクランピング法を実施した。なお、テンプレートとしては、Ｇ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用いた。
結果を図１２に示す。図１２の結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用いたとき、プライマー２の濃度が比較的高いと317塩基対のバンドが現われないが、プライマー２の濃度が低いと317塩基対のバンドが観察される傾向がある。このことから、テンプレート量に応じて、ＰＮＡプローブのクランピング効果が十分に発揮されるようにプライマー２の濃度を変動させることが望ましいと考えられる。
【００３２】
【実施例３】
実施例１と同様に操作を行い、但し、更なるロワープライマー（プライマー２）をセッティングする位置を変動させ種々のプライマー２を使用して、ＰＣＲクランピング法を実施した。なお、テンプレートとして、Ｇ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用いた。
用いた各種プライマー２▲１▼〜▲８▼の塩基配列と産物長を以下の表１にまとめる。
【００３３】
【表１】
結果を図１３に示す。図１３の結果から、Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）を用い、さらに各種プライマー２を用いることによって、317塩基対のバンドが発現せず、ＰＮＡプローブのクランピング効果を充分に発揮させることができることが判る。
【００３５】
【実施例４】
更なるロワープライマー（プライマー２）によるクランピング効果の向上の観察
Ｇ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用い、上記参照例で説明した［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］を用い、但し、そのロワープライマーをセッティングする位置を多少変動させた各種のロワープライマーを用い、及びプライマー２を不使用或いは使用してＰＣＲクランピング法を実施し、両者を比較した。なお、用いたプライマー２は実施例１で用いたのと同じである。
【００３６】
なお、使用したロワープライマーNo.１〜16の各塩基配列と、テンプレートの部分配列、ＰＮＡプローブとの位置関係を表２に表す。
【００３７】
【表２】
上記ロワープライマーNo.１〜13、15及び16の配列をそれぞれ、配列番号１５〜２９とする。
結果を図１４に示す。図１４中、プライマー２不使用及び使用をそれぞれ、「プライマー２−」（上段）及び「プライマー２＋」（下段）と表す。ＰＮＡプローブと拮抗するロワープライマーの配列によって、ＰＣＲクランピング効果が異なるが、プライマー２を添加してＰＣＲクランピング法を行うことによって、317塩基対前後の断片のバンドは観察されず、クランピング効果が向上していることが判る。
【００３９】
【実施例５】
使用するPCR装置として機種Ａ〜Ｄの４種を用いて、テンプレートとしてＧ型テンプレートＤＮＡを１０7コピー数で用い、ＰＮＡプローブの使用の有無、更なるプライマー（プライマー２）の使用の有無により条件を変えて、ＰＣＲ法を行った。
使用したプライマーセット、プローブ、プライマー２は以下のとおりである。
［Ａ型検出用プライマーセット（Ａ）及びＰＮＡプローブ（Ｇ）］
ロワープライマー 5′cagttttcac tttagtgtat 3′（20mer）(配列番号３）
アッパープライマー 5′atctcttgaa ccccagatg 3′(19mer）(配列番号４)
ＰＮＡプローブ(Ｇ) N′ttcacttcag tgtatgc (17mer)
更なるロワープライマー（プライマー２）の配列：
5′aggcttaaaa tgggaaatta gtag 3′（24mer）（配列番号７）
【００４０】
【００４１】
結果を図１５に示す。図１５中、ＰＮＡプローブの使用及び不使用を＋、−で表し、プライマー２の使用及び不使用もまた＋、−で表す。機種Ｄの３レーンに見られるようにＰＣＲ装置の機種によってはＰＮＡプローブによるクランピング効果が充分でない（317塩基対のバンドがかすかに観察される）。しかしながら、プライマー２を添加してＰＣＲクランピング法を実施することによって、317塩基対のバンドが観察されず、クランピング効果が発揮される（機種Ｄの４レーン参照）。
【００４２】
【実施例６】
大腸菌遺伝子（大腸菌由来のβ-glucuronidaseの部分配列）における一塩基変異多型の検出をＰＣＲクランピング法により実施した。
大腸菌遺伝子の一塩基変異多型部位（変異点）：1558（野生型：Ｔ、変異型：Ｇ）
材料
以下のＤＮＡプライマーセット、ＰＮＡプローブ及び更なるアッパープライマー（プライマー２という）を準備した。
［変異型検出用プライマーセット］
アッパープライマー（1552）：5′aattgagcag cgttg 3′(15mer)（配列番号30）
ロワープライマー（2055）：5′agacgcgtgg ttac 3′(14mer)(配列番号31)
このプライマーセットで増幅される断片の長さは約500塩基対（ターゲットト増幅バンドサイズ約500bp)である。
ＰＮＡプローブ（1552）：5′aattgatcag cgttg 3′(15mer)
【００４３】
更なるアッパープライマー（プライマー２）
▲１▼1447：5′tcttaatgag gagt 3′（14mer）（配列番号３２）
▲２▼1363：5′tctcttccat gggt 3′（14mer）（配列番号３３）
▲３▼1294：5′ctatatcacg ctgt 3′（14mer）（配列番号３４）
▲４▼1224：5′tacgctcgaa cgaa 3′（14mer）（配列番号３５）
▲５▼1094：5′gggctggtga taac 3′（14mer）（配列番号３６）
▲６▼1062：5′taaccgcatc ctga 3′（14mer）（配列番号３７）
【００４４】
テンプレート：
野生型の１０10コピー/μlのＰＣＲ産物を１０1〜１０9倍希釈して、１０10〜１０1コピー/μlまで段階的に準備した。
テンプレート配列は以下のとおりである（配列番号３８参照）。
