WO2009098789A1 - Lamp法による甲殻類病原性ウイルスの検出方法及び検出試薬キット - Google Patents

Lamp法による甲殻類病原性ウイルスの検出方法及び検出試薬キット Download PDF

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WO2009098789A1
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lamp
primer
primer set
seq
amplification reaction
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PCT/JP2008/056021
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Inventor
Toshiaki Itami
Masahiro Sakai
Tomoya Kouno
Toru Mekata
Original Assignee
University Of Miyazaki
Kyushu Medical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a crustacean pathogenic virus by, for example, a circular isothermal amplification reaction (Loop) method, and a crustacean pathogenic virus for use in the detection method.
  • the present invention relates to a reagent kit.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing a calibration curve in quantitative YHV-LAMP. It is a characteristic view which shows the examination result of the reaction temperature in TSV-LAMP. It is an electrophoretic photograph regarding the specificity of TSV-LAMP.
  • FIG. 6 is a characteristic diagram showing a calibration curve in quantitative TSV-LAMP.
  • the primer set according to the present invention comprises a crustacean pathogenic virus in LAMP comprising a plurality of primers designed for a specific gene region of a crustacean pathogenic virus selected from the group consisting of WSDV, IHHNV, YHV and TSV It is a primer set for detection.
  • F3 primer (SEQ ID NO: 3) (corresponding to “external primer”) located outside FIP anneals to a complementary sequence (“F3c region”), and by the action of the strand displacement DNA polymerase, While extending the single-stranded DNA extended from the already synthesized FIP, it extends from F3 primer.
  • F3 primer has “F3 region” complementary to “F3c region” on WSDV genomic DNA. The single-stranded DNA from the peeled FIP forms a loop by self-annealing because the F1c F1c region on the FIP has a complementary F1 region on the extension. It will be.
  • B3 primer located outside the BIP anneals to the single-stranded DNA forming the loop, and the single-stranded DNA from the already synthesized BIP is converted by the action of the strand displacement DNA polymerase. While peeling, it extends from B3 primer.
  • B3 primer has a “B3 region” complementary to the “B3c region” on the WSDV genomic DNA.
  • each primer of the detection primer set in each LAMP of IHHNV, YHV and TSV described below is the name of a primer having the same position and function as each primer included in the above-mentioned WSDV detection primer set Named according to
  • IHHNV is a virus belonging to the genus Brevidensovirus belonging to the Parvoviridae family Densovirinae subfamily, and is a single-stranded DNA virus. Infection with IHHNV causes infectious subcutaneous hematopoietic necrosis.
  • a primer set for YHV detection in LAMP according to the present invention is FIP (SEQ ID NO: 11), BIP (SEQ ID NO: 12), F3 primer (SEQ ID NO: 13) and B3.
  • Contains primer SEQ ID NO: 14
  • the primer set for YHV detection includes loop primers LF primer (SEQ ID NO: 15) and LB primer (SEQ ID NO: 16), so that the amplification time in LAMP can be greatly shortened.
  • YHV is a virus belonging to the Roniviridae family Okavirus, a single-stranded RNA plus strand virus. Infection with YHV causes yellowhead disease.
  • TSV detection primer set in the LAMP according to the present invention (hereinafter referred to as “TSV detection primer set”) is FIP (SEQ ID NO: 17), BIP (SEQ ID NO: 18), F3 primer (SEQ ID NO: 19) and B3 primer ( SEQ ID NO: 20).
  • each primer of the primer set according to the present invention described above can be prepared by chemical synthesis, for example.
  • the primer set according to the present invention hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence indicated by the sequence number of each primer described above, and each primer function in LAMP Alternatively, a primer having can be included.
  • stringent conditions means, for example, when using probe DNA labeled with phosphorus 32, 5 ⁇ SSC (0.75M NaCl, 0.75M sodium citrate), 5 ⁇ Denhardt's reagent (0.1% Ficoll, 0.1% In a hybridization solution consisting of polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine serum albumin) and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), the temperature is 45 ° C. to 65 ° C., preferably 55 ° C.
  • the temperature is 45 ° C. to 55 ° C. in the cleaning solution composed of 2 ⁇ SSC and 0.1% SDS, more preferably the temperature is 45 ° C. to 55 ° C. in the cleaning solution composed of 0.1 ⁇ SSC and 0.1% SDS. It is.
  • the primer set according to the present invention can be provided as a reagent kit for detecting the above-mentioned crustacean pathogenic virus in LAMP alone or together with a reagent necessary for LAMP.
  • reagents necessary for LAMP include strand displacement DNA synthase, dNTP, buffer solution, distilled water, reverse transcriptase when the sample nucleic acid is RNA, and the like.
  • LAMP can be performed simultaneously with the preparation of cDNA by reverse transcriptase by adding reverse transcriptase to the sample when subjected to LAMP.
  • RNA extracted from the test object can be used as the sample nucleic acid.
  • nucleic acid for specimen examples include dNTP of 10 fg to 30 ⁇ g (preferably 0.1 to 1 ⁇ g), strand displacement type DNA synthase 0.5 to 15 U (unit) (preferably 6.0 to 10 U), and final concentration 1.0 to 10 mM (preferably 4.0 to 6.0 mM).
  • the reverse transcriptase is 1.0 to 10 U (preferably 4.0 to 6.0 U) per 25 ⁇ l of the sample.
  • an amplification product is produced by subjecting the prepared sample to LAMP.
  • LAMP conditions include a temperature of 60 ° C. to 65 ° C. (preferably 63 ° C. for WSDV, IHHNV and YHV, 60 ° C. for TSV) and 15 to 80 minutes (preferably 20 to 60 minutes).
  • the amplification product in the sample can be detected.
  • the amplification product can be detected visually by subjecting the sample to agarose gel / ethidium bromide electrophoresis.
  • an amplification product can be detected using turbidity as an index.
  • an amplification product can be detected by measuring the turbidity in real time using a real-time turbidity measuring apparatus. The presence or absence of the crustacean pathogenic virus infection described above can be determined based on the presence or absence of the amplification product thus detected.
  • a positive control sample for example, containing a plasmid containing the target sequence to be amplified
  • a real-time turbidity measuring device for example, a real-time turbidity measuring device (LA-200 manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) at various nucleic acid concentrations. )
  • LA-200 real-time turbidity measuring device manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.
  • a calibration curve is prepared by setting the turbidity of each obtained nucleic acid concentration sample as the vertical axis and the nucleic acid concentration as the horizontal axis.
  • the amplification product that is, the amount of virus
  • the crustacean pathogenic virus can be detected quantitatively and the degree of infection can be known.
  • the present invention can contribute to the prevention of the spread of crustacean pathogenic viruses and the prevention of diseases.
  • FIP TCCGTCTTCAGGGAATACATATGCTCAGGGAAGAAATAGACCATG
  • BIP GGACCCAAATCGAAATATAAGGCCTATGTTGCCCAAGATCCAC
  • F3 primer AAACACCGGATGGGCTAA
  • B3 primer CAAGGCAATACAGAATGCG
  • LF primer GTTAAGAATGATGCATCTAGTGCGA
  • LB primer TGGAACAAAAGATGCTGCTCA
  • LAMP followed the reagent protocol using a Loopamp DNA amplification reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.) as a reagent.
  • buffer / dNTP mixture (12.5 ⁇ l), FIP / BIP (40 pmol) (1.0 ⁇ l), F3 primer / B3 primer (5 pmol) (1.0 ⁇ l), LF primer / LB primer (20 pmol) (1.0 ⁇ l) ), BST DNA polymerase (1.0 ⁇ l), dH 2 O (3.5 ⁇ l) and template DNA (2 ⁇ l) were added, and the reaction solution was made 25 ⁇ l in total to a real-time turbidity measurement device (LA-200) at 60 ° C. The reaction was allowed to proceed at 63 ° C or 65 ° C for 60 minutes.
