CN117512208A - 一种检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组、试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组、试剂盒，该引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.18所示的六组引物探针组。本发明的技术方案结合多重PCR和液相芯片技术，进行一次检测，可以同时对新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒进行检测，操作方便，不受干扰物质影响，且具有良好的灵敏性和特异性。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组、试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一种RNA病毒，自被发现以来，已经发生了多次变异，产生了多种变异毒株，包括被世界卫生组织定义为“关注的变异”的5种变异株型：Alpha株、Beta株、Gamma株、Delta株、Omicron株。变异的产生对于病毒的传染性和毒力等都有较大的影响。
流感病毒(influenza virus，IFV)是引起流行性感冒的病原体，全球多次发生大流行，给人类造成严重的危害。IFV是一种RNA病毒，包括甲型、乙型、丙型和丁型流感病毒(IAV、IBV、ICV、IDV)，其中甲型流感病毒极易发生抗原漂移和抗原转换，具有多种亚型，曾引起多次大范围甚至世界性的大流行，乙型流感病毒只有一种亚型，在人群中一般引起局部流行，甲型和乙型流感病毒均是引起季节性流行的呼吸道疾病的主要病原体。
新型冠状病毒和流感病毒的流行病学与临床症状极为相似，给临床诊断和治疗等造成了极大的困难，同时，新型冠状病毒和流感病毒还存在双重传播/感染的风险。而目前针对患者只能分别进行新型冠状病毒和流感病毒的检测，才能进行确认所感染的病毒类型，操作复杂，花费时间长。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组、试剂盒，能同时快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
对此，本发明采用的技术方案为：
检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组，包括第一引物探针组、第二引物探针组、第三引物探针组、第四引物探针组、第五引物探针组、第六引物探针组；
所述第一引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的第一上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第一下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第一探针；
所述第二引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第二上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的第二下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的第二探针；
所述第三引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的第三上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的第三下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的第三探针；
所述第四引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的第四上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的第四下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的第四探针；
所述第五引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的第五上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的第五下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的第五探针；
所述第六引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的第六上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的第六下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的第六探针。其中，所述第六引物探针组针对的是人内参基因ACTB，该基因在人体细胞中表达量较高，使用其作为质控基因可以监测采样和扩增的整个流程，避免检测结果的假阴性。
上述引物探针组分别对应新型冠状病毒N基因、新型冠状病毒ORF1ab基因、新型冠状病毒S基因、甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因和人类看家基因ACTB基因，可以采用多重PCR和液相芯片技术的新型冠状病毒和流感病毒的检测方法能够同时对新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒进行检测。
作为本发明的进一步改进，所述第一下游引物、第二下游引物、第三下游引物、第四下游引物、第五下游引物、第六下游引物的5’端有生物素标记，所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针的5’端结合添加10个poly(T)，并修饰C6氨基化。
本发明还公开了如上所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组在制备病毒检测的试剂盒中的应用，所述病毒至少包括新型冠状病毒SARS-CoV-2。所述试剂盒为液相芯片试剂盒。
作为本发明的进一步改进，所述病毒还包括甲型流感病毒IAV、乙型流感病毒IBV中的至少一种。
本发明还公开了检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒，包括如上所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组、荧光编码微球和助剂。所述试剂盒为液相芯片试剂盒。
作为本发明的进一步改进，所述第一上游引物、第一下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第二上游引物、第二下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第三上游引物、第三下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第四上游引物、第四下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第五上游引物、第五下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第六上游引物、第六下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L。
作为本发明的进一步改进，所述第一上游引物、第一下游引物的浓度分别为1.25μmol/L、10μmol/L；
