CN110945146B

CN110945146B - 检测人类免疫缺陷病毒(hiv)的测定法

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Publication number: CN110945146B
Application number: CN201880044507.3A
Authority: CN
Inventors: J·威特里克; S·黄; T·克鲁平斯基; J·卡拉维蒂斯; J·萨利特罗; A·索博尔
Original assignee: Abbott Molecular Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2018-10-02
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2038-10-02
Also published as: EP3628059B1; WO2019070731A1; ES2944360T3; EP3628059A1; US20190100812A1; US11136631B2; CN110945146A; CA3068498A1

Abstract

本公开涉及用于扩增和检测样品中的大量不同类型的人类免疫缺陷病毒‑1(HIV‑1)的方法、试剂盒和组合物。该方法、试剂盒和组合物采用扩增整合酶(INT)基因的特定引物对和扩增长末端重复(LTR)区域的特定引物对。该方法、试剂盒和组合物也可采用具有荧光团标记和猝灭剂的双探针系统。

Description

检测人类免疫缺陷病毒(HIV)的测定法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月3日提交的美国临时专利申请62/567,655的权益，该临时专利申请通过引用并入本文。

以电子方式提交的援引加入的材料

通过引用整体并入本文的是与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其标识如下：一个10,075字节ASCII(文本)文件，文件名为“36072WO1ORD_ST25.txt”，于2018年10月2日创建。

发明背景

人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体(Barre-Sinoussi等人，Science，220：868-871(1983)；Popovic等人，Science，224：497-500(1984)；和Gallo等人，Science，224：500-503(1984))。HIV可以通过性接触、暴露于被感染的血液或血液制品或从被感染的母亲传播给胎儿来传播(Curran等人，Science，239：610-616(1988))。HIV有两种主要类型：HIV-1和HIV-2。在世界范围内，HIV-1是主要的HIV类型，约占全球所有感染的95％。相对罕见的HIV-2病毒集中在西非，但在其他国家也已见过。与HIV-1相比，HIV-2的传染性较小且进展较慢，从而导致较少的死亡。据估计，HIV-2与HIV-1的遗传差异超过55％(参见例如Campbell-Yesufu，O.T.和R.T.Ghandi，Clin.Infect.Dis.，52(6)：780-7(2011)；和Nyamweya等人，Rev.Med.Virol.，23(4)：221-40(2013))。

以流感样症状为特征的急性HIV综合征在初次感染后三至五周发展，并伴有高病毒血症(Daar等人，New Engl.J.Med.，324：961-964(1991)；和Clark等人，NewEngl.J.Med.，324：954-960(1991))。在症状发作后的四到六周内，可以检测到HIV特异性免疫反应(Albert等人，AIDS，4：107-112(1990)；和Horsburgh等人，Lancet，334：637-640(1989))。血清转化后，外周血中的病毒载量下降，大多数患者进入无症状期，可持续数年(Pantaleo等人，New Engl.J.Med.，328：327-335(1993))。外周血中HIV水平的定量测量极大地有助于理解HIV感染的发病机理(Hoe等人，Nature，373：123-126(1995)；和Wei等人，Nature，373：117-122(1995))，并已显示出它是HIV感染者的预后和处理中的重要参数(Mellors等人，Science，272：1167-1170(1996)；Mellors等人，Ann.Intern.Med.，126(12)：946-54(1997)；Chene等人，Lancet，362：679-86(2003)；Egger等人，Lancet，360：119-29(2002)；Wood等人，J.Infect.Dis.，188：1421-1425(2003)；和U.S.Department of Healthand Human Services，Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1Infected Adults and Adolescents(July 2016))。通过监测血浆HIV RNA水平(病毒载量)、CD4+ T细胞计数和患者的临床状况来指导有关开始或改变抗逆转录病毒疗法的决定(U.S.Department of Health and Human Services，Guidelines for the Use ofAntiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescents(July 2016)；和Yeni等人，JAMA，292：251-265(2004))。抗逆转录病毒疗法的目标是将血浆中的HIV病毒减少到可用病毒载量测试的可检测水平以下(U.S.Department of Health and HumanServices，Guidel ines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 InfectedAdults and Adolescents(July 2016；Perelson等人，Nature，387(6629)：188-191(1997))。血浆中的HIV RNA水平可以通过核酸扩增或信号扩增技术定量(Mulder等人，J.Clin.Microbiol.，32：292-300(1994)；Dewar等人，J.Inf.Diseases，170：1172-9(1994)；和Van Gemen等人，J.Virol.Methods，43：177-87(1993))。现有的许多针对HIV的核酸检测(NAT)都使用单个探针来检测和定量HIV RNA。但是，由于HIV的突变率很高，由于目标区域内的累积突变，这种单探针检测方法可能导致定量不足或检测不到某些罕见HIV变异。核酸测试通常也使用液体形式提供的PCR试剂进行，需要冷冻保存和分批测试，并且样品制备和实时PCR的处理时间可能会超过几个小时。

因此，仍然存在对以消除或减少存储需求和PCR试剂浪费并且快速进行的形式提供的更可靠的HIV检测方法和系统的需要。本公开提供这样的方法和系统。

发明内容

本公开提供用于扩增和检测样品中的一个或多个人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)核酸序列的寡核苷酸序列的组，其包括：(a)扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：1的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列和探针寡核苷酸序列，和(b)扩增和检测HIV-1长末端重复(LTR)区域的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：5的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：6的反向引物寡核苷酸序列、第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列，其中每个探针寡核苷酸序列包含可检测的标记和/或猝灭剂部分。还提供使用前述寡核苷酸的组检测样品中HIV-1的方法。

本公开还提供用于检测样品中人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的试剂盒，其包括：(a)扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：1的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列和探针寡核苷酸序列，和(b)扩增和检测HIV-1长末端重复(LTR)区域的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：5的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：6的反向引物寡核苷酸序列、第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列，(c)用于扩增和检测核酸序列的试剂；和(d)使用说明，其中每个探针寡核苷酸序列包含可检测的标记和/或猝灭剂部分。

本公开提供用于检测样品中人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的组合物，其包括：(a)扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：1的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列和探针寡核苷酸序列，和(b)扩增和检测HIV-1长末端重复(LTR)区域的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：5的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：6的反向引物寡核苷酸序列、第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列。

附图说明

图1是显示ALINITY m^TM HIV-1检测极限(LOD)的图，其绘制了对于所有组合批次观察到的和拟合的概率对浓度。

图2是显示ALINITY m^TM HIV-1线性的图，其绘制了所有小组成员的线性和非线性回归。

图3是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1小组成员的最小二乘回归图。

图4是ALINITY m^TM HIV-1 M组A亚型所有小组成员的线性和非线性回归图的图。

图5是ALINITY m^TM HIV-1 M组BF亚型所有小组成员的线性和非线性回归图的图。

图6是ALINITY m^TM HIV-1 M组C亚型所有小组成员的线性和非线性回归图的图。

图7是ALINITY m^TM HIV-1 M组AG亚型所有小组成员的线性和非线性回归图的图。

图8是ALINITY m^TM HIV-1 M组F亚型所有小组成员的线性和非线性回归图的图。

图9是ALINITY m^TM HIV-1 M组G亚型所有小组成员的线性和非线性回归图的图。

图10是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组A亚型小组成员的线性最小二乘回归图的图。

图11是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组BF亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图12是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组C亚型小组成员除去离群值(outlier)的线性最小二乘回归图。

图13是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组D亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图14是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组AE亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图15是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组AG亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图16是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组F亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图17是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组G亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图18是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组H亚型小组成员的线性最小二乘回归图。

图19是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 N组小组成员的线性最小二乘回归图。

图20是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 O组小组成员的线性最小二乘回归图。

图21是线性范围内ALINITY m^TM HIV-1 M组A、B、BF、C、D、AE、AG、F、G、H亚型、N组和O组小组成员的合并最小二乘回归图。

图22是显示线性范围内使用ALINITY m^TM HIV-1的M组A、B、BF、C、D、AE、AG、F、G、H亚型、N组和O组的每个小组成员的平均值和来自各个数据点的回归线的图。

