JP2012024101A - 西ナイルウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドおよび方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法は該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ;そして増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出は該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該増幅工程または該検出工程、または両工程は少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを用いて行われる。好ましくは、本方法は1対のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。
【選択図】なし
Description
本発明は、西ナイルウイルスの検出するための方法および試薬に関する。より詳細には本発明は、西ナイルウイルスを検出する核酸に基づく方法およびそのような方法に有用な核酸試薬に関する。
西ナイルウイルスは、約11キロベースの1本鎖の陽極性のRNAゲノムを含有する球状の、エンベロープを持つウイルスである。西ナイルウイルスのサブタイプは、エンベロープ(EまたはENV)タンパク質中の抗原性の変化により、およびアミノ酸154−156でのN−グリコシル化部位(Asn−Tyr−Ser)の存在により識別することができる(非特許文献1)。西ナイルウイルスは分類学的にフラビウイルス科(Flavivirdae)、フラビウイルス属(genus Flavivirus)のファミリーに分類される。このウイルスは1937年にウガンダの西ナイル地方に住む熱のあるヒトから初めて単離された。
方法を開示する(英語による要約から)。
Veterinary Institute)に割り当てられた2002年10月17日に公開された特許文献2は、IS−98−ST1として知られている西ナイルウイルスの神経侵襲性および神経毒性株、そのゲノムに由来する核酸分子および西ナイルウイルスの検出法を開示する。
(a)R1−N−R2、ここで
Nは
R1はNの5’末端に共有結合した図1(配列番号1)に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中におけるNの5’末端の直ぐ上流の該コンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしNが該コンセンサス配列に相補的である時、R1は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され;そして
R2はNの3’末端に共有結合した該コンセンサス配列中におけるNの3’末端の直ぐ下流の該コンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしNが該コンセンサス配列に相補的である時、R2は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され;
(b)(a)で規定するNの単離されたフラグメント、ここで該フラグメントは10〜19塩基長であり;
(c)R1−X−R2、ここでXは(a)で規定するNの少なくとも10個の連続した塩基であり、そしてR1およびR2は(a)で規定する通りであり、ここでR1が存在する時、R2は存在せず、そしてXはXの5’末端の塩基がNの5’末端の塩基と同じとなるように選択され;そしてR2が存在する時、R1は存在せず、そしてXはXの3’末端の塩基がNの3’末端の塩基と同じとなるように選択され;
(d)(a)、(b)または(c)のオリゴヌクレオチドと少なくとも80%の配列同一性を有する単離されたオリゴヌクレオチド;または
(e)(a)、(b)、(c)または(d)の完全長相補鎖である単離されたオリゴヌクレオチド、
を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。
ヌクレオチドを用いて行われる。好ましくは、本発明の方法は上記1対のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。より好ましくは本発明の方法は上記の組のオリゴヌクレオチドを用いて行われる。最も好ましくは本発明は
(a)少なくとも1000塩基長の核酸配列を準備し;
(b)該核酸配列を、該配列の1つの末端から始まる約500塩基長の非重複セグメントに分割し;そして
(f)少なくとも1つのセグメントおよび/またはその相補鎖の配列から、各々約15〜25塩基長のフォワードおよびリバースプライマーを選択し、ここでフォワードおよびリバースプライマーは重複配列を持たず、そして約50〜200塩基を有するアンプリコンを生成するように選択される。