  • LA-200 real-time turbidity measurement device
  • WSDV-LAMP prepareds a reaction solution similar to the above, and the reaction solution is subjected to a thermal cycler (MyCycler) (BIO RAD) under the optimum conditions (63 ° C), then heated at 95 ° C for 2 minutes, and then reacted. It was done by stopping. Subsequently, the presence or absence of a ladder of each amplification product was confirmed by 2% agarose gel / ethidium bromide electrophoresis.
  • MyCycler MyCycler
  • the above F3 primer and B3 primer were used to construct a plasmid containing the target gene sequence in the WSDV-LAMP. Plasmid copy number was calculated based on the following method, to prepare a plasmid solution of 1 ⁇ 10 6 ⁇ 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l).
  • Copy number per ⁇ l plasmid concentration obtained by OD260 measurement (ng / ⁇ l) / plasmid molecular weight ⁇ 6.02 ⁇ 10 14 (copies / ⁇ l)
  • a reaction solution was prepared in the same manner as described above, and the reaction solution was subjected to a real-time turbidity measurement device, thereby preparing a calibration curve for quantitative WSDV-LAMP.
  • FIG. 5 shows the results of examining the reaction temperature in WSDV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (OD).
  • FIG. 6 is an electrophoresis photograph regarding the specificity of WSDV-LAMP.
  • Each lane is as follows. Marker: molecular weight marker, WSDV: sample containing DNA from WSDV-infected shrimp as template, IHHNV: sample containing DNA from IHHNV-infected shrimp as template, Healthy: sample containing DNA from healthy shrimp as template, Negative: negative control Sample (sample without template DNA)
  • WSDV molecular weight marker
  • IHHNV sample containing DNA from IHHNV-infected shrimp as template
  • Healthy sample containing DNA from healthy shrimp as template
  • Negative negative control Sample (sample without template DNA)
  • FIG. 6 as a result of examining the specificity of WSDV-LAMP, a positive reaction was confirmed only in DNA derived from WSDV-infected shrimp, and no reaction was observed in DNA derived from IHHNV-infected shrimp or healthy shrimp.
  • FIG. 7 shows a calibration curve for quantitative WSDV-LAMP.
  • FIG. 7 (A) shows the results of LAMP using each copy number of the plasmid containing the target gene sequence in WSDV-LAMP.
  • the horizontal axis represents the reaction time (minutes)
  • the vertical axis represents turbidity (O.D.).
  • FIG. 7 (B) shows a calibration curve of quantitative WSDV-LAMP prepared based on the result of FIG. 7 (A).
  • the horizontal axis indicates the copy number of the plasmid
  • the vertical axis indicates the threshold time (minutes).
  • a calibration curve for quantitative WSDV-LAMP was prepared by a real-time LAMP method using a plasmid solution of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l) as a template.
  • IHHNV-LAMP Detection of IHHNV by LAMP method.
  • Materials and Methods PrimerExplorer V4 was used to prepare a LAMP primer for base numbers 901 to 1110 (SEQ ID NO: 22) of IHHNV genomic DNA (GenBank accession number: AF218266).
  • the designed primers are the following primers (1) to (4).
  • a primer set consisting of the primers (1) to (4) was used.
  • FIP GAAAACTGGAACAGTTCTTCAGACAAATCAAGACCCTAAACCCAC
  • BIP ACGAGGAAGACAACTCTCAAACTGTTATCCACGCAGACCTTAG
  • F3 primer TCTCCAAGCCTTCTCACC (SEQ ID NO: 9)
  • B3 primer TCCCTCTCGAATTCCCAG (SEQ ID NO: 10)
  • LAMP followed the reagent protocol using a Loopamp DNA amplification reagent kit (Eiken Chemical Co., Ltd.) as a reagent. Specifically, buffer / dNTP mixture (12.5 ⁇ l), FIP / BIP (40 pmol) (1.0 ⁇ l), F3 primer / B3 primer (5 pmol) (1.0 ⁇ l), BST DNA polymerase (1.0 ⁇ l), dH 2 O (5.5 ⁇ l) and template DNA (2 ⁇ l) were added, and the reaction solution with a total of 25 ⁇ l was subjected to a real-time turbidity measurement apparatus (LA-200) and reacted at 60 ° C., 63 ° C. or 65 ° C. for 80 minutes.
  • LA-200 real-time turbidity measurement apparatus
  • IHHNV-LAMP using the above primer set was examined using DNA obtained from IHHNV-infected shrimp, WSDV-infected shrimp and healthy shrimp, respectively.
  • LAMP prepare a reaction solution similar to the above, use the reaction solution in a thermal cycler (MyCycler) (BIO RAD), react under optimal conditions (63 ° C), heat at 95 ° C for 2 minutes, and then react It was done by stopping. Subsequently, the presence or absence of a ladder of each amplification product was confirmed by 2% agarose gel / ethidium bromide electrophoresis.
  • a reaction solution was prepared in the same manner as described above, and the reaction solution was subjected to a real-time turbidity measurement device to prepare a calibration curve for quantitative IHHNV-LAMP.
  • FIG. 8 shows the examination results of the reaction temperature in IHHNV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (OD).
  • FIG. 10 shows a calibration curve for quantitative IHHNV-LAMP.
  • FIG. 10 (A) shows the result of LAMP using each copy number of the plasmid containing the target gene sequence in IHHNV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (O.D.).
  • FIG. 10 (B) shows a calibration curve of quantitative IHHNV-LAMP prepared based on the result of FIG. 10 (A).
  • the horizontal axis indicates the copy number of the plasmid
  • the vertical axis indicates the threshold time (minutes).
  • a calibration curve with high accuracy in quantitative IHHNV-LAMP was created by the real-time LAMP method using a plasmid solution of 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l) as a template.
  • YHV-LAMP Detection of YHV by LAMP method.
  • PrimerExplorer V4 produced LAMP primers for base numbers 1501-1750 (SEQ ID NO: 23) of the structural glycoprotein gene of YHV (GenBank accession number: AF540644).
  • the designed primers are the following primers (1) to (6).
  • a primer set comprising the primers (1) to (6) was used.
  • FIP GACGTGTGGATGCATAAATTTCATGTATCAAATTTTCCTTGAACCTGG (SEQ ID NO: 11)
  • BIP CGATTGCCGTTACAACATGATGTTGGAATGGTCTCATGAAGG
  • F3 primer TTCCGTAATGCCGGTGAT (SEQ ID NO: 13)
  • B3 primer AACGCTAGGAGTATAACCG (SEQ ID NO: 14)
  • LF primer AGGTATGTTCTACCGAGCCAG
  • LB primer TGGTATAAACCTCGGAGATGACG
  • RNA amplification reagent kit (RT-LAMP) (Eiken Chemical Co., Ltd.) (Eiken Chemical Co., Ltd.) was used as a reagent, and the protocol of the reagent was followed. Specifically, buffer / dNTP mixture (12.5 ⁇ l), FIP / BIP (40pmol) (1.0 ⁇ l), F3 primer / B3 primer (5pmol) (1.0 ⁇ l), LF primer / LB primer (20pmol) (1.0 ⁇ l) ), Enzyme Mix (mixture of BST DNA polymerase and AMV reverse transcriptase) (1.0 ⁇ l), dH 2 O (3.5 ⁇ l) and template RNA (2 ⁇ l). -200) and reacted at 60 ° C., 63 ° C. or 65 ° C. for 60 minutes.
  • R-LAMP Loopamp RNA amplification reagent kit
  • LAMP prepares a reaction solution similar to the above, and the reaction solution is subjected to a thermal cycler (MyCycler) (BIO RAD) under the optimum conditions (63 ° C), then heated at 95 ° C for 2 minutes, and then reacted. It was done by stopping. Subsequently, the presence or absence of a ladder of each amplification product was confirmed by 2% agarose gel / ethidium bromide electrophoresis.