具体实施方式

本公开提供用于扩增和检测样品中的人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的寡核苷酸的组。本文所用的术语“寡核苷酸”是指包含约2至约100个核苷酸(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100个核苷酸，或任何上述值定义的范围)的短核酸序列。本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。该术语包括等价的由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸例如甲基化和/或加帽的多核苷酸制成的RNA或DNA的类似物。核酸通常通过磷酸酯键连接形成核酸序列或多核苷酸，但是在本领域中许多其他键是已知的(例如硫代磷酸酯、硼酸磷酸酯等)。

寡核苷酸可以是单链或双链，或可以包含双链和单链序列的一部分。寡核苷酸可以是DNA(基因组和互补DNA(cDNA))、RNA或杂合体，其中核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。寡核苷酸可通过化学合成方法或重组方法获得。特定的寡核苷酸序列可以包括其保守修饰的变体(例如，密码子取代)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。

引物和探针寡核苷酸

寡核苷酸在生物技术中有多种应用，例如人工基因合成、作为聚合酶链反应(PCR)引物、在DNA测序中和作为分子探针。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸可用作核酸扩增的引物或核酸杂交和检测的探针。本文所用的术语“引物”、“引物序列”和“引物寡核苷酸”是指当在核苷酸和核酸聚合试剂(例如，DNA依赖性或RNA依赖性聚合酶)存在下置于合适的扩增条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)下时，能够充当作为核酸(所有类型的DNA或RNA)的互补链的引物延伸产物的合成的起始点的寡核苷酸。引物可以是单链或双链的。如果是双链的，则可以在用于制备延伸产物之前首先对引物进行处理(例如变性)以使其链分离。这种变性步骤通常使用加热进行，但是也可以使用碱进行，然后中和。本公开内容的引物可以具有任何合适的大小，并且理想地包含约15至50个核苷酸、约20至40个核苷酸或约22至30个核苷酸，基本由其组成或由其组成。除了本文所述的那些之外，本公开内容的引物还可包含其他核苷酸。例如，取决于所采用的扩增过程的类型，引物可包括例如靶结合序列的5′限制性核酸内切酶识别位点(参见例如美国专利5,270,184和5,455,166)，或与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子。“正向引物”是与靶核酸序列(例如，模板链)杂交(或退火)以进行扩增的引物。“反向引物”是在扩增过程中与靶序列的互补链杂交(或退火)的引物。正向引物相对于反向引物与靶序列5′杂交。

术语“探针”、“探针序列”和“探针寡核苷酸”是指可以在适当的扩增条件下选择性地与靶序列的至少一部分选择性杂交的寡核苷酸(例如，已经被扩增的靶序列的一部分)。通常，探针序列被鉴定为“互补”(即，与编码或有义链(+)互补)或“反向互补”(即，与反义链(-)互补)。探针可以是单链或双链的。如果是双链的，则探针寡核苷酸序列包括包含可检测的标记的第一核酸序列和包含猝灭剂部分的第二核酸序列，如美国专利9,388,455中所述。本公开内容的探针可以具有任何合适的大小，并且理想地包含约10-50个核苷酸、约12-35个核苷酸或约14-25个核苷酸，基本由其组成或由其组成。

本文使用的术语“组”、“引物组”、“探针组”和“引物和探针组”是指它们一起能够引发目的靶序列或目的靶核酸(例如HIV-1内的靶序列)的两种或多种寡核苷酸引物和/或至少一种能够检测靶序列或靶核酸的探针。在某些实施方案中，术语“引物组”是指一对引物，其包括与要扩增的靶序列或靶核酸的5′末端杂交的正向引物(或5′(上游)引物)和与待扩增的靶序列或靶核酸的互补序列杂交的反向引物(或3′(下游)引物)。这样的引物组或引物对在PCR扩增反应中特别有用。

本文所述的寡核苷酸组可用于扩增样品中的一个或多个靶HIV-1核酸序列。术语“靶序列”和“靶核酸”在本文可互换使用，并且是指特定核酸序列，其存在或不存在将通过所公开的方法检测。在本公开的上下文中，靶序列优选包括一种或多种引物将与之杂交并从其起始扩增的核酸序列。靶序列还可以包括探针杂交区域，探针可以在适当的扩增条件下与之形成稳定的杂交体。靶序列可以是单链或双链的，并且可以扩增和检测多于一个的靶序列。本文所述的引物和探针序列可以靶向HIV-1基因组中存在的任何合适的核酸序列或序列的组合。

HIV-1由两个拷贝的非共价连接的，未剪接的，正义的单链RNA组成，并被一个由病毒蛋白p24组成的圆锥形衣壳包围，其为典型的慢病毒(Montagnier，Luc.，HumanImmunodeficiency Viruses(Retroviridae).Encyclopedia of Virology (2nd Ed.)，pp.763-774(1999)；和Lu等人，J.Mol.Biol.，410(4)：609-633(2011))。HIV-1的整合形式，也称为原病毒，长度约为9.8kb(Muesing等人，Nature，313(6002)：450-458(1985))。前病毒的两端侧接被称为长末端重复序列(LTR)的重复序列。HIV-1基因位于原病毒DNA的中央区域，并编码至少9种蛋白质(Gallo等人，Nature，333(6173)：504(1988))，所述蛋白质分为三类：结构蛋白、调节蛋白和辅助蛋白。主要的结构蛋白包括Gag、Pol和Env，而Gag和Pol蛋白最初翻译为Gag-Pol多蛋白。Gag是编码病毒衣壳成分的多蛋白。Pol多蛋白编码逆转录酶(RT)、整合酶(INT)和蛋白酶(PR)，后者将病毒RNA逆转录成双链DNA，将病毒基因组整合到宿主细胞的染色体中，并将Gag-Pol-衍生的蛋白质分别切割成为功能性多肽。Env蛋白是参与病毒附着和融合至靶细胞的包膜蛋白。HIV-1调节蛋白包括Tat和Rev，而HIV-1辅助蛋白包括Vpu、Vpr、Vif和Nef。

本文所述的寡核苷酸组可包含任何数目的引物和探针寡核苷酸，基本上由其组成或由其组成，以便扩增和检测任何合适数目的HIV核酸序列。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸组包含以下、基本上由其组成或由其组成：扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的至少一部分的引物和探针组，以及扩增的引物和探针组，并检测至少一部分HIV-1长末端重复序列(LTR)，以产生两个HIV-1扩增子。核酸序列的“部分”包含至少十个核苷酸(例如，约10至约5000个核苷酸)。优选地，核酸序列的“部分”包含10个或更多(例如15个或更多，20个或更多，25个或更多，30个或更多，35个或更多，40个或更多，45个或更多，50个或更多，或100个或更多)核苷酸，但少于5,000个(例如4900个或更少，4000个或更少，3000个或更少，2000个或更少，1000个或更少，800个或更少，500个或更少，300个或更少或100个或更少))核苷酸。本文使用的术语“扩增子”是指天然或人工扩增反应的产物。

在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸组包含以下、基本上由其组成或由其组成：(a)扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQID NO：1的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列和探针寡核苷酸序列，和(b)扩增和检测HIV-1长末端重复(LTR)区域的至少一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：5的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：6的反向引物寡核苷酸序列、第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列。在一个实施方案中，扩增和检测HIV-1 INT基因的一部分的引物和探针组的探针寡核苷酸是双链的，并且包括包含可检测的标记的第一核酸序列和包含猝灭剂部分的第二核酸序列(如美国专利9,388,455中所述)。例如，包含可检测的标记的第一核酸序列可包含SEQ ID NO：3，而包含猝灭剂部分的第二核酸序列可包含SEQ ID NO：4。在另一实施方案中，扩增和检测HIV-1 LTR的一部分的引物和探针组的第一和第二探针寡核苷酸序列中也是双链的，并且各自包括包含可检测的标记的第一核酸序列和包含猝灭剂部分的第二核酸序列。例如，第一探针寡核苷酸序列可包括SEQID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列，第二探针寡核苷酸序列可包括SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10的核酸序列。前述寡核苷酸组也称为ALINITY m^TM HIV-1。