米国では西ナイルウイルス感染の発生が増えている。西ナイルウイルスでは滅多に死なないが、ウイルスに感染した150人に約1人は脳炎または髄膜炎の死亡例を発症する可能性がある。現在、西ナイルウイルス感染を処置または防止する手立てはない。早期の検出が感染を診断し、そして症状を処置するために重要である。献血された血液中の西ナイルウイルスの検出は、汚染された血液および血液誘導体から生じる感染の防止に重要である。
R1はNの5’末端に図1(配列番号1)に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中で共有結合したNの5’末端の直ぐ上流のコンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしNが該コンセンサス配列に相補的である時、R1は該コンセンサス配列の相補鎖から選択され;そしてR2はNの3’末端に該コンセンサス配列中で共有結合したNの3’末端の直ぐ下流のコンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしNが該コンセンサス配列に相補的である時、R2は該コンセンサス配列の相補鎖から選択される。
続した塩基を選択することにより選択される。好ましくはR1およびR2は独立して0〜15個の連続した塩基長であり、より好ましくは0〜10個の連続した塩基長であり、最も好ましくは0〜5個の連続した塩基長である。Nがコンセンサス配列に相補的である場合、R1およびR2はコンセンサス配列の相補鎖から同じ様式で選択される。
Wunsch(1970) J.Mol.Biol.48:443−453の相同性アライメント計算法;Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.87:2444−2448の類似性調査法;Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877のように修飾されたKarlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264の計算法である。これらの数学的計算法のコンピューターによる実行は、配列を比較するために利用して配列の同一性を決定することができる。そのような実施には限定するわけではないが:PC/GeneプログラムのCLUSTAL(インテリジェネティックス(Intelligenetics)から入手可能、マウンテンビュー、カリフォルニア州);ALIGNプログラム(バージョン2.0)およびウィスコンシン ジェネティックス ソフトウェア パッケージ(Wisconsin Genetics Software Package)、バージョン8のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA(ジェネティックス コンピューター グループ(Genetics Computer Group:GCG)、575サイエンス ドライブ(Science
Drive)から入手可能、マジソン、ウィスコンシン州、米国)がある。これらのプログラムを使用したアライメントは、デフォルトパラメーターを使用して行うことができる。好ましくはオリゴヌクレオチドは式R1−N−R2のオリゴヌクレオチド(ここでR1、NおよびR2は本明細書に定義する意味を有する)、本明細書で定義するNのフラグメントまたは式R1−X−R2を有するオリゴヌクレオチド(ここでR1、XおよびR2は本明細書に定義する意味を有する)と85、90または95%の配列同一性を有する。
ルウイルスの核酸を増幅または検出するために本発明の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを使用する。
Amplification:SDA),Walker,G.T.and Schram,J.L.、欧州特許出願公開第0 500 224 A2号明細書;Walker,G.T.et al.,Nuc.Acids Res.,1992;20,1691−1696)。
形成された時、または所謂「リアルタイム」様式で検出することができる。その結果、増幅産物/プローブハイブリッドは、反応混合物が増幅条件下にある間に形成され、そして検出される。
より低い程度の類似性が検出されるように、配列中に幾つかの誤対合を可能とするように調整することができる。
少なくとも1つのセグメントおよび/またはその相補鎖の配列から、各々約15〜25塩基長のフォワードおよびリバースプライマーを選択し、ここでフォワードおよびリバースプライマーは重複配列を持たず、そして約50〜200塩基を有するアルプリコンを生成するように選択される。
なる単離されたオリゴヌクレオチドを提供し、ここでオリゴヌクレオチドは北米またはイスラエル以外からの西ナイルウイルス単離物よりも、北米またはイスラエルからの西ナイルウイルス単離物に由来する核酸に大きな親和性で結合する。
西ナイルウイルス(WNV)の配列分析:コンセンサス配列
WNVは、約11kbの1本鎖の陽極性RNAゲノムである。GenBankの調査は、米国で確認された単離物から8種のほぼ完全長のWNVゲノム配列の同定をもたらした(GenBank寄託番号:AF196835、AF260967、AF202541、AF206518、AF404753、AG404754、AF404755およびAF404756)。配列のアライメントおよび比較は、Vector Nti Suite7.0(インフォマックス(InforMax)、フレデリック、メリーランド州、米国)を使用して行い、そしてコンセンサス配列はこれら8種の配列の分析に由来した(全WNVコンセンサス配列は図1に列挙する)。現在知られているWNVの米国の単離物は、