  • a plasmid containing the target gene sequence in the YHV-LAMP was constructed using newly designed YHV560F (CTGTTGCCCATGATAGACATA: SEQ ID NO: 27) and B3 primer.
  • the copy number of the plasmid was calculated according to the method described in Example 1, and a plasmid solution of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l) was prepared.
  • reaction solution (but does not contain reverse transcriptase) in the same manner as above, and subject the reaction solution to a real-time turbidity measurement device, so that a calibration curve for quantitative YHV-LAMP Made.
  • FIG. 11 shows the results of examining the reaction temperature in YHV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (OD).
  • FIG. 12 is an electrophoresis photograph regarding the specificity of YHV-LAMP. Each lane is as follows. Marker: Molecular weight marker, YHV: Sample containing YHV-infected shrimp-derived RNA as template, TSV: Sample containing TSV-infected shrimp-derived RNA as template, Healthy: Sample containing healthy shrimp-derived RNA as template, Negative: Negative control Sample (sample without template RNA) As shown in FIG. 12, as a result of examining the specificity of YHV-LAMP, a positive reaction was confirmed only for YHV-infected shrimp-derived RNA, and no reaction was observed in TSV-infected shrimp-derived RNA or healthy shrimp-derived RNA.
  • FIG. 13 shows a calibration curve for quantitative YHV-LAMP.
  • FIG. 13A shows the results of LAMP using each copy number of the plasmid containing the target gene sequence in YHV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (O.D.).
  • FIG. 13 (B) shows a calibration curve of quantitative YHV-LAMP prepared based on the result of FIG. 13 (A).
  • the horizontal axis indicates the copy number of the plasmid
  • the vertical axis indicates the threshold time (minutes).
  • a calibration curve for quantitative YHV-LAMP was prepared by a real-time LAMP method using a plasmid solution of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l) as a template.
  • TSV-LAMP Detection of TSV by LAMP method.
  • TSV-LAMP LAMP primer for base numbers 471 to 700 (SEQ ID NO: 24) of TSV coat protein gene (GenBank accession number: AF277378).
  • the designed primers are the following primers (1) to (4).
  • a primer set consisting of the primers (1) to (4) was used.
  • FIP AGTTCATCTCAATGCCAGGAAATGAAGACATCAATTATTCGACGC (SEQ ID NO: 17)
  • BIP GCAGTCTGAAGCTCGAGCTATTGTTATTCACATTTCTGGGGTT
  • F3 primer TGGAATAAGATGAATGCTAAGC (SEQ ID NO: 19)
  • B3 primer GACTCAGAACGGAAAGCC (SEQ ID NO: 20)
  • RNA amplification reagent kit (RT-LAMP) (Eiken Chemical Co., Ltd.) (Eiken Chemical Co., Ltd.) was used as a reagent, and the protocol of the reagent was followed. Specifically, buffer / dNTP mixture (12.5 ⁇ l), FIP / BIP (40 pmol) (1.0 ⁇ l), F3 primer / B3 primer (5 pmol) (1.0 ⁇ l), Enzyme Mix (BST DNA polymerase and AMV reverse transcriptase (Mixture) (1.0 ⁇ l), dH 2 O (5.5 ⁇ l), and template RNA (2 ⁇ l) were added, and the reaction solution made up to a total of 25 ⁇ l was subjected to a real-time turbidity measurement device (LA-200). The reaction was carried out at 60 ° C. for 60 minutes.
  • TSV-LAMP using the above primer set was examined using RNA obtained from TSV-infected shrimp and YHV-infected shrimp and RNA obtained from healthy shrimp, respectively.
  • LAMP prepares a reaction solution similar to the above, and the reaction solution is subjected to a thermal cycler (MyCycler) (BIO RAD) and reacted under optimal conditions (60 ° C), then heated at 95 ° C for 2 minutes, and then reacted. It was done by stopping. Subsequently, the presence or absence of a ladder of each amplification product was confirmed by 2% agarose gel / ethidium bromide electrophoresis.
  • a plasmid containing the target gene sequence in TSV-LAMP was constructed using F3 primer and newly designed TSV1791R (TGGAGCACGCGTTACTGAAA: SEQ ID NO: 28).
  • the copy number of the plasmid was calculated according to the method described in Example 1, and a plasmid solution of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l) was prepared.
  • FIG. 14 shows the examination result of the reaction temperature in TSV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (OD).
  • FIG. 15 is an electrophoresis photograph regarding the specificity of TSV-LAMP.
  • Each lane is as follows. Marker: molecular weight marker, TSV: sample containing TSV-infected shrimp-derived RNA as template, YHV: sample containing YHV-infected shrimp-derived RNA as template, Healthy: sample containing healthy shrimp-derived RNA as template, Negative: negative control Sample (sample without template RNA)
  • a positive reaction was confirmed only for RNA derived from TSV-infected shrimp, and no reaction was observed in RNA derived from YHV-infected shrimp or RNA derived from healthy shrimp.
  • FIG. 16 shows a calibration curve for quantitative TSV-LAMP.
  • FIG. 16 (A) shows the results of LAMP using each copy number of the plasmid containing the target gene sequence in TSV-LAMP.
  • the horizontal axis indicates the reaction time (minutes), and the vertical axis indicates turbidity (O.D.).
  • FIG. 16 (B) shows a calibration curve of quantitative TSV-LAMP prepared based on the result of FIG. 16 (A).
  • the horizontal axis indicates the copy number of the plasmid
  • the vertical axis indicates the threshold time (minutes).
  • a calibration curve for quantitative TSV-LAMP was prepared by the real-time LAMP method using a plasmid solution of 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 (copies / ⁇ l) as a template.