与其他检测和定量单个HIV-1靶序列(例如Abbott REALTIME HIV-1测定法(Abbott Molecular，Inc.，Des Plaines，IL；和HIV-1病毒载量测定法(Cepheid，Sunnyvale，CA))市售可得的HIV-1核酸测试相反，本文所述的寡核苷酸组包含“双靶”设计。在某些情况下，此类“单靶”检测系统的样品制备和实时PCR的周转时间可能超过六个小时。相反，本文描述的寡核苷酸组允许在大约两个小时内进行样品到结果的分析。另外，如上所述，本文所述的寡核苷酸组增强了HIV-1检测的可靠性，因为该寡核苷酸组扩增并检测了HIV-1基因组的两个分开的区域而不是单个区域。

替代地或另外地，扩增和检测HIV-1 INT基因的一部分的引物和探针组可以包含正向引物寡核苷酸序列，该正向引物寡核苷酸序列包含以下序列中的任何一个或基本上由其组成：SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，或SEQ ID NO：36。同样地，扩增和检测HIV-1 INT基因的一部分的引物和探针组可以替代地或另外地包含反向引物寡核苷酸序列，该正向引物寡核苷酸序列包含以下序列中的任何一个或基本上由其组成：SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，或SEQID NO：42。

替代地或另外地，扩增和检测HIV-1 LTR的一部分的引物和探针组的第一或第二探针寡核苷酸可包含SEQ ID NO：43和/或SEQ ID NO：44。在另一个实施方案中，扩增和检测HIV-1 LTR区域的一部分的引物和探针组可以包含以下、基本上由其组成或由其组成：包含SEQ ID NO：45的正向引物寡核苷酸序列，包含SEQ ID NO：46的第一反向引物寡核苷酸序列，包含SEQ ID NO：47的第二反向引物寡核苷酸序列和包含SEQ ID NO：48的探针寡核苷酸序列。在另一替代的实施方案中，扩增和检测HIV-1 LTR区域的一部分的引物和探针组可以包含以下、基本上由其组成或由其组成：包含SEQ ID NO：49的正向引物寡核苷酸序列，包含SEQ ID NO：50的反向引物寡核苷酸序列，包含SEQ ID NO：51的第一探针寡核苷酸序列和包含SEQ ID NO：52的第二探针寡核苷酸序列。

可以以任何合适的方式修饰本文描述的寡核苷酸的任何一种或组合，以稳定或增强引物或探针寡核苷酸与其靶标的结合亲和力(也称为“解链温度”或“T_m”)。在这方面，本文所述的寡核苷酸序列可包含一个或多个修饰的寡核苷酸碱基。例如，寡核苷酸序列可以包含一个或多个丙炔修饰的碱基，其中寡核苷酸包含化学式为CH₃C≡CH的炔烃。一个或多个丙炔修饰的碱可包括例如5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷(pdU)和/或5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷(pdC)。

本文描述的任何寡核苷酸序列可包含由本文公开的任何序列的互补物、基本上由其组成或由其组成。本文所用的术语“互补”或“互补序列”是指通过Watson-Crick碱基配对规则与本文所述的寡核苷酸形成稳定双链体的核酸序列，并且通常共有约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％或更高的与所公开的寡核苷酸的同一性。核酸序列同一性可以使用本领域已知的任何合适的数学算法或计算机软件来确定，例如，CLUSTAL-W、T-Coffee和ALIGN(用于核酸和氨基酸序列的比对)、BLAST程序(例如，BLAST 2.1、BL2SEQ及其更高版本)和FASTA程序(例如，FASTA3×、FASTM和SSEARCH)(用于序列比对和序列相似性搜索)。序列比对算法还公开于例如Altschul等人，J.MolecularBiol.，215(3)：403-410(1990)；Beigert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，106(10)：3770-3775(2009)，Durbin等人，eds.，Biological Sequence Analysis：Probalistic Models ofProteins and Nucleic Acids，Cambridge University Press，Cambridge，UK(2009)；Soding，Bioinformatics，21(7)：951-960(2005)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402(1997)；和Gusfield，Algorithms on Strings，Trees and Sequences，Cambridge University Press，Cambridge UK(1997))。

可以使用任何合适的方法来制备本文所述的寡核苷酸，所述方法的多种在本领域中是已知的(例如参见Sambrook等人，Molecular Cloning.ALaboratory Manual，1989，2.Supp.Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press：New York，N.Y.；M.A.Innis(Ed.)，PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press：New York，N.Y.(1990)；P.Tijssen，Hybridization with Nucleic Acid Probes-LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(Parts I and II)，ElsevierScience(1993)；M.A.Innis(Ed.)，PCR Strategies，Academic Press：New York，N.Y.(1995)；F.M.Ausubel(Ed.)，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons：Secaucus，N.J.(2002)；Narang等人，Meth.Enzymol.，68：90-98(1979)；Brown等人，Meth.Enzymol.，68：109-151(1979)；和Belousov等人，Nucleic Acids Res.，25：3440-3444(1997))。引物对也可以使用多种工具进行设计，例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的Primer-BLAST工具。寡核苷酸合成可以在寡核苷酸合成仪上进行，例如可从PerkinElmer/Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)、DuPont(Wilmington，DE)或Milligen(Bedford，MA)商购获得的寡核苷酸合成仪。替代地，寡核苷酸可以被定制和从本领域众所周知的多种商业来源获得，包括例如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)、Eurofins Scientific(Louisville，KY)、BioSearch Technologies，Inc.(Novato，CA)等。寡核苷酸可以使用本领域已知的任何合适方法来纯化，例如天然丙烯酰胺凝胶电泳、阴离子交换HPLC(参见例如Pearson等人，J.Chrom.，255：137-149(1983))和反相HPLC(参见例如McFarland等人，Nucleic Acids Res.，7：1067-1080(1979))。

可以使用本领域已知的任何合适的测序方法来验证引物和探针的序列，包括但不限于化学降解(参见例如Maxam等人，Methods of Enzymology，65：499-560(1980))、基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法(参见例如Pieles等人，Nucleic AcidsRes.，21：3191-3196(1993))，随后进行质谱分析碱性磷酸酶和核酸外切酶消化的组合(Wu等人Anal.Biochem.，290：347-352(2001))等。

本文所述的引物和探针寡核苷酸理想地包含在45℃至80℃范围内的解链温度(T_M)。根据本公开内容，寡核苷酸与靶HIV-1核酸序列特异性杂交而不与非HIV-1核酸的显著杂交。另外，选择寡核苷酸以使其与HIV-1基因组中的保守区域杂交，从而使与靶序列的错配最小化。该选择确保了寡核苷酸能够与来自所有组和亚型的HIV-1核酸杂交。此外，选择寡核苷酸以使得它们显示出形成二聚体的可能性最小并且包含最少的序列重复。这样的性质可以通过本领域已知的方法来确定，例如使用计算机建模程序引物分析软件(由National Biosciences，Inc.，Plymouth，MN发布)。

可检测的标记

本文所述的引物和探针寡核苷酸序列中的任何一个或多个可以包含可检测的标记，使得在结合到另一实体(例如，扩增产物或扩增子)之后可以可视化引物和/或探针。本文使用的术语“可检测的标记”是指产生信号的部分或化合物，该信号可以被测量并且其强度与结合于其上的实体的量有关(例如，成比例)。可以使用可以缀合或连接至寡核苷酸以检测寡核苷酸与靶序列的结合的任何合适的可检测的标记，其中许多是本领域已知的。在一个实施方案中，可检测的标记可以被间接检测。可间接检测的标记通常是与“缀合物”结合使用的特异性结合成员，所述“缀合物”附接或偶联至可直接检测的标记。用于合成此类缀合物的偶联化学在本领域中是众所周知的，并且被设计为使得特异性结合成员的特异性结合特性和标记的可检测特性保持完整。本文使用的“特异性结合成员”和“缀合物”是指结合对的两个成员，即两个不同的分子，其中特异性结合成员特异性结合本发明的多核苷酸，并且“缀合物”特异性结合到特定的结合成员。该对的两个成员之间的结合通常本质上是化学或物理的。此类结合对的实例包括但不限于抗原和抗体、抗生物素蛋白/链霉亲和素和生物素、半抗原和对半抗原特异的抗体、互补核苷酸序列、酶辅因子/底物和酶等。