ヌクレオチドレベルで高い相同性を有し、ほとんどが米国におけるウイルスの最近の「創始者効果」感染の結果らしい。米国の株に対してヨーロッパおよび他のさらに祖先の単離物に関するWNV配列比較は、ヌクレオチドレベルで一層高い多様性を明らかにする。
2.1 PCR増幅プライマーの設計:
WNVコンセンサス配列から、8種の完全長の米国WNV単離物に由来する最高に配列が保存された10944bp領域を、PCR増幅プライマーの設計に選択した。この相同性領域を系統的に500bp区画に破壊し、そして各区分中に1対の増幅プライマーがPrimer3PCRプライマーデザインソフトウェア(ホワイトヘッド インスティチュート フォ バイオメディカルリサーチ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)を使用して選択された。Primer3を使用したプライマー設計のためのデフォルト設定は、100〜150bpのアンプリコンについて至適化され、55〜60℃の範囲のプライマーTm(融解温度)、およびG/C含量は、二重標識蛍光プローブに基づくアッセイ(“TaqMan”アッセイ)について至適化された(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州)。
WNVゲノムのコンセンサス配列内で同定された28個の陽性PCR増幅プライマー対の中の6組を、溶液中で低濃度のWNV標的を増幅する能力に基づき、核酸の蛍光検出の開発で考慮するために選択した(表2)。このために、これら6個のWNVアンプリコンの配列は、PrimerQuestsmソフトウェア(インテグレイティッドDNAテクノロジーズ(Integrated DNA Technologies)、コーラルヴィル、アイオワ州、米国)を使用して評価して、WNVアンプリコン内でハイブリダイズする最適な蛍光プローブを同定した。ソフトウェアを行うためのデフォルト設定は、最適なプローブサイズ=30nt;最適なプローブTm=70℃;そして最適なプローブGC%=50であった。プローブの配置は増幅プライマーの最大20ヌクレオチドの3’内となるように優先順位をつけ、そして両鎖を分析して、6個の各WNVアンプリコン内で確認できる1つの最適プライマーを同定した。選択したプローブを表2に示す。
Technologies)、ノバト、カリフォルニア州、米国)を含有する蛍光WNVプローブを合成した。6種の各増幅プライマー対/蛍光プローブの組み合わせは(これを表2に示す)、RT−PCR(Brilliant(商標)Plus Single
Step QRT−PCRシステム、ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州、米国)により、正常ヒト血漿(NHP)中で希釈した標的濃度のWNVの検出について試験した。標的は1:20、1:100、1:200、1:1,000,1:2000および1:10,000に希釈した。6種すべての増幅プライマー対/蛍光プローブの組み合わせは、ヒト血漿中のWNVを検出することができた。
3.1 ヒト血漿からWNV核酸単離の至適化:
核酸の単離は、イソチオシアン酸グアニジン溶解/アルコール沈殿法(AmpliScreen(商標)Multiprep Specimen Processing Procedure、ロッシュ ダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)、バーゼル、スイス)を使用して既知濃度のWNV RNAでスパイクした正常ヒト血漿で行った。ポリアクリルアミド担体をRNAのイソプロパノール沈殿前に加えた。単離毎に1mL容量の血漿を使用し、そして沈殿した核酸を全容量200μLの溶出バッファーに懸濁した。全単離容量の25%(50μL)を各RT−PCR反応に使用した。
販売元の推薦からわずかに修飾したBrilliant(商標)Plus Single Step QRT−PCRシステム(ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア州、米国)を、核酸の増幅に使用した。ウシ血清アルブミン(BSA)をRT−PCR反応に加えた。リアル−タイムPCRをABI7900HT DNA Detection System(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州)で行った。使用したRT−PCR熱循環条件は、45℃で30分間;95℃で8分間;次いで95℃で15秒間と55℃で1分間との間を交互に60サイクルであった。
Nは
R1はオリゴヌクレオチドNの5'末端に共有結合した図1(配列番号1)に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中におけるオリゴヌクレオチドNの5'末端の直ぐ上流の該
コンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしオリゴヌクレオチドNが該コンセンサス配列に相補的である時、R1は該コンセンサス
配列の相補鎖から選択され;そして
R2はオリゴヌクレオチドNの3'末端に共有結合した該コンセンサス中におけるオリゴヌクレオチドNの3'末端の直ぐ下流の該コンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基
のオリゴヌクレオチド配列であるが、
ただしオリゴヌクレオチドNが該コンセンサス配列に相補的である時、R2は該コンセン
サス配列の相補鎖か
ら選択されるものである;
(b)(a)で規定するオリゴヌクレオチドNの単離されたフラグメントであって、ここで該フラグメントは10〜19塩基長であるもの;
(c)R1−X−R2、ここでXは(a)で規定するオリゴヌクレオチドNの少なくとも10個の連続した塩基であり、そしてR1およびR2は(a)で規定する通りであり、ここでR1が存在する時、R2は存在せず、そしてXはXの5'末端の塩基がオリゴヌクレオチド
Nの5'末端の塩基と同じとなるように選択され;そしてR2が存在する時、R1は存在せ
ず、そしてXはXの3'末端の塩基がNの3'末端の塩基と同じとなるように選択されるものである;
(d)(a)、(b)または(c)のオリゴヌクレオチドと少なくとも80%の配列同一性を有する単離されたオリゴヌクレオチド;または
(e)(a)、(b)、(c)または(d)の完全長相補鎖である単離されたオリゴヌクレオチド、
を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチド。
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ;そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該方法が西ナイルウイルスの核酸を増幅または検出するために態様1に記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを使用する上記方法。
試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を、態様2に記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ;そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示す上記方法。
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ;そして
態様6に記載したオリゴヌクレオチドを使用して増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示す上記方法。
そのようなウイルスを含有する該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を、態様11に記載の一対のオリゴヌクレオチドを使用して増幅させ;そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示す上記方法。
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ;そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該増幅工程および該検出工程が態様15に記載の1組を用いて行われる上記方法。
態様1に記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを、試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸とハイブリダイズさせ;そして
態様1に記載の該少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと西ナイルウイルス核酸とのハイブリダイゼーションを検出する、
工程を含んでなる上記方法。
Claims (8)
- (a)R1−N−R2、
式中、Nは
5'-CTGGATCGATGGAGAGGTGT-3' (配列番号: 2),
5'-TCCGGTCTTTCCTCCTCTTT-3' (配列番号: 3),
5'-CTACCGTCAGCGATCTCTCC-3' (配列番号: 4),
5'-TTCCTTTGCCAAATAGTCCG-3' (配列番号: 5),
5'-GACGTCGGGTCATTTGAAGT-3' (配列番号: 6),
5'-ACTGCAATTCCAACACCACA-3' (配列番号: 7),
5'-ATGTCCTGGATAACGCAAGG-3' (配列番号: 8),
5'-CTCCTCCAACTGCGAGAAAC-3' (配列番号: 9),
5'-ATCGCGCTTGGAATAGCTTA-3' (配列番号: 10),
5'-GACAGCCGTTCCAATGATCT-3' (配列番号: 11),
5'-AGGCCGGGTAGAGATTGACT-3' (配列番号: 12),