所述第二上游引物、第二下游引物的浓度分别为1.25μmol/L、10μmol/L；
所述第三上游引物、第三下游引物的浓度分别为1μmol/L、10μmol/L；
所述第四上游引物、第四下游引物的浓度分别为1μmol/L、10μmol/L；
所述第五上游引物、第五下游引物的浓度分别为1.25μmol/L、10μmol/L；
所述第六上游引物、第六下游引物的浓度分别为1μmol/L、10μmol/L。
作为本发明的进一步改进，所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒SARS-CoV-2，所述病毒还包括甲型流感病毒IAV、乙型流感病毒IBV中的至少一种。
作为本发明的进一步改进，所述试剂盒包含定量标准品和PCR反应液。
本发明还公开了一种用于以非诊断目的检测引起呼吸道感染的病原体并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)以待测样品cDNA为模板，将核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的引物混合，经PCR获得扩增产物；
2)将核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQID NO:15、SEQ ID NO:18所示的探针分别与羧基化荧光编码微球结合，制得包被微球；3)将扩增产物与包被微球杂交，染色、检测荧光信号。
进一步的，待测样品可以是病毒培养物、动物组织或鼻咽部分泌物等，但不限于此。
采用本发明的探针及引物组，进行一次检测，能够同时检测引起呼吸道感染的病原体并进行分型，可以快速将新型冠状病毒，包括Alpha株、Beta株、Delta株、Omicron株与甲型、乙型流感病毒进行分型，为疾病的防控做充分的准备；也可以分流一部分由于普通季节性感冒引起发热的患者，减少医疗资源的浪费，降低患者和社会的心理负担。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，进行一次检测，能同时快速检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒，操作方便，不受干扰物质影响，且具有良好的灵敏性和特异性。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组，包括针对新型冠状病毒N基因的第一引物探针组、针对新型冠状病毒ORF1ab基因的第二引物探针组、针对新型冠状病毒S基因的第三引物探针组、针对甲型流感病毒M基因的第四引物探针组、针对乙型流感病毒NS基因的第五引物探针组、针对人类看家基因ACTB基因的第六引物探针组，具体的引物和探针序列如下表1所示：
表1
实施例2
上述实施例1的引物探针组采用试剂盒技术检测新型冠状病毒和流感病毒病原体的验证实验。包括如下步骤：
(1)多重PCR：用合成的标准品质粒为模板，按照以下体系进行多重PCR反应：2×SuperPlex Premix 12.5μl，新型冠状病毒N基因、新型冠状病毒ORF1ab基因、新型冠状病毒S基因、甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因和人类看家基因ACTB基因的混合引物各0.5μl，模板1μl/种，用无菌去离子水补足至25μl。反应条件为95℃2min；95℃15s，56℃30s，72℃30s，40个循环；72℃5min。
分别将上述6对引物的上下游引物浓度进行配比，F:R＝1:10μmol/L，1.25:10μmol/L，1.67:10μmol/L，2.5:10μmol/L，5:10μmol/L，10:10μmol/L，确定多重PCR混合引物浓度为SC2-N-F:R＝1.25:10μmol/L，SC2-ORF1ab-F:R＝1.25:10μmol/L，SC2-S-F:R＝1:10μmol/L，IAV-M-F:R＝1:10μmol/L，IBV-NS-F:R＝1.25:10μmol/L，H-ACTB-F:R＝1:10μmol/L。
(2)微球的活化及核酸探针偶联：随机选取23、35、43、52、57和62号羧基化荧光编码微球，分别包被新型冠状病毒N基因、新型冠状病毒ORF1ab基因、新型冠状病毒S基因、甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因和人类看家基因ACTB基因的探针，标记为23-SC2-N-P、35-SC2-ORF1ab-P、43-SC2-S-P、52-IAV-M-P、57-IBV-NS-P和62-H-ACTB-P。参照Luminex公司的操作说明书，微球用量为200μl，100pmol/μl氨基化修饰的探针用量为40μl。
(3)液相芯片检测：用微球工作液重悬偶联的探针混合液；在样品孔中加入33μl核酸杂交缓冲液，然后加入10μl混合微球工作液，加入PCR产物7μl，充分混匀后95℃变性5min，37℃杂交30min。将1mg/ml SA-PE用核酸检测缓冲液稀释成4μg/ml，每孔加入25μl，37℃孵育5min；加入37℃预热的终止反应液100μl，置于Luminex仪器上测试，分析样品的荧光信号值(MFI)。
(4)结果判断标准的确立
根据液相芯片的判断标准，结合本实验情况，判断标准设定如下：(1)数据有效性分析：空白对照组的MFI＜100；(2)待测样品分析判断：Cutoff＝250，当MFI＜100时判定为阴性；MFI≥250时判定为阳性；当100≤MFI＜250时为灰度区间，判定为可疑样品，需进行重复实验或采取其他检测方法验证。
具体实验结果如下：
用合成的标准品质粒为模板进行PCR扩增，在PCR反应体系中加入新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒模板，扩增所得的产物进行液相芯片检测，分别检测3次，结果见表2。检测结果显示，多重PCR扩增后结合液相芯片均能对靶基因片段进行准确检测，没有出现不同病毒之间检测结果相互干扰的现象。
表2新型冠状病毒和流感病毒液相芯片检测结果
(5)方法的灵敏度评价
将1×1010拷贝/μl的标准品质粒DNA进行10倍倍比稀释至1×100拷贝/μl，用建立的方法进行检测，评价方法的灵敏度。
表3新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度评价
采用多重PCR结合液相芯片分别检测3次，检测结果显示，新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度为1×104拷贝/反应；多重PCR结合液相芯片检测甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因的灵敏度为1×103拷贝/反应；多重PCR结合液相芯片检测人类看家基因ACTB基因的灵敏度为1×103拷贝/反应。新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度评价结果见表3，甲型流感病毒M基因的灵敏度评价结果见表4。可见，新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度为1×104拷贝/反应；甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因的灵敏度为1×103拷贝/反应，具有良好的灵敏性。
表4甲型流感病毒M基因的灵敏度评价
(6)方法的特异性评价
提取咽拭子样本的DNA或RNA，将RNA反转录成cDNA。以所获得的DNA和cDNA样品为检测模板，用建立的方法进行检测，评价方法的特异性。