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Abstract

　本発明は、LAMPに用いられる甲殻類病原性ウイルス検出用プライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルをLAMPに供する工程と、当該LAMPによって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程とを含む、LAMPにおける甲殻類病原性ウイルス検出方法並びに当該検出方法で使用する甲殻類病原性ウイルス検出用プライマーセット及び試薬キットに関する。

Description

LAMP法による甲殻類病原性ウイルスの検出方法及び検出試薬キット
　本発明は、例えば環状型等温増幅反応(Loop-Mediated Isothermal Amplification：以下、「LAMP」という)法による甲殻類病原性ウイルスの検出方法及び当該検出方法で使用するための甲殻類病原性ウイルス検出用試薬キットに関する。
　急性ウイルス血症原因ウイルス(White spot disease virus：以下、「WSDV」という)、伝染性皮下造血器壊死症ウイルス(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus：以下、「IHHNV」という)、イエローヘッド病原因ウイルス(Yellow head virus：以下、「YHV」という)及びタウラ症候群原因ウイルス(Taura syndrome virus：以下、「TSV」という)は、エビ等の甲殻類に強い病原性を有するウイルスである。特に、IHHNV、YHV及びTSVのそれぞれによって発症する疾病は、特定疾病に指定されている。
　海外からのこれらウイルスの伝播を防ぐべく、当該ウイルスに対する高感度で、且つ定量的な検出方法の開発が望まれている。
　一方、従来より遺伝子の検出には、遺伝子増幅方法であるPCRが用いられてきた。しかしながら、PCRは感度が低いといった問題があった。
　そこで、高感度な遺伝子増幅方法として、LAMP法が開発された(特許文献１及び２)。当該LAMP法は、特定の遺伝子領域を増幅するための複数のプライマー、鋳型DNA、鎖置換型DNA合成酵素、dNTP等を混合し、一定温度(65℃付近)で一定時間反応させ、反応液の濁度により増幅を検出する方法である。
　例えば、特許文献３には、LAMP法を用いたジフテリア毒素遺伝子検出方法及び当該検出方法に用いられるプライマーセットが開示されている。また、特許文献４には、LAMP法を用いた百日咳菌遺伝子検出方法及び当該検出方法に用いられるプライマーセットが開示されている。さらに、特許文献５には、LAMP法を用いたリステリア・モノサイトゲネス検出方法及び当該検出方法に用いられるプライマーセットが開示されている。
　そこで、本願発明者らは、LAMP法を用いてWSDV(非特許文献１)及びYHV(非特許文献２)を検出すべく、それぞれのウイルスの特定の遺伝子領域に特異的なLAMP用プライマーセットを設計し、検出を行った。しかしながら、これらLAMP用プライマーセットは、高感度で且つ定量的なウイルス検出に用いることができなかった。
特許第3313358号公報 特開2001-242169号公報 特開2007-228868号公報 特開2007-124970号公報 特開2005-95105号公報 Tomoya Konoら, 「Journal of Virological Methods」, 2004年, 第115巻, p.59-65 Tohru Mekataら, 「Journal of Virological Methods」, 2006年, 第135巻, p.151-156
　上述したように、甲殻類病原性ウイルスの高感度で、且つ定量的な検出方法の開発が望まれている。
　本発明は、上述した実情に鑑み、LAMP法による甲殻類病原性ウイルスの高感度で且つ定量的な検出方法及び当該検出方法で使用するための甲殻類病原性ウイルス検出用試薬キットを提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、WSDV、IHHNV、YHV及びTSVのそれぞれについて特定の遺伝子領域にLAMP用プライマーセットを設計し、当該プライマーセットをLAMPに用いることで、これら甲殻類病原性ウイルスを高感度で且つ定量的な検出を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、配列番号１～４に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、LAMPにおけるWSDV検出用プライマーセットに関する。当該プライマーセットは、配列番号５及び６に示される塩基配列を有する2つのプライマーをさらに含むことができる。
　また、本発明は、配列番号７～１０に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、LAMPにおけるIHHNV検出用プライマーセットに関する。
　さらに、本発明は、配列番号１１～１４に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、LAMPにおけるYHV検出用プライマーセットに関する。当該プライマーセットは、配列番号１５及び１６に示される塩基配列を有する2つのプライマーをさらに含むことができる。
　また、本発明は、配列番号１７～２０に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、LAMPにおけるTSV検出用プライマーセットに関する。
　上述した各プライマーセットは、各ウイルス検出用試薬キットとして提供することができる。
　さらに、本発明は、上述した各プライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルをLAMPに供し、LAMPによって増幅産物が産生されたか否かを検出することを含む、LAMPにおける各ウイルス検出方法に関する。当該検出は、定量的に行うことができる。
　本発明によれば、高感度で且つ定量的に甲殻類病原性ウイルスを検出することができる。また、本発明によれば、国内外のエビ等の甲殻類の輸入/輸出や漁業の現場において、簡便且つ迅速に甲殻類病原性ウイルスの感染の有無を検出することができる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-27938号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明に係るLAMPにおけるWSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのWSDVゲノムDNAに対するアニーリング位置を示す模式図である。 本発明に係るLAMPにおけるIHHNV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのIHHNVゲノムDNAに対するアニーリング位置を示す模式図である。 本発明に係るLAMPにおけるYHV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのYHV構造糖タンパク質遺伝子に対するアニーリング位置を示す模式図である。 本発明に係るLAMPにおけるTSV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのTSV外被タンパク質遺伝子に対するアニーリング位置を示す模式図である。 WSDV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す特性図である。 WSDV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。 定量WSDV-LAMPにおける検量線を示す特性図である。 IHHNV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す特性図である。 IHHNV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。 定量IHHNV-LAMPにおける検量線を示す特性図である。 YHV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す特性図である。 YHV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。 定量YHV-LAMPにおける検量線を示す特性図である。 TSV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す特性図である。 TSV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。 定量TSV-LAMPにおける検量線を示す特性図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明に係るプライマーセットは、WSDV、IHHNV、YHV及びTSVから成る群より選択される甲殻類病原性ウイルスの特定の遺伝子領域に対して設計した複数のプライマーを含む、LAMPにおける甲殻類病原性ウイルス検出用プライマーセットである。
　本発明に係るLAMPにおけるWSDV検出用プライマーセット(以下、「WSDV検出用プライマーセット」という)は、FIP(配列番号１)、BIP(配列番号２)、F3 primer(配列番号３)及びB3 primer(配列番号４)を含む。さらに、当該WSDV検出用プライマーセットは、ループプライマー(Loop Primer)と呼ばれるLF primer(配列番号５)及びLB primer(配列番号６)を含むことで、LAMPにおいて増幅時間を大幅に短縮することができる。
　WSDVは、Nimaviridae科Whispovirus属に属するウイルスであり、二本鎖DNAウイルスである。WSDVに感染すると、急性ウイルス血症を発症することとなる。