在另一个实施方案中，可检测的标记可以被直接检测。这样的可直接检测的标记包括，例如，放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒、嵌入染料(例如SYBR Green或溴化乙锭)等。在一个实施方案中，可检测的标记可以是荧光团，例如荧光素家族染料、多卤代荧光素家族染料、六氯荧光素家族染料、香豆素家族染料、罗丹明家族染料、菁家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪族染料、方酸族染料、螯合镧系族染料、偶氮族染料、三苯基甲烷族染料或族染料。荧光团的实例包括但不限于FAM^TM、HEX^TM、JOE^TM、NED^TM/>ROX^TM、TAMRA^TM、TET^TM、TEXAS/>和/>本领域技术人员将理解，可直接检测的标记可能需要其他成分，例如底物、触发试剂、光等，以能够检测标记。标记寡核苷酸如探针的方法是本领域众所周知的，并描述于例如L.J.Kricka，Ann.Clin.Biochem.，39：114-129(2002)；van Gijlswijk等人，Expert Rev.Mol.Diagn.，1：81-91(2001)；Joos等人，J.Biotechnol.，35：135-153(1994)；Smith等人，Nucl.Acids Res.，13：2399-2412(1985)；Connoly等人，Nucl.Acids.Res.，13：4485-4502(1985)；Broker等人，Nucl.Acids Res.，5：363-384(1978)；Bayer等人，Methods of Biochem.Analysis，26：1-45(1980)；Langer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：6633-6637(1981)；Richardson等人，Nucl.Acids Res.，11：6167-6184(1983)；Brigati等人，Virol.，126：32-50(1983)；Tchen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3466-3470(1984)；Landegent等人，Exp.Cell Res.，15：61-72(1984)；A.H.Hopman等人，Exp.Cell Res.，169：357-368(1987)；和Temsamani等人，Mol.Biotechnol.，5：223-232(1996)。

在另一个实施方案中，本文所述的引物和探针寡核苷酸序列中的任何一个或多个也可以包含猝灭剂部分。当可检测的标记(例如，荧光团)和猝灭剂部分紧密靠近时，例如在探针的末端，猝灭剂部分阻止了来自可检测的标记的信号(例如，荧光)的检测。当两个部分物理分离时，例如在被DNA聚合酶切割后，该信号变得可检测。猝灭剂可以选自本领域已知的任何合适的淬灭剂，例如BLACK HOLE1/>BLACK HOLE2/>BLACK HOLE/>BLACKHOLE/>IOWA/>FQ和IOWA/>RQ。例如，寡核苷酸探针可包含FAM荧光团和BHQ-1dT猝灭剂或BHQ-2dT猝灭剂。

用于扩增和检测本文描述的HIV-1核酸序列的寡核苷酸序列组中的每个探针寡核苷酸序列理想地包含可检测的标记。每个探针可以用相同的可检测的标记或不同的可检测的标记进行标记。当探针包含相同的可检测的标记(例如FAM)时，在实时PCR期间将HIV INT基因部分和LTR区的扩增检测为单个信号。当每个探针包含不同的可检测的标记时，HIVINT基因和LTR区的扩增被检测为两个单独的信号。

具体标记技术的选择取决于多个因素，例如标记方法的简便性和成本，所使用的不同可检测的标记之间的光谱间隔，所需样品标记的质量，可检测部分对杂交反应的影响((例如，关于杂交过程的速率和/或效率)，所用扩增方法的性质，检测系统的性质，由可检测的标记产生的信号的性质和强度等。

内对照

本文描述的用于检测HIV-1的寡核苷酸组可以进一步包含用于扩增和检测内对照(IC)序列的引物和探针寡核苷酸序列。在一个实施方案中，将内对照序列添加到每个样品制备反应中。然后通过整个样品制备和扩增程序以及测试样品和校准品(如果有)对内对照进行处理，以证明正确的样品处理和测定的有效性。内对照可以是任何合适的非HIV核酸序列，包括例如编码GAPDH、β2-乳球蛋白、β-肌动蛋白、R18或16S RNA的核酸序列。在一些实施方案中，内对照理想地包含装甲RNA靶序列、基本上由其组成或由其组成。本文使用的术语“装甲RNA”是指耐RNase的RNA，它是MS2噬菌体外壳蛋白与大肠杆菌(Escherichia coli)中通过诱导编码外壳蛋白和RNA标准序列的表达质粒而产生的RNA的复合体(参见例如Pasloske等人，J.Clin.Microbiol.，36(12)：3590-359(1998)；和美国专利5,677,124，5,919,625和5,939,262)。在一个实施方案中，例如，内对照可以包含衍生自或获得自南瓜植物西葫芦(Curcurbita pepo)的羟基丙酮酸还原酶基因的RNA序列。就这一点而言，本文所述的寡核苷酸组可进一步包括包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54的内对照正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：12的内对照反向引物寡核苷酸序列和包含SEQ IDNO：13的内对照探针寡核苷酸序列。内对照探针理想地包含可检测的标记，例如本文所述的那些。在一个实施方案中，内对照探针可以包含与用于检测HIV-1的探针不同的标记，其允许在同一反应中同时检测和区分内对照和HIV扩增产物。内对照探针还可包含猝灭剂部分，例如本文所述的那些。

HIV-1的扩增和检测方法

本公开提供一种用于在怀疑含有人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的样品中检测HIV-1的方法。该方法包括：(a)使从人获得的样品与本文所述的寡核苷酸序列的组和用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，(b)扩增样品中存在的HIV-1 INT基因的一部分和HIV-1 LTR的一部分，将检测HIV-1 INT基因的一部分的探针寡核苷酸与HIV-1 INT基因的扩增部分杂交，和/或将检测HIV-1 LTR区域的一部分的第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与HIV-1 LTR区域的扩增部分杂交，(d)通过来自可检测的标记中的每一种的信号来检测探针寡核苷酸序列与HIV-1 INT基因和/或LTR区域的部分的杂交，由此(i)来自检测HIV-1INT基因的至少一部分的探针寡核苷酸序列上可检测的标记的信号的存在表明探针寡核苷酸序列与HIV-1 INT基因的一部分的杂交以及样品中HIV-1的存在；和/或(ii)来自第一探针寡核苷酸序列和/或第二探针寡核苷酸序列的信号的存在表明第一探针寡核苷酸序列和/或第二探针寡核苷酸序列与LTR区域的一部分的杂交以及样品中HIV-1的存在，和(iii)信号的不存在表明样品中HIV-1的不存在。关于前述寡核苷酸组的本文所述引物和探针寡核苷酸的描述也适用于所公开方法的那些相同方面。

如果样品是从疑似感染了HIV-1的受试者(最好是人)获得的，则“怀疑”本文定义的样品含有HIV-1。如果受试者的HIV-1风险增加，则怀疑该受试者感染了HIV-1。HIV-1感染的危险因素包括，例如，没有受到保护的性行为、感染另一种性传播疾病(STD)、静脉内吸毒、其为未割包皮的男性、其为同性恋或双性恋的男性以及接受输血(例如参见GlobalFact Sheet：HIV/AIDS I.HIV/AIDS Basics，20^th International AIDS Conference(2014))。

样品能够是从任何合适的受试者获得的任何合适的样品，通常是哺乳动物，例如人。样品可以从任何生物来源获得，例如宫颈、阴道或肛门拭子或刷子、或生理液，包括但不限于全血、血清、血浆、间质液、唾液、眼晶状体液、脑脊液、汗液、尿液、奶、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、阴道液、阴道分泌物、羊水、精液等。可以使用本领域技术人员已知的常规技术从受试者获得样品，并且可以直接使用从生物学来源获得的样品或在进行预处理以改变样品的特性后使用样品。此类预处理可包括例如从血液中制备血浆，稀释粘性液体，过滤，沉淀，稀释，蒸馏，混合，浓缩，干扰组分失活，添加试剂，裂解等。从受试者获得样品后，可将样品与本文所述的寡核苷酸组接触以形成反应混合物。然后将反应混合物置于扩增条件下。如果样品中存在，则引物与HIV-1 INT基因和/或HIV-1 LTR区域内的靶核酸序列杂交，并且样品中存在HIV-1 INT基因和/或HIV-1 LTR区域的一部分得到扩增。

能够使用本领域已知的任何合适的核酸序列扩增方法来扩增样品中的HIV-1核酸序列，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、转录介导扩增(TMA)、滚环扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和连接酶链反应(LCR)。