1021 gtcgtttgct cagggattac gcgcgatgat tggcggtatc ttaaccgcat cctga→ttctc
1081 tctctttttc ggcgggctgg tgataac→tgt gcccgcgttt catatcgtaa tttctctgtg
1141 caaaaattat ccttcccggc ttcggagaat tccccccaaa atattcactg tagccatatg
1201 tcatgagagt ttatcgttcc caatacgctc gaacgaa→cgt tcggttgctt attttatggc
1261 ttctgtcaac gctgttttaa agattaatgc gatctatatc acgctgt→ggg tattgcagtt
1321 tttggttttt tgatcgcggt gtcagttctt tttatttcca tttctcttcc atgggt→ttct
1381 cacagataac tgtgtgcaac acagaattgg ttaactaatc agattaaagg ttgaccagta
1441 ttattatctt aatgaggagt→cccttatgtt acgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat
1501 caaaaaactc gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg g AATTGAT(g)CA
1561 GCGTTG→gtgg gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa
1621 cgatcagttc gccgatgcag atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga
1681 agtctttata ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac
1741 tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac
1801 gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtatcaccgt
1861 ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga ttaccgacga
1921 aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg ggatccatcg
1981 cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca
2041 tgtcgcgcaa gact←gtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt
上記配列中、下線部分の上の６箇所は各プライマー２の配列に相当するところであり、最下段の下線部はロワープライマーがハイブリダイズする箇所である。さらに大文字部分はアッパープライマー及びＰＮＡプローブの配列に相当するところである。
上記の方法をイメージすると次のようになる。
【００４５】
【化３】
なお、上記イメージの中で、"Up"とはアッパープライマーを意味し、"Lo"とはロワープライマーを意味する。
９６℃ １分→｛９６℃ １分→５７℃ １分→４５℃ ３０秒→６７℃ １分｝×３０サイクル→４℃
ＰＣＲを行った後、反応液５μlを３％アガロースゲル電気泳動に供した。その後、エチジウムブロマイドによりＤＮＡを染色してＵＶで写真撮影した。
【００４７】
上記の材料と方法により、以下の実験を行った。
［実験１］
テンプレートとして１０8コピー/μlを用い、プライマー２として▲１▼〜▲６▼を用い、また、プライマー２を用いないものをコントロールとして、ＰＣＲクランピング法を実施した。
その結果を図１６に示す。図１６の結果から、各種プライマー２を使用することで、500bpのバンドは観察されずクランピング効果が発揮されていることが判る。他方、コントロール（Cont.）ではＰＣＲクランピング効果が発揮されていないことが判る。
［実験２］
テンプレート濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲１▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図１７に示す。図１７の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
［実験３］
テンプレート濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲２▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図１８に示す。図１８の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
【００４８】
［実験４］
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲３▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図１９に示す。図１９の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
［実験５］
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲４▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図２０に示す。図２０の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
［実験６］
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲５▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図２１に示す。図２１の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