　本発明では、プライマー設計支援ソフトPrimerExplorer V4(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)を用いて、WSDVゲノムDNA(GenBank accession number: AF369029)上の塩基番号55000～55279(配列番号２１)に対してLAMP用のプライマーを設計することで、WSDV検出用プライマーセットを得た。
　図１には、WSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのWSDVゲノムDNAに対するアニーリング位置を示す。図１を用いて、WSDVの検出を一例として、LAMPの原理を説明する。なお、LAMPの原理は、特許文献１及び栄研化学株式会社のホームページ(http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/index.html)に詳細に説明されている。
　ここで、「内部(内側)」、「外部(外側)」とは、WSDVゲノムDNA上の塩基番号55000～55279の増幅標的配列の中心に対する位置を意味する。
　図１に示すように、LAMPでは、先ず検体用核酸であるWSDVゲノムDNAに対して、FIP(配列番号１)(「内部プライマー」に相当する)がアニーリングし、そこから鎖置換型DNAポリメラーゼの作用により伸長する。ここで、FIPは、WSDVゲノムDNA上の「F2c領域」に相補的な「F2領域」を3'末端側に有し、且つ5'末端側にWSDVゲノムDNA上の「F1c領域」と同一の領域を有する。また、鎖置換型DNAポリメラーゼとは、伸長方向に二本鎖領域が存在する場合に、当該二本鎖を解離しながら、相補鎖合成を行うことができるDNA合成酵素を意味する。
　次いで、FIPの外側に位置するF3 primer(配列番号３)(「外部プライマー」に相当する)が相補的な配列(「F3c領域」)に対してアニーリングし、鎖置換型DNAポリメラーゼの作用により、既に合成されたFIPから伸長した一本鎖DNAを剥がす一方で、F3 primerより伸長する。F3 primerは、WSDVゲノムDNA上の「F3c領域」に相補的な「F3領域」を有する。剥がされたFIPからの一本鎖DNAは、FIPが有する5'末端側の「F1c領域」と伸長部分の「F1領域」とが相補的であることから、自己アニーリングすることでループを形成することとなる。
　当該ループを形成した一本鎖DNAに、もう一方の内部プライマーであるBIP(配列番号２)がアニリーングし、そこから鎖置換型DNAポリメラーゼの作用により伸長する。BIPは、WSDVゲノムDNA上の「B2c領域」に相補的な「B2領域」を3'末端側に有し、且つ5'末端側にWSDVゲノムDNA上の「B1c領域」と同一の領域を有する。
　さらに、BIPの外側に位置するB3 primer(配列番号４)が当該ループを形成した一本鎖DNAにアニーリングし、鎖置換型DNAポリメラーゼの作用により、既に合成されたBIPからの一本鎖DNAを剥がす一方で、B3 primerより伸長する。B3 primerは、WSDVゲノムDNA上の「B3c領域」に相補的な「B3領域」を有する。剥がされたBIPから伸長した一本鎖DNAは、両端でそれぞれ相補的な配列を有するので(すなわち、3'末端側における「F1c領域」と「F1領域」及び5'末端側における「B1領域」と「B1c領域」)、それぞれが自己アニーリングすることでループを形成することとなる。すなわち、当該剥がされたBIPから伸長した一本鎖DNAは、両端にループを形成することでダンベル型構造となる。このダンベル型構造が、LAMPにおける増幅サイクルの起点構造となる。当該ダンベル型構造を起点として、一連のLAMP増幅サイクルが行われる。
　さらに、ループプライマーLF primer(配列番号５：図１において「Loop Primer F」)及びLB primer(配列番号６：図１において「Loop Primer B」)をプライマーセットに含むことで、DNA合成の起点を増やすことができる。当該ループプライマーは、上述のダンベル型構造の5'末端側のループの一本鎖部分に相補的な配列を有するものである。LF primerは、WSDVゲノムDNA上の「F1領域」と「F2領域」との間の「FL領域」に相補的な「FLc領域」を有する。一方、LB primerは、WSDVゲノムDNA上の「B1領域」と「B2領域」との間の「BLc領域」に相補的な「BL領域」を有する。
　なお、以下で説明するIHHNV、YHV及びTSVのそれぞれのLAMPにおける検出用プライマーセットの各プライマーの名称は、上述のWSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーと同様の位置及び機能を有するプライマーの名称に準じて称する。
　一方、本発明に係るLAMPにおけるIHHNV検出用プライマーセット(以下、「IHHNV検出用プライマーセット」という)は、FIP(配列番号７)、BIP(配列番号８)、F3 primer(配列番号９)及びB3 primer(配列番号１０)を含む。
　IHHNVは、Parvoviridae科Densovirinae亜科Brevidensovirus属に属するウイルスであり、一本鎖DNAウイルスである。IHHNVに感染すると、伝染性皮下造血器壊死症を発症することとなる。
　上記と同様に、プライマー設計支援ソフトPrimerExplorer V4を用いて、IHHNVゲノムDNA(GenBank accession number: AF218266)上の塩基番号901～1110(配列番号２２)に対してLAMP用のプライマーを設計することで、IHHNV検出用プライマーセットを得た。
　図２には、IHHNV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのIHHNVゲノムDNAに対するアニーリング位置を示す。
　また、本発明に係るLAMPにおけるYHV検出用プライマーセット(以下、「YHV検出用プライマーセット」という)は、FIP(配列番号１１)、BIP(配列番号１２)、F3 primer(配列番号１３)及びB3 primer(配列番号１４)を含む。さらに、当該YHV検出用プライマーセットは、ループプライマーであるLF primer(配列番号１５)及びLB primer(配列番号１６)を含むことで、LAMPにおいて増幅時間を大幅に短縮することができる。
　YHVは、Roniviridae科Okavirus属に属するウイルスであり、一本鎖RNAプラス鎖ウイルスである。YHVに感染すると、イエローヘッド病を発症することとなる。
　上記と同様に、プライマー設計支援ソフトPrimerExplorer V4を用いて、YHVの構造糖タンパク質遺伝子(GenBank accession number: AF540644)の塩基番号1501～1750(配列番号２３)に対してLAMP用のプライマーを設計することで、YHV検出用プライマーセットを得た。
　図３には、YHV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのYHV構造糖タンパク質遺伝子に対するアニーリング位置を示す。
　本発明に係るLAMPにおけるTSV検出用プライマーセット(以下、「TSV検出用プライマーセット」という)は、FIP(配列番号１７)、BIP(配列番号１８)、F3 primer(配列番号１９)及びB3 primer(配列番号２０)を含む。
　TSVは、Dicistroviridae科に属するウイルスであり、一本鎖RNAプラス鎖ウイルスである。TSVに感染すると、タウラ症候群を発症することとなる。
　上記と同様に、プライマー設計支援ソフトPrimerExplorer V4を用いて、TSVの外被タンパク質遺伝子(GenBank accession number: AF277378)の塩基番号471～700(配列番号２４)に対してLAMP用のプライマーを設計することで、TSV検出用プライマーセットを得た。
　図４には、TSV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのTSV外被タンパク質遺伝子に対するアニーリング位置を示す。
　なお、以上に説明した本発明に係るプライマーセットの各プライマーは、例えば化学合成により作製することができる。
　本発明に係るプライマーセットには、上述した各プライマーの配列番号で示される塩基配列において1又は数個(例えば、1～10個、好ましくは1～5個、特に好ましくは1～3個)の塩基が欠失、置換及び/又は付加した塩基配列を有し、且つLAMPにおけるそれぞれのプライマー機能を有するプライマーを代替的に含むことができる。また、本発明に係るプライマーセットには、上述した各プライマーの配列番号で示される塩基配列と、例えば、70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の配列同一性を有する塩基配列から成り、且つLAMPにおけるそれぞれのプライマー機能を有するプライマーを代替的に含むことができる。さらに、本発明に係るプライマーセットには、上述した各プライマーの配列番号で示される塩基配列と相補的な塩基配列から成るDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つLAMPにおけるそれぞれのプライマー機能を有するプライマーを代替的に含むことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えばリン32で標識したプローブDNAを用いる場合には、5x SSC(0.75M NaCl、0.75M クエン酸ナトリウム)、5x デンハルト試薬(0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％ウシ血清アルブミン）及び0.1％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)から成るハイブリダイゼーション溶液中で、温度が45℃～65℃、好ましくは55℃～65℃である。また、洗浄ステップにおいては、2x SSC及び0.1％SDSから成る洗浄液中で温度が45℃～55℃、より好ましくは、0.1x SSC及び0.1％SDSから成る洗浄溶液中で温度が45℃～55℃である。