因为HIV-1包含RNA基因组，所以理想地使用RT-PCR例如实时RT-PCR来扩增HIV-1核酸序列。本文使用的“RT-PCR”是指其中从底物RNA模板合成互补DNA(cDNA)片段的酶促反应。该反应通常涉及使用合成的寡核苷酸引物，该引物与底物RNA中的核苷酸序列互补，并使用逆转录酶。该反应由一个循环组成，其中大量存在的寡核苷酸引物与底物RNA杂交，沿着互补核苷酸序列形成双链结构。然后，引物-底物的DNA：RNA复合物将充当由逆转录酶催化的cDNA合成反应的起始位点，从而合成与RNA链互补的cDNA链。RNA可以是信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、基因组RNA(gRNA)、核糖体RNA(rRNA)或小核RNA(snRNA)。用于RT-PCR的方法和试剂是本领域众所周知的，并且可从多种来源(参见例如Freeman等人，Biotechniques，26(1)：112-122，142-125(1999)；Joyce，C.，Methods Mol.Biol.，193：83-92(2002)；和O’Connell，J.(ed.)，RT-PCR Protocols，1st Ed.，Springer-Verlag，NewYork，NY(2010))商购获得。可以使用本领域中已知的一步或两步技术来进行逆转录，例如，通过使用购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)Qiagen(Hilden，Germany)和Promega Corp.(Madison，WI)的逆转录试剂盒。

本文使用的“实时PCR”是指这样的PCR方法，其中与需在终点分析中检测扩增的DNA产物的常规PCR相比，随着反应的进行，扩增产物的积聚随反应的进行实时测量，并在每个循环后进行定量。实时PCR在本领域中也被称为“定量PCR(qPCR)”。PCR产物的实时检测通常涉及使用非特异性荧光染料，该染料可插入任何双链DNA和序列特异性荧光标记的DNA探针中。实时PCR技术和系统是本领域已知的(参见例如Dorak，M.Tevfik，ed.Real-timePCR.Taylor&Francis(2007)；和Fraga等人，“Real-time PCR，”Current protocolsessential laboratory techniques：10-3(2008))并且可以从各种来源(例如m2000rtREALTIME^TM PCR系统(Abbott Molecular，Inc.，Des Plaines，IL)；CFX Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)；和TAQMAN^TM Real-Time PCR系统(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA))商购获得，可以在本文所述的方法中采用任何一种上述方法。

如果样品中存在HIV-1 INT基因的一部分和/或HIV-1 LTR区域的一部分，则在扩增后，本文所述的方法还包括将检测HIV-1INT基因的一部分的探针寡核苷酸与HIV-1 INT基因的扩增部分杂交，并将检测HIV-1 LTR区域的一部分的第一和/或第二探针寡核苷酸序列与HIV-1 LTR区域的扩增部分杂交。在一个实施方案中，如本文所述，可以使包含HIV INT扩增子和HIV-1 LTR扩增子的反应混合物与寡核苷酸探针接触，所述寡核苷酸探针在严格的杂交和洗涤条件下优先与扩增子的靶核酸序列或其互补序列杂交，从而形成对检测稳定的杂交双链体。本文使用的“杂交”是指由于互补碱基配对而由两个单链核酸形成双链体结构。杂交可以发生在完全互补的核酸链之间，或者是在包含错配较小区域的“基本上互补”的核酸链之间。杂交条件的严格性取决于序列，并且在不同的环境参数下是不同的。因此，导致特定严格程度的杂交条件将根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。为了本公开的目的，“严格条件”包括仅在杂交分子与靶序列之间的错配小于25％时才发生杂交的条件。为了更精确地定义，“严格条件”可以分为特定水平的严格性。因此，本文使用的“中等严格性”条件是指那些具有大于25％的序列错配的分子将不会杂交的条件；“中等严格性”条件是指错配率超过15％的分子不会杂交的条件，“高严格性”条件是错配率大于10％的分子不会杂交的条件。“非常高严格性”的条件是那些错配率超过6％的序列不会杂交的条件。相反，在“低严格性”条件下杂交的核酸包括具有更少的序列同一性或仅在核酸的短亚序列上具有序列同一性的核酸。可以选择严格条件，使其低于特定序列在定义的离子强度pH下的热解链点(T_m)。T_m可以是这样的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)，在平衡(因为靶标序列过量存在，在T_m，50％的探针处于平衡状态)时，50％的与靶标互补的寡核苷酸与靶序列杂交的温度。在公开的方法中可以使用本领域已知的使寡核苷酸探针与靶HIV核酸序列杂交的任何合适的方法和条件。核酸杂交和严格性计算的条件可以在例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4^th Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2012)；Tijssen，Hybridization With Nucleic Acid Probes，Part I：Theory and Nucleic AcidPreparation，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier Science Ltd.，NY，NY，1993和Ausubel等人Short Protocols in MolecularBiology，5th ed.，John Wiley&Sons，Inc.(2002)中找到。

将检测HIV-1 INT基因的一部分的探针寡核苷酸与HIV-1 INT基因的扩增部分杂交和/或将检测HIV-1 LTR区域的一部分的第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与HIV-1 LTR区域的扩增部分杂交之后，该方法包括通过评估来自每个可检测的标记的信号来检测探针寡核苷酸序列与HIV-1 INT基因和/或LTR区域的部分的杂交，从而(i)信号的存在表明探针寡核苷酸序列与HIV-1 INT基因和/或LTR区域的杂交以及样品中HIV-1的存在；并且(ii)信号的缺失表明样品中不存在HIV-1。来自探针寡核苷酸序列的信号的检测可以使用多种众所周知的方法进行，包括例如均质或异质技术。

均质的检测方法包括检测扩增反应产物的形成，即以实时的方式。结果，当反应混合物处于扩增条件下时，形成并检测到扩增产物/探针杂交体。均质的检测方法包括但不限于使用FRET标记(该标记附着在探针上并在存在靶序列的情况下发出信号)、分子信标(参见Tyagi等人，Nature Biotechnol.，14：303-308(1996)；Tyagi等人，Nature Biotechnol.，16：49-53(1998)；Kostrikis等人，Science，279：1228-1229(1998)；Sokol等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：11538-11543(1998)；Marras等人，Genet.Anal.，14：151-156(1999)；和美国专利5,846,726、5,925,517、6,277,581和6,235,504)、测定法(参见例如美国专利5,210,015、5,804,375、5,487,792和6,214,979和国际专利申请公开WO01/86001)和杂交保护测定法(HPA)(其使用标记有吖啶酯(AE)的探针)(参见例如Weeks等人，Clin.Chem.，29：1474-1479(1983)；Berry等人，Clin.Chem.，34：2087-2090(1988))。

异质的检测系统通常使用捕获剂将扩增的序列与反应混合物中的其他材料分离。捕获剂通常包含涂覆有一种或多种特异性结合序列的固体支持材料(例如，微量滴定孔、珠、芯片等)。结合序列可以与添加至本发明的寡核苷酸探针的尾部序列互补。替代地，结合序列可以与捕获寡核苷酸的序列互补，捕获寡核苷酸本身包含与探针的尾部序列互补的序列。从剩余的反应混合物中分离与捕获剂结合的扩增产物/探针杂交体后，可以使用本领域已知或本文所述的任何合适的检测方法来检测扩增产物/探针杂交体。

本文中公开的方法还包括对如上所述检测到的HIV-1 INT基因的部分和/或HIV-1LTR区域的部分进行定量。在这方面，可以使用相对定量方法或绝对定量方法实现实时荧光定量PCR产物的定量(参见例如Dhanasekaran等人，Immunol.Methods，354(1-2)：34-39(2010))。绝对定量可通过使用校准曲线与DNA标准品进行比较来提供目标DNA分子的准确数量，并且要求样品和标准品的PCR具有相同的扩增效率(参见例如Bar等人，NucleicAcids Research，40：gkr778(2011))。相对定量基于内参考基因来确定靶基因表达的倍数差异。相对定量表示为靶序列表达水平的变化，并且不需要校正曲线，因为将靶序列的量与对照参考序列的量进行了比较。