采用多重PCR结合液相芯片检测所保存的病毒阳性咽拭子及健康人群咽拭子，分别检测3次，结果见表5。检测结果显示，对于甲型H1N1流感病毒阳性咽拭子样品、乙型流感病毒阳性咽拭子样品，检测结果为阳性。对于冠状病毒229E阳性咽拭子样品、冠状病毒OC43阳性咽拭子样品、人腺病毒阳性咽拭子样品，检测结果为阴性。对于病毒阳性咽拭子样品、健康人群咽拭子样品，人内参基因ACTB检测结果均为阳性。实验结果表明，所建立的液相芯片技术检测新型冠状病毒和流感病毒方法的特异性较好，均能对靶基因片段进行准确检测，没有出现不同病毒之间检测结果相互干扰的现象。
表5新型冠状病毒和流感病毒液相芯片特异性评价检测结果
本实施例采用基于多重PCR和液相芯片技术的新型冠状病毒和流感病毒检测方法，各靶标基因的上下游引物采用了不同的浓度，达到有效扩增且降低检测干扰的效果。能够同时对新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒进行检测。方法具有良好的灵敏性和特异性，新型冠状病毒N基因、ORF1ab基因、S基因的灵敏度为1×104拷贝/反应；甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒NS基因的灵敏度为1×103拷贝/反应，能对靶基因片段进行准确检测，没有出现不同病毒之间检测结果相互干扰的现象。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组，其特征在于：包括第一引物探针组、第二引物探针组、第三引物探针组、第四引物探针组、第五引物探针组、第六引物探针组；
所述第一引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的第一上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第一下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第一探针；所述第二引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第二上游引物、核苷酸序列如SEQID No.5所示的第二下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的第二探针；所述第三引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的第三上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的第三下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的第三探针；所述第四引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的第四上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的第四下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的第四探针；
所述第五引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.13所示的第五上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.14所示的第五下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.15所示的第五探针；
所述第六引物探针组包括核苷酸序列如SEQ ID No.16所示的第六上游引物、核苷酸序列如SEQ ID No.17所示的第六下游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.18所示的第六探针。
2.根据权利要求1所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组，其特征在于：所述第一下游引物、第二下游引物、第三下游引物、第四下游引物、第五下游引物、第六下游引物的5’端有生物素标记，所述第一探针、第二探针、第三探针、第四探针、第五探针、第六探针的5’端结合添加10个poly(T)，并修饰C6氨基化。
3.如权利要求1或2所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组在制备病毒检测的试剂盒中的应用，所述病毒至少包括新型冠状病毒SARS-CoV-2。
4.根据权利要求3所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组在制备病毒检测的试剂盒中的应用，所述病毒还包括甲型流感病毒IAV、乙型流感病毒IBV中的至少一种。
5.检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1或2所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的引物探针组、荧光编码微球和助剂。
6.根据权利要求5所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒，其特征在于：
所述第一上游引物、第一下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第二上游引物、第二下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第三上游引物、第三下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第四上游引物、第四下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第五上游引物、第五下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L；
所述第六上游引物、第六下游引物的浓度分别为1-10μmol/Lμmol/L、5-10μmol/L。
7.根据权利要求6所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒，其特征在于：
所述第一上游引物、第一下游引物的浓度分别为1.25μmol/L、10μmol/L；
所述第二上游引物、第二下游引物的浓度分别为1.25μmol/L、10μmol/L；
所述第三上游引物、第三下游引物的浓度分别为1μmol/L、10μmol/L；
所述第四上游引物、第四下游引物的浓度分别为1μmol/L、10μmol/L；
所述第五上游引物、第五下游引物的浓度分别为1.25μmol/L、10μmol/L；所述第六上游引物、第六下游引物的浓度分别为1μmol/L、10μmol/L；
所述新型冠状病毒包括新型冠状病毒SARS-CoV-2，所述病毒还包括甲型流感病毒IAV、乙型流感病毒IBV中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的检测新型冠状病毒和流感病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含定量标准品和PCR反应液。
9.一种用于以非诊断目的检测引起呼吸道感染的病原体并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1)以待测样品cDNA为模板，将核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示的引物混合，经PCR获得扩增产物；
2)将核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:18所示的探针分别与羧基化荧光编码微球结合，制得包被微球；
3)将扩增产物与包被微球杂交，染色、检测荧光信号。
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