　また、本発明に係るプライマーセットは、単独で、又はLAMPで必要な試薬と共に、LAMPにおける上述の甲殻類病原性ウイルス検出用試薬キットとして提供することができる。LAMPで必要な試薬としては、例えば、鎖置換型DNA合成酵素、dNTP、緩衝液、蒸留水、検体用核酸がRNAである場合の逆転写酵素等が挙げられる。
　一方、本発明に係る方法では、本発明に係るプライマーセットを用いてLAMPを行う。本発明に係る方法では、先ず検体用核酸を準備する。検体用核酸は、例えば、上述の甲殻類病原性ウイルスに感染しているか否かを検査すべき甲殻類、又は当該甲殻類病原性ウイルスに感染しているが、感染の程度を確認すべき甲殻類から得られる核酸である。ここで、検体用核酸が由来するエビ類としては、上述した甲殻類病原性ウイルスに感染するものであればいずれの種類であってよく、例えば、クルマエビ、ウシエビ、バナメイエビ、コウライエビ、シバエビ等が挙げられる。また、例えば、カニ類、ザリガニ類、動物性プランクトン等のエビ類以外の甲殻類及びそれらの幼生も上述した甲殻類病原性ウイルスに感染するので、これら甲殻類から得た核酸も検体用核酸とすることができる。
　検体用核酸は、例えば、検査対象である甲殻類から常法により抽出されたゲノムDNA等のDNAとすることができる。あるいは、YHV及びTSVは一本鎖RNAプラス鎖ウイルスである。従って、検査対象より抽出したRNAを逆転写酵素を用いたRT-PCRに供する。このようにして得られたcDNAを検体用核酸とすることができる。
　また、LAMPに供する際に、逆転写酵素をサンプルに添加することで、逆転写酵素によるcDNAの作製と同時にLAMPを行うことができる。この場合には、検査対象より抽出したRNAを検体用核酸とすることができる。
　次いで、本発明に係る方法では、本発明に係るプライマーセット、検体用核酸、鎖置換型DNA合成酵素及びdNTP(並びに検体用核酸がRNAである場合には、逆転写酵素)を含有するサンプルを準備する。鎖置換型DNA合成酵素としては、例えば、BST DNA polymerase(栄研化学株式会社)、Bst DNA Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs)、Bca BEST DNA Polymerase (TaKaRa)等が挙げられる。また、サンプル中のこれら構成成分の組成は適宜決定することができるが、例えば、サンプル25μl当たり、本発明に係るプライマーセットに含まれる各プライマー1.0～50pmol(好ましくは5～40pmol)、検体用核酸10fg～30μg(好ましくは0.1～1μg)、鎖置換型DNA合成酵素0.5～15U(ユニット)(好ましくは6.0～10U)、最終濃度1.0～10mM(好ましくは4.0～6.0mM)のdNTPが挙げられる。また、逆転写酵素がサンプルに含まれる場合には、例えばサンプル25μl当たり逆転写酵素1.0～10U(好ましくは4.0～6.0U)とする。
　さらに、本発明に係る方法では、準備したサンプルをLAMPに供することで、増幅産物を産生する。LAMPの条件としては、例えば、温度60℃～65℃(好ましくはWSDV、IHHNV及びYHVについては63℃、TSVについては60℃)で15～80分(好ましくは20～60分)が挙げられる。
　LAMP後のサンプルを各検出手段に供することで、サンプル中の増幅産物を検出することできる。例えば、サンプルをアガロースゲル/エチジウムブロマイド電気泳動に供することにより、目視により増幅産物を検出することができる。また、サンプルを濁度計に供することで、濁度を指標として増幅産物を検出することができる。さらに、サンプルをLAMPに供する際にリアルタイム濁度測定装置を用いて、リアルタイムで濁度を測定することで、増幅産物を検出することができる。このように検出した増幅産物の有無により、上述した甲殻類病原性ウイルス感染の有無を判断することができる。
　また、陽性対照サンプル(例えば、増幅対象の標的配列を含むプラスミドを含む)を、様々な核酸濃度でリアルタイム濁度測定装置(例えば、栄研化学株式会社製のリアルタイム濁度測定装置（LA-200）)を用いたLAMPに供する。得られた各核酸濃度サンプルの濁度を縦軸とし、当該核酸濃度を横軸とすることで、検量線を作成する。次いで、当該検量線に対して、LAMP後の検体用核酸を含むサンプルの濁度を比較することで、定量的に増幅産物(すなわち、ウイルス量)を検出することができる。
　以上に説明した本発明によれば、高感度で甲殻類病原性ウイルスを検出することができる。また、本発明ではLAMPを用いることで、増幅ステップが一定温度で一定時間であるので、変性、アニーリング及び増幅の段階のサイクルを行うPCRと比較して簡便である。
　さらに、本発明によれば、定量的に甲殻類病原性ウイルスを検出でき、感染の程度を知ることができる。このことによって、上述した甲殻類病原性ウイルスの蔓延防止や病気の予防に本発明は貢献することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕LAMP法によるWSDVの検出(以下、「WSDV-LAMP」という)
１．材料及び方法
　PrimerExplorer V4(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)により、WSDVのゲノムDNA(GenBank accession number: AF369029)の塩基番号55000～55279(配列番号２１)に対するLAMP用プライマーを作製した。設計したプライマーは以下の(1)～(6)のプライマーである。以下で説明するLAMPでは、当該(1)～(6)のプライマーから成るプライマーセットを使用した。
(1) FIP：TCCGTCTTCAGGGAATACATATGCTCAGGGAAGAAATAGACCATG(配列番号１)
(2) BIP：GGACCCAAATCGAAATATAAGGCCTATGTTGCCCAAGATCCAC(配列番号２)
(3) F3 primer：AAACACCGGATGGGCTAA(配列番号３)
(4) B3 primer：CAAGGCAATACAGAATGCG(配列番号４)
(5) LF primer：GTTAAGAATGATGCATCTAGTGCGA(配列番号５)
(6) LB primer：TGGAACAAAAGATGCTGCTCA(配列番号６)
　次いで、WSDV感染エビよりDNAを抽出し、得られたDNAを鋳型とし、且つ上記プライマーセットを用いたWSDV-LAMPにおける最適反応温度の検討を行った。LAMPは、試薬としてLoopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学株式会社)を用いて、当該試薬のプロトコールに従った。具体的には、緩衝液・dNTP混液(12.5μl）、FIP/BIP(40pmol)(1.0μl)、F3 primer/B3 primer（5pmol)（1.0μl）、LF primer/LB primer(20pmol)(1.0μl）、BST DNA polymerase(1.0μl)、dH2O(3.5μl)及び鋳型DNA(2μl)を加え、計25 μlとした反応液をリアルタイム濁度測定装置（LA-200）に供し、60℃、63℃又は65℃で60分間反応させた。
　また、WSDV感染エビ、IHHNV感染エビ及び健常エビからそれぞれ得たDNAを用いて、上記プライマーセットを用いたWSDV-LAMPの特異性について検討した。LAMPは、上記と同様の反応液を作製し、当該反応液をサーマルサイクラー(MyCycler)(BIO RAD)に供し最適条件(63℃)下で反応した後、95℃で2分間加熱し、その後反応を停止させることで行った。次いで、2％アガロースゲル/エチジウムブロマイド電気泳動により各増幅産物のラダーの有無を確認した。
　さらに、定量LAMPのスタンダード系列作製のために、上記のF3 primer及びB3 primerを用い、上記WSDV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの構築を行った。プラスミドのコピー数を、以下の方法に基づき算出し、1×106～1×1010(copies/μl）のプラスミド溶液を作製した。
　1μl当たりのコピー数＝OD260測定で得られたプラスミド濃度(ng/μl)/プラスミド分子量×6.02×1014(copies/μl）
　得られたプラスミド溶液を鋳型とし、上記と同様に反応液を作製し、当該反応液をリアルタイム濁度測定装置に供することで、定量WSDV-LAMPにおける検量線の作成を行った。
２．結果
　図５は、WSDV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す。図５において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。
　図５に示すように、最適な反応温度を検討した結果、63℃において約20分間の反応で最も迅速な反応が確認された。
　図６は、WSDV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。各レーンは、以下の通りである。Marker：分子量マーカー、WSDV：WSDV感染エビ由来DNAを鋳型として含有するサンプル、IHHNV：IHHNV感染エビ由来DNAを鋳型として含有するサンプル、Healthy: 健常エビ由来DNAを鋳型として含有するサンプル、Negative：陰性対照サンプル(鋳型DNAを含有しないサンプル)
　図６に示すように、WSDV-LAMPの特異性について検討した結果、WSDV感染エビ由来のDNAにのみ陽性反応が確認され、IHHNV感染エビ又は健常エビ由来のDNAにおいて反応は認められなかった。
　図７は、定量WSDV-LAMPにおける検量線を示す。図７(A)は、上記WSDV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの各コピー数を用いたLAMPの結果を示す。図７(A)において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。一方、図７(B)は、図７(A)の結果に基づいて作成した定量WSDV-LAMPの検量線を示す。図７(B)において、横軸は上記プラスミドのコピー数を示し、縦軸は閾値時間(分)を示す。