用于扩增和检测HIV-1核酸序列的试剂盒和组合物

本公开还提供用于扩增和检测样品中的HIV-1的试剂盒。该试剂盒包含用于扩增和检测HIV-1 INT基因的一部分和/或HIV-1 LTR区域的一部分的引物和探针，以及用于扩增和检测HIV-1的试剂和说明书。关于上述方法的本文所述引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文所述试剂盒的那些相同方面。试剂盒中包含的合适试剂的实例(除本文所述的寡核苷酸引物和探针外)包括核酸扩增反应中使用的常规试剂，例如一种或多种具有聚合酶活性的酶(例如逆转录酶)、酶辅因子(例如镁或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD))、盐、缓冲液、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸三磷酸(dNTP/rNTP；例如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸阻断剂)试剂、无源参考染料、防腐剂(例如PROCLIN^TM)等。许多这样的试剂在本文中描述或在本领域中以其他方式已知并且可商购。

在一个实施方案中，试剂盒包含以下、基本上由其组成或由其组成：(a)扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：1的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列和探针寡核苷酸序列，和(b)扩增和检测HIV-1长末端重复(LTR)区域的一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：5的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：6的反向引物寡核苷酸序列、第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列，(c)用于扩增和检测核酸序列的试剂；和(d)使用说明，其中每个探针寡核苷酸序列包含可检测的标记和/或猝灭剂部分。

试剂盒可包含用于使用本文所述的扩增试剂以及引物和探针寡核苷酸的说明，例如用于处理测试样品、提取核酸分子和/或进行测试的说明；以及解释所获得的结果以及政府机构规定的形式的通知。此类说明可以选择以印刷形式、在线提供、以CD、DVD或其他格式的记录媒体提供。

本公开还提供用于扩增和检测样品中的HIV-1的组合物。该组合物包含以下、基本上由其组成或由其组成：(a)扩增和检测HIV-1整合酶(INT)基因的一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：1的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列和探针寡核苷酸序列，和(b)扩增和检测HIV-1长末端重复(LTR)区域的一部分的引物和探针组，其包括包含SEQ ID NO：5的正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：6的反向引物寡核苷酸序列、第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列，其中每个探针寡核苷酸序列包含可检测的标记和/或猝灭剂部分。关于上述方法和试剂盒的本文所述引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文所述组合物的那些相同方面。在一些实施方案中，组合物包含载体、优选药学(例如，生理上可接受的)载体。在本公开的上下文中可以使用任何合适的载体，并且这种载体在本领域中是众所周知的。组合物可以任选地是无菌的或无菌的，除了本文所述的寡核苷酸。

如本文所述，前述试剂盒和组合物还可包含扩增和检测内对照核酸序列的引物和探针寡核苷酸。就这一点而言，试剂盒和/或组合物可包括包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54的内对照正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：12的内对照反向引物寡核苷酸序列和包含SEQ ID NO：13和可检测的标记的内对照探针寡核苷酸序列。

试剂盒和/或组合物可以固体(例如冻干)或液体形式提供。在一个实施方案中，将引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和其他试剂冻干(即，冷冻干燥)。如上所述，本领域已知的许多单靶HIV检测系统以液体形式提供PCR试剂，需要冷冻保存和批量测试。然而，本文描述的试剂盒和组合物的各种组分的冻干消除了冷冻保存的需要，并且允许以单位剂量形式递送测定组分，使得使用者可以进行所需数目的测定，从而使试剂浪费最小化。对于每个单独的组分(例如引物寡核苷酸、探针寡核苷酸或缓冲液)，本公开内容的试剂盒的各种组分和组合物可任选地包含在不同容器(例如小瓶、安瓿、试管、培养瓶或瓶子)内。每种组分通常适合以等分试样的形式放在其各自的容器中或以浓缩形式提供。还可以提供适合于进行扩增/检测测定法的某些步骤的其他容器。优选将各个容器密闭保存以用于商业销售。

下列实施例进一步说明了本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例1

该实施例说明了根据本公开的用于扩增和检测样品中的HIV-1的方法。

Abbott Molecular，Inc.(Des Plaines，IL)已经以商标名ALINITY m^TM HIV开发了一种利用实时RT-PCR扩增和检测从人血浆或血清标本中提取的HIV RNA基因组序列的HIV-1检测测定法。该测定法旨在用于：1)通过测量基线HIV-1水平来评估疾病的预后，并通过测量血浆HIV-1 RNA水平的变化来评估对抗逆转录病毒治疗的病毒反应；2)作为诊断测试，以帮助诊断HIV-1感染并确认来自在HIV免疫测定中具有重复的反应结果的个体的血浆或血清中HIV-1感染。

ALINITY m^TM HIV-1测定法由样品制备、RT-PCR组装、扩增/检测以及结果计算和报告组成。ALINITY m^TM HIV-1测定法程序的所有阶段均由ALINITY m^TM仪器自动执行。AbbottALINITY m^TM仪器使用ALINITY m^TM RNA样品制备试剂盒、ALINITY m^TM裂解液和ALINITY m^TM稀释液通过磁性微粒技术自动在仪器上提取人血浆或血清中的HIV-1RNA以促进核酸捕获、洗涤和洗脱。

在ALINITY m^TM HIV-1样品制备过程的开始，内对照的冻干单位剂量(含有装甲RNA序列)通过ALINITY m^TM系统自动重新水合，并输送到每个样品制备反应中。然后通过整个样品制备和RT-PCR程序以及样品、校准物和对照物对内对照进行处理，以证明适当的样品处理和测定的有效性。

然后将25μL纯化的RNA样品与5μL液体激活剂合并，然后将其用于冻干单位剂量的ALINITY m^TMHIV-1RT-PCR预混试剂的冻干。通过混合分子生物学级的水、氯化镁、四甲基氯化铵(TMAC)、氯化钾和ProClin 950制备活化剂溶液。活化剂溶液以液体形式在密封和袋装多孔板中提供，并为RT-PCR反应提供必要的盐，以激活RT-PCR酶并建立最佳的离子强度环境。活化剂溶液的配方示于表1。

表1.活化剂配方

然后将生成的物质转移到反应容器中，用15μL的ALINITY m^TM Vapor BarrierSolution(矿物油)覆盖，并转移到扩增/检测模块中，用于HIV-1的反转录、PCR扩增和实时荧光检测。

RT-PCR预混合试剂配方与冻干相容，可在不到一小时的时间内完成RT-PCR循环。通过将KAPA 2G DNA聚合酶、SuperScript III反转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、赋形剂(Ficoll 400、Ficoll 70、海藻糖、松三糖和分子生物学级水)、PCR缓冲液成分(Tris-HCl、吐温20和明胶)、dNTP、寡核苷酸引物(如本文所述)、寡核苷酸探针和猝灭剂(如本文所述)、Cal610无源参照染料和ProClin 950混合制备预混合试剂。

SuperScript III逆转录酶是改造形式的莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶，具有降低的RNase H活性和更高的热稳定性，可用于在高达55℃的温度下合成第一链cDNA，从而提供增加的特异性。KAPA2G聚合酶是一种经改造的酶，可通过定向进化获得更高的生产力和速度，其延伸速率比野生型聚合酶快得多。KAPA2G具有高度合成性的5′-3′DNA聚合酶，但缺乏3′-5′核酸外切酶活性。尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)催化从含尿嘧啶的DNA中释放游离尿嘧啶，并为控制含有尿嘧啶的外部扩增子提供了一种污染控制手段。

将预混合试剂以单位剂量的形式填充到多孔板中并冻干。然后将冻干的板密封并装袋。预混合配方列于表2。

表2.预混合配方

表3列出了ALINITY m^TMHIV-1分析所使用的RT-PCR循环条件。

表3.RT-PCR循环条件

通过混合赋形剂(海藻糖和分子生物学级水)和批量内对照(由在过滤的、去纤维化的人血浆中稀释的内部对照装甲RNA(Basematrix，SeraCare Life Science，Inc.，Milford，MA)来制备内对照靶标。内对照的配方列于下表4。内对照装甲RNA靶序列源自南瓜植物西葫芦(Cucurbita pepo)的羟基丙酮酸还原酶基因，该基因与HIV-1无关。将内对照以单位剂量的形式填充到多孔板中并冻干。然后将冻干的板密封并装袋。

表4.内对照配方

可以进一步修改上述PCR配方和循环条件以优化测定法。

实施例2

该实施例描述了建立ALINITY m^TMHIV检测的检测限(LOD)的实验。

通过对HIV-1RNA的World Health Organization(WHO)3^rd InternationalStandard(10/152)的稀释系列进行分析，确定ALINITY m^TMHIV-1测定的检测限，该稀释液是在HIV-1阴性人类血浆中制备的。