[実験７]
テンプレートとして濃度を１０4〜１０9コピー/μlで変動させ、プライマー２として▲６▼を用いてＰＣＲクランピング法を実施した。結果を図２２に示す。図２２の結果からクランピング効果が発揮されていることが判る。
【００４９】
【発明の効果】
本発明のＰＣＲクランピング法によれば、たとえ検体中にテンプレートＤＮＡが比較的高濃度で存在したとしても、ＰＮＡプローブによるクランピング効果を充分に発揮させることができ、その結果、標的遺伝子ＤＮＡにおける一塩基変異多型の存在を、高感度でより正確な判定をもって検出することができる。
【００５０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲクランピング法の原理を概略的に表す図である。
【図２】従来のＰＣＲクランピング法における、一般的なプライマーセットとＰＮＡプローブのデザインの一例を概略的に表す図である。
【図３】本発明のＰＣＲクランピング法におけるＰＮＡプローブ、プライマーセット及び更なるプライマーのデザインの一例を概略的に表す図である。
【図４】 ALDH2のエクソン12にある一塩基変異多型（Ｇ又はＡ）を検出するために用いるＰＣＲクランピング法用の配列の一例を表す図である。
【図５】ＰＣＲクランピング法の典型的な反応条件を示す図である。
【図６】本発明の実施例でＰＣＲクランピング法のテンプレートに用いたベクター配列を表す図である。
【図７】本発明の実施例でＰＣＲクランピング法のテンプレートに用いた、ALDH2の一塩基変異多型Ｇ型のインサート配列である。
【図８】本発明の実施例でＰＣＲクランピング法のテンプレートに用いた、ALDH2の一塩基変異多型Ａ型のインサート配列である。
【図９】参考例において従来の典型的なＰＣＲクランピング法を実施し、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１０】参考例においてテンプレート量を変動させてＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１１】本発明に従ったＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１２】本発明に従ったＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１３】本発明に従ったＰＣＲクランピング法を実施した後、電気泳動により検出されたバンドを表す写真である。
【図１４】本発明に従って更なるプライマー（プライマー２）を用いることによる作用効果を表す写真である。
【図１５】ＰＣＲ装置として種々の機種を用いたときの、本発明に従って更なるプライマー（プライマー２）を用いることによる作用効果を表す写真である。
【図１６】実施例６の［実験１］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図１７】実施例６の［実験２］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図１８】実施例６の［実験３］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図１９】実施例６の［実験４］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図２０】実施例６の［実験５］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図２１】実施例６の［実験６］の結果を表す電気泳動の写真である。
【図２２】実施例６の［実験７］の結果を表す電気泳動の写真である。
Claims (4)
- 標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；該標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマー；及びミュータントタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
- 標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマー、及び該アッパープライマーとプライマーセットをなすロワープライマー；及びミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるアッパープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
- 標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子のミュータントタイプ型のセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するロワープライマー、及び該ロワープライマーとプライマーセットをなすアッパープライマー；及びワイルドタイプ型のセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるロワープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
- 標的遺伝子ＤＮＡにおいて一塩基変異多型の存在を検出するためのＰＣＲクランピング法であって、標的遺伝子ＤＮＡのミュータントタイプ型のアンチセンス鎖における一塩基変異多型部位を含む部分配列の逆相補鎖配列を有するＰＮＡプローブ；標的遺伝子ＤＮＡのワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む部分配列もしくは該一塩基変異多型部位の近傍の部分配列の逆相補鎖配列を有するアッパープライマー、及び該アッパープライマーとプライマーセットをなすロワープライマー；及びワイルドタイプ型のアンチセンス鎖における該一塩基変異多型部位を含む該部分配列の３′側にある部分配列の逆相補鎖配列を有する更なるアッパープライマーを使用することを特徴とする、ＰＣＲクランピング法。
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