5'-CCTGCAGCACCAATCTGTTA-3' (配列番号: 13),
5'-CAGTGTTTATGGTGGCATCG-3' (配列番号: 14),
5'-GGCATCGTGATAAGCCATTT-3' (配列番号: 15),
5'-TGGCAGAGCTTGACATTGAC-3' (配列番号: 16),
5'-GCCGTTCTCTCAATCCACAT-3' (配列番号: 17),
5'-ATACTGGGGCAGTGTCAAGG-3' (配列番号: 18),
5'-TAACGTTCTTGCCAGGTTCC-3' (配列番号: 19),
5'-GGCTGAAGCACTGAGAGGAC-3' (配列番号: 20),
5'-ACAGGTTGTAGTTCGGCACC-3' (配列番号: 21),
5'-CCAGGCACTTCAGATCCATT-3' (配列番号: 22),
5'-CTAGGCACAAACCAAACCGT-3' (配列番号: 23),
5'-GATTGACGCCAGGGTGTACT-3' (配列番号: 24),
5'-ATGTCTTCCCCATGAAGTGC-3' (配列番号: 25),
5'-CGCAGACAGACAACCAGCTA-3' (配列番号: 26),
5'-TTGACCTCAATTCTTTGCCC-3' (配列番号: 27),
5'-GACGTCCCAGAATTAGAGGGC-3' (配列番号: 28),
5'-TCCGGCTTCTCGTACTGTCT-3' (配列番号: 29),
5'-CTCTGTTTGGAACGCAACAA-3' (配列番号: 30),
5'-GCCCCACCTCTTTTTAGTCC-3' (配列番号: 31),
5'-AGTCGAGCTTCAGGCAATGT-3' (配列番号: 32),
5'-TGGTGTCTGAGTTGAGCAGG-3' (配列番号: 33),
5'-TGAGTACAGTTCGACGTGGC-3' (配列番号: 34),
5'-TTGAGAGGAGCCTGACCACT-3' (配列番号: 35),
5'-AGCTAAGGTGCTTGAGCTGC-3' (配列番号: 36),
5'-ATGACGGTTCTTCCATCAGC-3' (配列番号: 37),
5'-ACATCCAAGAGTGGAAACCG-3' (配列番号: 38),
5'-CGAGCTCTGCCTACCAATTC-3' (配列番号: 39),
5'-GCAGGAGGAGAGTGGATGAC-3' (配列番号: 40),
5'-TTCTCCACTGGGGTTITGTC-3' (配列番号: 41),
5'-GGGTTAACAAAGGCAAACCA-3' (配列番号: 42),
5'-CCCTGACCTACAGCTTCAG-3' (配列番号: 43),
5'-TAGTTCGCCTGTGTGAGCTG-3' (配列番号: 44),
5'-TTTTAGCATATTGACAGCCCG-3' (配列番号: 45),
5'-TTGATTGGACTGAAGAGGGC-3' (配列番号: 46),
5'-GCAATTGCTGTGAACCTGAA-3' (配列番号: 47),
5'-GCTGAAGCTGTAGGTCAGGG-3' (配列番号: 48),
5'-CTGGTTGTGCAGAGCAGAAG-3' (配列番号: 49),
5'-GGAGAGTGCAGTCTGCGATA-3' (配列番号: 50),
5'-GTCTCCTCTAACCTCTAGTCC-3' (配列番号: 51),
5'-GCCACCGGAAGTTGAGTAGA-3' (配列番号: 52),
5'-GAGACGGTTCTGAGGGCTTAC-3' (配列番号: 53),
5'-TGGATTTGGTCTCACCAGCACTCGGATGTT-3' (配列番号: 54),
5'-ACATCCGCAGTGCCCAGAGAACATAATGGA-3' (配列番号: 55),
5'-ACGGGTTCACTACTACTGCATCTAGAGACA-3' (配列番号: 56),
5'-CCGGTAATGGTGTTAAACCAGGGCGAAAGGA-3' (配列番号: 57),
5'-CAGGAGGACTGGGTTAACAAAGGCAAACCA-3' (配列番号: 58), および
5'-ATCACTTCGCGGCTTTGTTCACCCAGTCCT-3' (配列番号: 59);
からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドNであり;
R1はオリゴヌクレオチドNの5'末端に共有結合した図1(配列番号1)に示す西ナイルウイルスコンセンサス配列中におけるオリゴヌクレオチドNの5'末端の直ぐ上流の該
コンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基のオリゴヌクレオチド配列であるが、ただしオリゴヌクレオチドNが該コンセンサス配列に相補的である時、R1は該コンセンサス
配列の相補鎖から選択され;そして
R2はオリゴヌクレオチドNの3'末端に共有結合した該コンセンサス中におけるオリゴヌクレオチドNの3'末端の直ぐ下流の該コンセンサス配列の0〜20個の連続した塩基
のオリゴヌクレオチド配列であるが、