HIV-1WHO标准的稀释小组由六个小组成员组成，旨在将测定的预期检测限(LOD)和预期的定量下限(LLOQ)括起来为20个拷贝/mL。本研究中使用的LOD小组成员的浓度为40、30、20、10、5和2.5个拷贝/mL，导致三个小组成员的检出率在10％到90％之间，一个或多个小组成员的检出率超过95％。根据指定的WHO HIV-1标准浓度(见表5)计算小组成员的浓度。

表5.HIV-1小组成员

在四个ALINITY m^TMHIV-1扩增试剂批次和两个ALINITY m^TM系统中，每个小组成员总共进行了96次重复测试。对于每个小组成员，在三天内对四个ALINITY m^TMHIV-1扩增试剂批次中的每一个进行了3次测试，包括每天八次重复(例如，四个扩增试剂批次×八次重复/天×三天＝总共96次重复测试)(参见表6)。

表6.研究抽样

根据Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)EP17-A2Guideline for Evaluation of Detection Capability for Clinical LaboratoryMeasurement Procedures的建议，样品量至少为五个小组成员，每个小组成员至少重复60次。为统计分析研究选择的样品量至少为五个小组成员，每个小组成员至少为80次有效重复。因此，本研究中使用的样品量超过了CLSI EP17-A2 Guideline中建议的最小样品量。

在两个ALINITY m^TM系统上使用四批ALINITY m^TMHIV-1扩增试剂盒、一批ALINITYm^TMHIV-1校准试剂盒、对照试剂盒和样品制备RNA试剂盒试剂以及一批ALINITY m^TM裂解溶液、稀释液和Vapor Barrier Solution进行了研究。

样品标识约定说明

在行列表中，每行标识分配给测试样品的样品标识(SID)。校准器和对照按ALINITY m^TM仪器软件的要求命名。

SID是：LODyyzz

关键词：LOD＝研究(检测限)

yy＝小组编号(01至XX)

zz＝运行编号(01至XX)

下表7列出了本研究中使用的示例样品ID：

表7.

校准和测定对照有效性标准

在运行样品之前，对每种仪器上的ALINITY m^TM HIV-1扩增试剂盒批次、样品制备试剂盒批次和ALINITY m^TM裂解溶液的每种组合建立校准。对于研究中使用的每个试剂批次/仪器，每份校准物均一式三份地进行测试，其中阴性对照、低阳性对照和高阳性对照重复1次。根据测定法-应用规格文件中的有效性标准评估校准曲线参数和每个单独的对照值并通过。

该研究进行了三天，每天在每种仪器上测试ALINITY m HIV-1检测对照，以验证检测的有效性。对照测定特异性有效性标准评估每个单独的对照值并通过。

样品有效性标准

如果样品无效，则将结果排除在分析之外，并在必要时重新测试以达到最小样品量。

如果由于技术或仪器错误而导致“未测试”，则将结果排除在分析之外，并在必要时重复进行，以确保达到最小样品量。

统计分析

统计分析的分析变量是ALINITY m HIV-1样品的结果解释。如果样品的结果/解释为“未检测到”，则认为样品未检测到；否则，样品将被视为“检测到”。

LOD定义为与95％的检测概率相对应的浓度。按照以下方程式估算每个小组成员在所有试剂批号和仪器中的检出率：

其中测试的重复总数是“检测到”和“未检测到”重复的总和。“重复”定义为单个PCR反应，分析中仅包含有效重复。

对于所有试剂批次和仪器组合，检测范围是通过概率分析估算的。使用SAS中的PROC PROBIT拟合概率回归模型，以靶浓度的log₁0(log₁₀(X)，使用log₁₀选项)作为自变量，检测率P(Y＝1)作为响应变量：

P(Y＝1)＝C+(1-C)Φ[β0+(β1)(log₁₀(X))]

其中，β0、β1表示参数估计；X表示靶浓度(拷贝数/mL)，P表示检测的概率，C表示自然(检测率)，Φ[z]表示正态累积分布函数。该模型拟合了log₁₀选项，而不是OPTC选项，因为它假定自然检测率为零。由于使用具有靶浓度log₁₀转换的模型，因此通过采用对数转换可获得估计值和置信区间。

接受标准

这项研究的接受标准是对应于分析中确定的95％检出率(LOD)的HIV-1浓度应小于或等于20个拷贝/mL。LOD定义为与95％的检测概率相对应的浓度。

PR 2：

该测定法应以95％的概率检测到小于或等于20个拷贝/mL，处理1mL或更少的样品。

PR 21：

该测定法应检测HIV-1 M组A、B、BF、C、D、CRF01-AE、F、CRF02-AG、G、H亚型、O组和N组。

这项研究使用的HIV-1RNAWHO3rd International Standard(10/152)建立了ALINITY m HIV-1检测的LOD，该标准由HIV-1 M组B亚型组成。因此，根据此方案验证了PR2和PR21的M组、B亚型B部分。PR21中列出的其他HIV-1组/亚型的LOD表现将作为单独研究的一部分进行验证。

对于使用HIV-1 M组B亚型的LOD研究，根据百分比检测，小组成员1至4被包括在概率回归模型中。概率分析表明，该检测方法能够检测血浆样品中HIV-1 RNA的13.88个拷贝/mL(95％的置信区间为11.16至18.98个拷贝/mL)，M组B亚型的概率为95％。小组成员4、5和6的检出率均超过95％。因此，从概率分析中排除了小组成员5和6，以确保回归模型仅使用一个小组成员(小组成员4)，且检出率为95％或更高。图1显示了ALINITY m HIV-1测定法的检测限(LOD)。支持图1的结果显示在表8、9和10中。

表8.所有组合批次的ALINITY m^TM HIV-1检测限(LOD)

表9.所有组合批次的ALINITY m^TM HIV-1检测限(LOD)

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表10.所有组合批次的LOD概况表

LOD(拷贝数/mL)	接受标准
		13.88	符合

由于阴性对照无效(错误代码9209)，一次运行所测试的测定对照无效，因此被排除在外。没有样品与此对照组相关联。当测定对照无效时，ALINITY m系统软件会使该对照组中测试的所有对照水平无效。因此，与此对照事件相关的高阳性对照和低阳性对照也无效。在测试样品之前，已成功重新测试了测定对照。一个样品显示“已稀释”标志，被排除为分类错误。当样品未稀释(即纯净测试)时，技术人员错误地命令将此重复样品作为稀释样品进行测试(即，按照测定法的可选“样本稀释程序”在ALINITY m^TM样品稀释剂中进行稀释)。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。根据方案，符合小组成员的最少重复次数。复查了所有测试结果。根据方案排除标准，某些观察结果可能已从分析中排除(即对照或有效性标准失败，仪器错误或问题，公认的技术人员错误，不符合纳入标准和/或未遵循方案)。所有未排除的结果均符合分析条件。

表11汇总了对排除观察结果的解释。表12中提供了包括的结果、排除的结果、仪器故障事件和运行故障事件总数以进行有效性QC的总体行列表概况(overall line-listingsummary)。

表11.ALINITY m^TM HIV-1检测限研究-总体行列表概况

表12.ALINITY m^TM HIV-1检测限研究-排除的数据概况

研究共产生615个结果；分析总共包括575个结果；该分析共排除了1个结果；36个有效对照结果和3个无效对照结果。该实施例的结果表明，对应于95％检出率(LOD)的HIV-1浓度为13.88个拷贝/mL，ALINITY m HIV-1检测的LOD要求为20个拷贝/mL。

实施例3

该实施例说明了描述了通过测试使用代表M组，B亚型的HIV-1病毒原液制备的小组来建立ALINITY m^TM HIV-1分析的线性范围的实验。

通过测试11个小组成员来评估线性。八个成员跨越了测定的预期动态范围(20到10,000,000个拷贝/mL)，其中一个成员的目标是预期的定量下限(LLOQ)为20个拷贝/mL。测试中还包括一个超出预期的定量上限(ULOQ)10,000,000个拷贝/mL的成员，以及另外两个超出此范围的小组成员。