　図７に示すように、1×106～1×1010(copies/μl）のプラスミド溶液を鋳型としたリアルタイムLAMP法により、定量WSDV-LAMPにおける検量線が作成された。
〔実施例２〕LAMP法によるIHHNVの検出(以下、「IHHNV-LAMP」という）
１．材料及び方法
　PrimerExplorer V4により、IHHNVのゲノムDNA(GenBank accession number: AF218266）の塩基番号901～1110(配列番号２２)に対するLAMP用プライマーを作製した。設計したプライマーは以下のの(1)～(4)のプライマーである。以下で説明するLAMPでは、当該(1)～(4)のプライマーから成るプライマーセットを使用した。
(1) FIP：GAAAACTGGAACAGTTCTTCAGACAAATCAAGACCCTAAACCCAC(配列番号７)
(2) BIP：ACGAGGAAGACAACTCTCAAACTGTTATCCACGCAGACCTTAG(配列番号８)
(3) F3 primer：TCTCCAAGCCTTCTCACC(配列番号９)
(4) B3 primer：TCCCTCTCGAATTCCCAG(配列番号１０)
　次いで、IHHNV感染エビよりDNAを抽出し、得られたDNAを鋳型とし、且つ上記プライマーセットを用いたIHHNV-LAMPにおける最適反応温度の検討を行った。LAMPは、試薬としてLoopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学株式会社)を用いて、当該試薬のプロトコールに従った。具体的には、緩衝液・dNTP混液（12.5μl）、FIP/BIP(40pmol)(1.0μl）、F3 primer/B3 primer(5pmol)(1.0μl）、BST DNA polymerase(1.0μl)、dH2O(5.5μl)及び鋳型DNA(2μl)を加え、計25μlとした反応液をリアルタイム濁度測定装置(LA-200)に供し、60℃、63℃又は65℃で80分間反応させた。
　また、IHHNV感染エビ、WSDV感染エビ及び健常エビからそれぞれ得たDNAを用いて、上記プライマーセットを用いたIHHNV-LAMPの特異性について検討した。LAMPは、上記と同様の反応液を作製し、当該反応液をサーマルサイクラー（MyCycler）（BIO RAD）に供し最適条件(63℃)下で反応した後、95℃で2分間加熱し、その後反応を停止させることで行った。次いで、2％アガロースゲル/エチジウムブロマイド電気泳動により各増幅産物のラダーの有無を確認した。
　さらに、定量LAMPのスタンダード系列作製のために、新たに設計したプライマーIHHNV682F(CATTCTACCGTGGTGCTTCA：配列番号２５)及びIHHNV1670R(GCTCTGGCAGCAAAGGTAAC：配列番号２６)を用い、上記IHHNV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの構築を行った。プラスミドのコピー数は、実施例１に記載の方法に準じて算出し、1×107～1×1010(copies/μl)のプラスミド溶液を作製した。
　得られたプラスミド溶液を鋳型とし、上記と同様に反応液を作製し、当該反応液をリアルタイム濁度測定装置に供することで、定量IHHNV-LAMPにおける検量線の作成を行った。
２．結果
　図８は、IHHNV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す。図８において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。
　図８に示すように、最適な反応温度を検討した結果、63℃において約45分間の反応で最も迅速な反応が確認された。
　図９は、IHHNV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。各レーンは、以下の通りである。Marker：分子量マーカー、IHHNV：IHHNV感染エビ由来DNAを鋳型として含有するサンプル、WSDV：WSDV感染エビ由来DNAを鋳型として含有するサンプル、Healthy: 健常エビ由来DNAを鋳型として含有するサンプル、Negative：陰性対照サンプル(鋳型DNAを含有しないサンプル)
　図９に示すように、IHHNV-LAMPの特異性について検討した結果、IHHNV感染エビ由来のDNAにのみ陽性反応が確認され、WSDV感染エビ又は健常エビ由来のDNAにおいて反応は認められなかった。
　図１０は、定量IHHNV-LAMPにおける検量線を示す。図１０(A)は、上記IHHNV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの各コピー数を用いたLAMPの結果を示す。図１０(A)において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。一方、図１０(B)は、図１０(A)の結果に基づいて作成した定量IHHNV-LAMPの検量線を示す。図１０(B)において、横軸は上記プラスミドのコピー数を示し、縦軸は閾値時間(分)を示す。
　図１０に示すように、1×107～1×1010(copies/μl）のプラスミド溶液を鋳型としたリアルタイムLAMP法により、定量IHHNV-LAMPにおける精度の高い検量線が作成された。
〔実施例３〕LAMP法によるYHVの検出(以下、「YHV-LAMP」という）
１．材料及び方法
　PrimerExplorer V4により、YHVの構造糖タンパク質遺伝子(GenBank accession number: AF540644)の塩基番号1501～1750(配列番号２３)に対するLAMP用プライマーを作製した。設計したプライマーは以下の(1)～(6)のプライマーである。以下で説明するLAMPでは、当該(1)～(6)のプライマーから成るプライマーセットを使用した。
(1) FIP：GACGTGTGGATGCATAAATTTCATGTATCAAATTTTCCTTGAACCTGG(配列番号１１)
(2) BIP：CGATTGCCGTTACAACATGATGTTGGAATGGTCTCATGAAGG(配列番号１２)
(3) F3 primer：TTCCGTAATGCCGGTGAT(配列番号１３)
(4) B3 primer：AACGCTAGGAGTATAACCG(配列番号１４)
(5) LF primer：AGGTATGTTCTACCGAGCCAG(配列番号１５)
(6) LB primer：TGGTATAAACCTCGGAGATGACG(配列番号１６)
　次いで、YHV感染エビよりRNAを抽出し、得られたRNAを逆転写酵素に対する鋳型とし、且つ上記プライマーセットを用いたYHV-LAMPにおける最適反応温度の検討を行った。LAMPは、試薬としてLoopamp RNA増幅試薬キット(RT-LAMP)(栄研化学株式会社)を用いて、当該試薬のプロトコールに従った。具体的には、緩衝液・dNTP混液(12.5μl）、FIP/BIP（40pmol）(1.0μl)、F3 primer/B3 primer(5pmol)(1.0μl)、LF primer/LB primer(20pmol）(1.0μl)、Enzyme Mix(BST DNA polymeraseとAMV reverse transcriptaseの混合物)(1.0μl)、dH2O(3.5μl)及び鋳型RNA(2μl)を加え、計25μlとした反応液をリアルタイム濁度測定装置(LA-200)に供し、60℃、63℃又は65℃で60分間反応させた。
　また、YHV感染エビ及びTSV感染エビからそれぞれ得たRNA並びに健常エビから得たRNAを用いて、上記プライマーセットを用いたYHV-LAMPの特異性について検討した。LAMPは、上記と同様の反応液を作製し、当該反応液をサーマルサイクラー(MyCycler)(BIO RAD)に供し最適条件(63℃)下で反応した後、95℃で2分間加熱し、その後反応を停止させることで行った。次いで、2％アガロースゲル/エチジウムブロマイド電気泳動により各増幅産物のラダーの有無を確認した。
　さらに、定量LAMPのスタンダード系列作製のために、新たに設計したYHV560F(CTGTTGCCCATGATAGACATA：配列番号２７)及びB3 primerを用い、上記YHV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの構築を行った。プラスミドのコピー数は、実施例１に記載の方法に準じて算出し、1×106～1×1010（copies/μl）のプラスミド溶液を作製した。
　得られたプラスミド溶液を鋳型とし、上記と同様に反応液(ただし、逆転写酵素を含まない)を作製し、当該反応液をリアルタイム濁度測定装置に供することで、定量YHV-LAMPにおける検量線の作成を行った。
２．結果
　図１１は、YHV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す。図１１において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。
　図１１に示すように、最適な反応温度を検討した結果、63℃において約20分間の反応で最も迅速な反応が確認された。
　図１２は、YHV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。各レーンは、以下の通りである。Marker：分子量マーカー、YHV：YHV感染エビ由来RNAを鋳型として含有するサンプル、TSV：TSV感染エビ由来RNAを鋳型として含有するサンプル、Healthy：健常エビ由来RNAを鋳型として含有するサンプル、Negative：陰性対照サンプル(鋳型RNAを含有しないサンプル)
　図１２に示すように、YHV-LAMPの特異性について検討した結果、YHV感染エビ由来RNAにのみ陽性反応が確認され、TSV感染エビ由来RNA又は健常エビ由来のRNAにおいて反応は認められなかった。