ただしオリゴヌクレオチドNが該コンセンサス配列に相補的である時、R2は該コンセン
サス配列の相補鎖から選択されるものである;
で表されるオリゴヌクレオチド、または
(b)(a)のオリゴヌクレオチドと少なくとも80%の配列同一性を有する単離されたオリゴヌクレオチド;または
(c)(a)または(b)の完全長相補鎖である単離されたオリゴヌクレオチド、
を含んでなる単離されたオリゴヌクレオチド。 - 5'-CTGGATCGATGGAGAGGTGT-3' (配列番号: 2),
5'-TCCGGTCTTTCCTCCTCTTT-3' (配列番号: 3),
5'-CTACCGTCAGCGATCTCTCC-3' (配列番号: 4),
5'-TTCCTTTGCCAAATAGTCCG-3' (配列番号: 5),
5'-GACGTCGGGTCATTTGAAGT-3' (配列番号: 6)
5'-ACTGCAATTCCAACACCACA-3' (配列番号: 7),
5'-ATGTCCTGGATAACGCAAGG-3' (配列番号: 8),
5'-CTCCTCCAACTGCGAGAAAC-3' (配列番号: 9),
5'-AGGCCGGGTAGAGATTGACT-3' (配列番号: 12),
5'-CCTGCAGCACCAATCTGTTA-3' (配列番号: 13),
5'-CAGTGTTTATGGTGGCATCG-3' (配列番号: 14),
5'-GGCATCGTGATAAGCCATTT-3' (配列番号: 15),
5'-TGGCAGAGCTTGACATTGAC-3' (配列番号: 16),
5'-GCCGTTCTCTCAATCCACAT-3' (配列番号: 17),
5'-ATACTGGGGCAGTGTCAAGG-3' (配列番号: 18),
5'-TAACGTTCTTGCCAGGTTCC-3' (配列番号: 19),
5'-CCAGGCACTTCAGATCCATT-3' (配列番号: 22),
5'-CTAGGCACAAACCAAACCGT-3' (配列番号: 23),
5'-GATTGACGCCAGGGTGTACT-3' (配列番号: 24),
5'-ATGTCTTCCCCATGAAGTGC-3' (配列番号: 25),
5'-CGCAGACAGACAACCAGCTA-3' (配列番号: 26),
5'-TTGACCTCAATTCTTTGCCC-3' (配列番号: 27),
5'-CTCTGTTTGGAACGCAACAA-3' (配列番号: 30),
5'-GCCCCACCTCTTTTTAGTCC-3' (配列番号: 31),
5'-AGTCGAGCTTCAGGCAATGT-3' (配列番号: 32),
5'-TGGTGTCTGAGTTGAGCAGG-3' (配列番号: 33),
5'-TGAGTACAGTTCGACGTGGC-3' (配列番号: 34),
5'-TTGAGAGGAGCCTGACCACT-3' (配列番号: 35),
5'-AGCTAAGGTGCTTGAGCTGC-3' (配列番号: 36),
5'-ATGACGGTTCTTCCATCAGC-3' (配列番号: 37),
5'-ACATCCAAGAGTGGAAACCG-3' (配列番号: 38),
5'-CGAGCTCTGCCTACCAATTC-3' (配列番号: 39),
5'-GCAGGAGGAGAGTGGATGAC-3' (配列番号: 40),
5'-TTCTCCACTGGGGTTTTGTC-3' (配列番号: 41),
5'-TAGTTCGCCTGTGTGAGCTG-3' (配列番号: 44),
5'-TTTTAGCATATTGACAGCCCG-3' (配列番号: 45),
5'-TTGATTGGACTGAAGAGGGC-3' (配列番号: 46),
5'-GCAATTGCTGTGAACCTGAA-3' (配列番号: 47),
5'-GCTGAAGCTGTAGGTCAGGG-3' (配列番号: 48),および
5'-CTGGTTGTGCAGAGCAGAAG-3' (配列番号: 49),
からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドからなるか、または該オリゴヌクレオチドを含んでなる単離されたオリゴヌクレオチド。 - オリゴヌクレオチドが検出可能な標識をさらに含んでなる請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 上記検出可能な標識が5'末端に結合した蛍光分子である請求項3に記載のオリゴヌクレオチド。
- 3'末端に消光剤分子をさらに含んでなる請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- (a) 5'-CTGGATCGATGGAGAGGTGT-3' (配列番号: 2) と
5'-TCCGGTCTTTCCTCCTCTTT-3' (配列番号: 3)
(b) 5'-CTACCGTCAGCGATCTCTCC-3' (配列番号: 4) と
5'-TTCCTTTGCCAAATAGTCCG-3' (配列番号: 5)
(c) 5'-GACGTCGGGTCATTTGAAGT-3' (配列番号: 6) と
5'-ACTGCAATTCCAACACCACA-3' (配列番号: 7)
(d) 5'-ATGTCCTGGATAACGCAAGG-3' (配列番号: 8) と
5'-CTCCTCCAACTGCGAGAAAC-3' (配列番号: 9)
(e) 5'-ATCGCGCTTGGAATAGCTTA-3' (配列番号: 10) と
5'-GACAGCCGTTCCAATGATCT-3' (配列番号: 11)
(f) 5'-AGGCCGGGTAGAGATTGACT-3' (配列番号: 12) と
5'-CCTGCAGCACCAATCTGTTA-3' (配列番号: 13)
(g) 5'-CAGTGTTTATGGTGGCATCG-3' (配列番号: 14) と
5'-GGCATCGTGATAAGCCATTT-3' (配列番号: 15)
(h) 5'-TGGCAGAGCTTGACATTGAC-3' (配列番号: 16) と
5'-GCCGTTCTCTCAATCCACAT-3' (配列番号: 17)
(i) 5'-ATACTGGGGCAGTGTCAAGG-3' (配列番号: 18) と
5'-TAACGTTCTTGCCAGGTTCC-3' (配列番号: 19)
(j) 5'-GGCTGAAGCACTGAGAGGAC-3' (配列番号: 20) と
S'-ACAGGTTGTAGTTCGGCACC-3' (配列番号: 21)
(k) 5'-CCAGGCACTTCAGATCCATT-3' (配列番号: 22) と
5'-CTAGGCACAAACCAAACCGT-3' (配列番号: 23)
(1) 5'-GATTGACGCCAGGGTGTACT-3' (配列番号: 24) と
5'-ATGTCTTCCCCATGAAGTGC-3' (配列番号: 25)
(m) 5'-CGCAGACAGACAACCAGCTA-3' (配列番号: 26) と
5'-TTGACCTCAATTCTTTGCCC-3' (配列番号: 27)
(n) 5'-GACGTCCCAGAATTAGAGCGC-3' (配列番号: 28) と
5'-TCCGGCTTCTCGTACTGTCT-3' (配列番号: 29)
(o) 5'-CTCTGTTTGGAACGCAACAA-3' (配列番号: 30) と
5'-GCCCCACCTCTTTTTAGTCC-3' (配列番号: 31)
(p) 5'-AGTCGAGCTTCAGGCAATGT-3' (配列番号: 32) と
5'-TGGTGTCTGAGTTGAGCAGG-3' (配列番号: 33)
(q) 5'-TGAGTACAGTTCGACGTGGC-3' (配列番号: 34) と
5'-TTGAGAGGAGCCTGACCACT-3' (配列番号: 35)
(r) 5'-AGCTAAGGTGCTTGAGCTGC-3' (配列番号: 36) と
5'-ATGACGGTTCTTCCATCAGC-3' (配列番号: 37)
(s) 5'-ACATCCAAGAGTGGAAACCG-3' (配列番号: 38) と
5'-CGAGCTCTGCCTACCAATTC-3' (配列番号: 39)
(t) 5'-GCAGGAGGAGAGTGGATGAC-3' (配列番号: 40) と
5'-TTCTCCACTGGGGTTTTGTC-3' (配列番号: 41)
(u) 5'-GGGTTAACAAAGGCAAACCA-3' (配列番号: 42) と
5'-CCCTGACCTACAGCTTCAG-3' (配列番号: 43)
(v) 5'-TAGTTCGCCTGTGTGAGCTG-3' (配列番号: 44) と
5'-TTTTAGCATATTGACAGCCCG-3' (配列番号: 45)
(w) 5'-TTGATTGGACTGAAGAGGGC-3' (配列番号: 46) と
5'-GCAATTGCTGTGAACCTGAA-3' (配列番号: 47)
(x) 5'-GCTGAAGCTGTAGGTCAGGG-3' (配列番号: 48) と
5'-CTGGTTGTGCAGAGCAGAAG-3' (配列番号: 49)
(y) 5'-GGAGAGTGCAGTCTGCGATA-3' (配列番号: 50) と
S'-GTCTCCTCTAACCTCTAGTCC-3' (配列番号: 51)、ならびに
(z) 5'-GCCACCGGAAGTTGAGTAGA-3' (配列番号: 52) と
5'-GAGACGGTTCTGAGGGCTTAC-3' (配列番号: 53)
からなる群から選択される一対の単離されたオリゴヌクレオチド。 - 試験サンプル中の西ナイルウイルスの検出法であって:
該試験サンプル中の西ナイルウイルスの核酸を増幅させ;そして
増幅した核酸を検出する工程を含んでなり、ここで増幅した核酸の検出が該試験サンプル中の西ナイルウイルスの存在を示し、該方法が西ナイルウイルスの核酸を増幅または検出するために請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを使用する上記方法。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含んでなるキット。
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