　図１３は、定量YHV-LAMPにおける検量線を示す。図１３(A)は、上記YHV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの各コピー数を用いたLAMPの結果を示す。図１３(A)において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。一方、図１３(B)は、図１３(A)の結果に基づいて作成した定量YHV-LAMPの検量線を示す。図１３(B)において、横軸は上記プラスミドのコピー数を示し、縦軸は閾値時間(分)を示す。
　図１３に示すように、1×106～1×1010(copies/μl）のプラスミド溶液を鋳型としたリアルタイムLAMP法により、定量YHV-LAMPにおける検量線が作成された。
〔実施例４〕LAMP法によるTSVの検出(以下、「TSV-LAMP」という）
１．材料及び方法
　PrimerExplorer V4により、TSVの外被タンパク質遣伝子(GenBank accession number: AF277378）の塩基番号471～700(配列番号２４)に対するLAMP用プライマーを作製した。設計したプライマーは以下の(1)～(4)のプライマーである。以下で説明するLAMPでは、当該(1)～(4)のプライマーから成るプライマーセットを使用した。
(1) FIP：AGTTCATCTCAATGCCAGGAAATGAAGACATCAATTATTCGACGC(配列番号１７)
(2) BIP：GCAGTCTGAAGCTCGAGCTATTGTTATTCACATTTCTGGGGTT(配列番号１８)
(3) F3 primer：TGGAATAAGATGAATGCTAAGC(配列番号１９)
(4) B3 primer：GACTCAGAACGGAAAGCC(配列番号２０)
　次いで、TSV感染エビよりRNAを抽出し、得られたRNAを逆転写酵素に対する鋳型とし、且つ上記プライマーセットを用いたTSV-LAMPにおける最適反応温度の検討を行った。LAMPは、試薬としてLoopamp RNA増幅試薬キット(RT-LAMP)(栄研化学株式会社)を用いて、当該試薬のプロトコールに従った。具体的には、緩衝液・dNTP混液(12.5μl)、FIP/BIP（40pmol）(1.0μl)、F3 primer/B3 primer(5pmol)(1.0μl）、Enzyme Mix(BST DNA polymeraseとAMV reverse transcriptaseの混合物)(1.0μl）、dH2O(5.5μl)及び鋳型RNA(2μl)を加え、計25μlとした反応液をリアルタイム濁度測定装置(LA-200)に供し、60℃、63℃又は65℃で60分間反応させた。
　また、TSV感染エビ及びYHV感染エビからそれぞれ得たRNA並びに健常エビから得たRNAを用いて、上記プライマーセットを用いたTSV-LAMPの特異性について検討した。LAMPは、上記と同様の反応液を作製し、当該反応液をサーマルサイクラー(MyCycler)(BIO RAD)に供し最適条件(60℃)下で反応した後、95℃で2分間加熱し、その後反応を停止させることで行った。次いで、2％アガロースゲル/エチジウムブロマイド電気泳動により各増幅産物のラダーの有無を確認した。
　さらに、定量LAMPのスタンダード系列作製のために、F3 primer及び新たに設計したTSV1791R(TGGAGCACGCGTTACTGAAA：配列番号２８)を用い、TSV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの構築を行った。プラスミドのコピー数は、実施例１に記載の方法に準じて算出し、1×106～1×1010(copies/μl)のプラスミド溶液を作製した。
　得られたプラスミド溶液を鋳型とし、上記と同様に反応液(ただし、逆転写酵素を含まない)を作製し、当該反応液をリアルタイム濁度測定装置に供することで、定量TSV-LAMPにおける検量線の作成を行った。
２．結果
　図１４は、TSV-LAMPにおける反応温度の検討結果を示す。図１４において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。
　図１４に示すように、最適な反応温度を検討した結果、60℃において約20分間の反応で最も迅速な反応が確認された。
　図１５は、TSV-LAMPの特異性に関する電気泳動写真である。各レーンは、以下の通りである。Marker：分子量マーカー、TSV：TSV感染エビ由来RNAを鋳型として含有するサンプル、YHV：YHV感染エビ由来RNAを鋳型として含有するサンプル、Healthy：健常エビ由来RNAを鋳型として含有するサンプル、Negative：陰性対照サンプル(鋳型RNAを含有しないサンプル)
　図１５に示すように、TSV-LAMPの特異性について検討した結果、TSV感染エビ由来RNAにのみ陽性反応が確認され、YHV感染エビ由来RNA又は健常エビ由来のRNAにおいて反応は認められなかった。
　図１６は、定量TSV-LAMPにおける検量線を示す。図１６(A)は、上記TSV-LAMPでの標的遺伝子配列を含むプラスミドの各コピー数を用いたLAMPの結果を示す。図１６(A)において、横軸は反応時間(分)を示し、縦軸は濁度(O.D.)を示す。一方、図１６(B)は、図１６(A)の結果に基づいて作成した定量TSV-LAMPの検量線を示す。図１６(B)において、横軸は上記プラスミドのコピー数を示し、縦軸は閾値時間(分)を示す。
　図１６に示すように、1×106～1×1010(copies/μl）のプラスミド溶液を鋳型としたリアルタイムLAMP法により、定量TSV-LAMPにおける検量線が作成された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (18)

  1. 　配列番号１～４に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、環状型等温増幅反応における急性ウイルス血症原因ウイルス検出用プライマーセット。
  2. 　配列番号５及び６に示される塩基配列を有する2つのプライマーをさらに含む、請求項１記載のプライマーセット。
  3. 　請求項１又は２記載のプライマーセットを含む、環状型等温増幅反応における急性ウイルス血症原因ウイルス検出用試薬キット。
  4. 　請求項１又は２記載のプライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルを環状型等温増幅反応に供する工程と、
    　前記環状型等温増幅反応によって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程と、
    を含む、環状型等温増幅反応における急性ウイルス血症原因ウイルス検出方法。
  5. 　前記検出が定量的検出であることを特徴とする、請求項４記載の方法。
  6. 　配列番号７～１０に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、環状型等温増幅反応における伝染性皮下造血器壊死症ウイルス検出用プライマーセット。
  7. 　請求項６記載のプライマーセットを含む、環状型等温増幅反応における伝染性皮下造血器壊死症ウイルス検出用試薬キット。
  8. 　請求項６記載のプライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルを環状型等温増幅反応に供する工程と、
    　前記環状型等温増幅反応によって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程と、
    を含む、環状型等温増幅反応における伝染性皮下造血器壊死症ウイルス検出方法。
  9. 　前記検出が定量的検出であることを特徴とする、請求項８記載の方法。
  10. 　配列番号１１～１４に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、環状型等温増幅反応におけるイエローヘッド病原因ウイルス検出用プライマーセット。
  11. 　配列番号１５及び１６に示される塩基配列を有する2つのプライマーをさらに含む、請求項１０記載のプライマーセット。
  12. 　請求項１０又は１１記載のプライマーセットを含む、環状型等温増幅反応におけるイエローヘッド病原因ウイルス検出用試薬キット。
  13. 　請求項１０又は１１記載のプライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルを環状型等温増幅反応に供する工程と、
    　前記環状型等温増幅反応によって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程と、
    を含む、環状型等温増幅反応におけるイエローヘッド病原因ウイルス検出方法。
  14. 　前記検出が定量的検出であることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
  15. 　配列番号１７～２０に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、環状型等温増幅反応におけるタウラ症候群原因ウイルス検出用プライマーセット。
  16. 　請求項１５記載のプライマーセットを含む、環状型等温増幅反応におけるタウラ症候群原因ウイルス検出用試薬キット。
  17. 　請求項１５記載のプライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルを環状型等温増幅反応に供する工程と、
    　前記環状型等温増幅反応によって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程と、
    を含む、環状型等温増幅反応におけるタウラ症候群原因ウイルス検出方法。
  18. 　前記検出が定量的検出であることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
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