小组成员由在阴性血浆中稀释的代表M组B亚型的HIV-1病毒原液组成。使用内参考标准建立小组定量值，该参考标准可追溯至Virology Quality Assurance(VQA)Laboratory of the AIDS Clinical Trial Group的病毒标准，并在表13中列出。

表13.HIV-1小组成员

使用一个批次的ALINITY m^TM HIV-1扩增试剂和1个ALINITY m^TM系统对每个小组成员进行了总共24次重复测试。

该研究设计基于Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)的题为“EP06-A，Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures：AStatistical Approach”的建议。

根据CLSI EP06-A Guideline中建议的样品量，开发人员至少要有七个小组成员，每个小组成员至少要重复两次。本研究选择的样品量为11个小组成员，每个小组24次重复。因此，本研究中使用的样品量达到或超过了CLSI EP06-A Guideline中建议的最小样品量。

使用一个批次的ALINITY m^TM HIV-1 AMP试剂盒IUO试剂、一个批次的ALINITY m^TMHIV-1 CTRL试剂盒IUO试剂、一个批次的ALINITY m^TM HIV-1 CAL试剂盒IUO试剂、一个批次的样品制备RNA试剂盒IUO试剂、一个批次的ALINITY m^TM裂解溶液IUO、一个批次的ALINITYm^TM Vapor Barrier Solution IUO、一个批次的ALINITY m^TM稀释溶液IUO和一个ALINITYm^TM系统进行该研究。

样品标识约定说明

在行列表中，每行标识分配给测试样品的样品标识(ID)。校准器和对照按ALINITYm^TM仪器软件的要求命名。

SID是：DLyyzz

关键词：DL＝研究(线性)

yy＝小组编号(01至XX)

zz＝重复(01至24)

下表14列出了本研究中使用的示例样品ID。

表14

校准和测定对照有效性标准

在运行样品之前，对每种仪器上的ALINITY m^TM HIV-1扩增试剂盒批次、样品制备试剂盒批次和ALINITY m^TM裂解溶液批次建立校准。对于研究中使用的每个试剂批次/仪器，每份校准物均一式三份地进行测试，其中阴性对照、低阳性对照和高阳性对照重复1次。根据测定法-应用规格文件中的有效性标准评估校准曲线参数和每个单独的对照值并通过。

在测试当天对ALINITY m^TM HIV-1测定对照进行了检测，以验证测定法的有效性。对照测定特异性有效性标准或等价物评估每个单独的对照值并通过。

样品有效性评估

如果样品无效，则将结果排除在分析之外，并在必要时重新测试以达到最小样品量。如果所有重新测试重复均有效，则重新测试结果以及原始测试的任何有效结果都将包含在分析中。为了标识无效样品的重新测试，在样品ID的末尾添加了“R”。

如果由于技术或仪器错误而导致“未测试”，则将结果排除在分析之外，并在必要时重复进行，以确保达到最小样品量。为了标识‘未测试’样品的重新测试，在样品ID的末尾添加了“A”。

统计分析

统计分析的分析变量是ALINITY m^TM HIV-1浓度对数拷贝数/mL。进行以下分析步骤：

对于每个小组水平，都计算了ALINITY m^TM HIV-1结果的标准差(SD)，并且该标准差确认不大于以下测定精度要求：

·从100个拷贝/mL到20,000,000个拷贝/mL的测定法为0.25个对数拷贝数/mL。

·0.46个对数拷贝数/mL小于或等于LLOQ的3倍。

由于SD符合上述标准，因此分析将继续执行步骤b)至g)。

离群值标识：

通过检查任何ALINITY m^TM HIV-1结果是否超出平均值±4×SD范围来检测并排除离群值。在有和没有离群值的情况下进行了以下分析(步骤c-步骤g)。

c)执行一阶、二阶和三阶多项式最小二乘回归，并检验非线性系数在显著性水平0.05时是否显著。

d)如果没有明显的非线性系数，则将测定法定义为在小组成员所涵盖的范围内为线性。继续执行步骤f)。

e)如果存在显著的非线性系数，则选择具有最低均方误差(MSE)的非线性回归模型作为拟合非线性模型，并计算每个小组成员的拟合非线性模型和线性模型之间的预测浓度之差(Y)。

如果靶浓度最低和/或最高的小组成员的拟合非线性模型和线性模型之间的预测浓度之差(Y)大于0.5个对数拷贝数/mL，则去除差异较大的小组成员。继续执行步骤c)。

如果每个小组成员在拟合的非线性模型和线性模型之间的预测浓度之差(Y)小于或等于0.5个对数拷贝数/mL，则：

·线性范围的下限定义为靶浓度最低的小组成员的靶浓度，

·线性范围的上限定义为靶浓度最高的小组成员的靶浓度，和

·将该测定定义为线性范围下限和线性范围上限内的线性。

请注意，多项式模型与线性模型之间的最大允许差

(0.5个对数拷贝数/mL)取自The Panel on Antiretroviral Guidelines forAdults and Adolescents.Guidelines for the use of antiretroviral agents inHIV-1-infected adults and adolescents.Department of Health and Human Services(2014)，其中指出被认为具有统计学意义的最小病毒载量变化(2个标准差)是三倍或0.5个对数拷贝数/mL变化。

f)执行最小二乘线性回归，并生成一个回归图，其中包括从步骤d)或步骤e)确定的线性范围内的小组成员。

g)如果所有小组成员的回归分析都存在显著的非线性系数，则使用单独的ALINITY m^TM HIV-1作为Y轴，以靶浓度作为X轴，绘制所有小组成员的图。该图上显示了代表线性范围之内和之外的结果的两个不同符号。该图中还显示了两条线，分别代表拟合的非线性模型和线性模型的预测平均浓度。超出线性范围的小组成员在该图中突出显示。

接受标准

本研究的接受标准是，HIV-1 M组B亚型的线性范围的下限应小于或等于20个拷贝/mL，线性范围上限应大于或等于10,000,000个拷贝/mL。

ALINITY m^TM HIV-1测定被定义为在HIV-1 M组B亚型病毒的所测试的最低病毒小组成员(目标10个拷贝/mL)和所测试的最高病毒小组成员中(目标20,000,000个拷贝/mL)是线性的。血浆结果的分析表明非线性系数是显著的。ALINITY m^TM HIV-1分析的线性和非线性回归图显示在图2中，支持图2的结果显示在表15至表18中。对于所有小组成员，图3给出了ALINITY m^TM HIV-1测定法的最小二乘回归图，表19提供了概况。线性范围为10至20,000,000个拷贝/mL并显示于表20中。该研究总共产生了267个结果：分析中总共包括264个样品结果，分析中排除了0个样品结果，以及3个有效的对照结果。复查了所有测试结果。分析期间未排除任何结果。表21提供了包含和排除的样品结果总数以及无效/有效的测定对照结果总数的整体行列表概况。

表15.ALINITY m^TM HIV-1线性标准偏差列表

表16.ALINITY m^TM HIV-1线性统计离群值列表

检测到离群值
	否

表17.ALINITY m^TM HIV-1线性回归参数概况

表18.ALINITY m^TM HIV-1线性预测值与差异列表

表19.线性范围内小组成员的概况

表20.线性范围概况

表21.ALINITY m^TM HIV-1检测限研究总体行列表概况

该实施例的结果证明，对于HIV-1 M组B亚型，ALINITY m^TM HIV-1测定法在10个拷贝/mL至20,000,000个拷贝/mL为线性。

实施例4

该实施例描述了验证血浆样品中的ALINITY m^TM HIV-1测定法的HIV-1 M组A、BF、C、D、CRF01-AE、F、CRF02-AG、G、H亚型、O组和N组的检测限(LOD)的实验。

对于每个HIV-1组/亚型，通过将临床标本或病毒原液稀释到HIV-1阴性人类血浆中来制备三个小组成员。小组浓度以方括号为准，并包括测定法的预期LOD和20个拷贝/mL的定量下限(LLOQ)的浓度。小组定量值是用Abbott REALTIME^TM HIV-1测定法建立的，其使用内参考标准建立小组定量值，该参考标准可追溯至Virology Quality Assurance(VQA)Laboratory of the AIDS Clinical Trial Group的病毒标准(参见表22)。

表22.HIV-1小组成员

对于每个组或亚型的每个小组成员，在多天内对一个ALINITY m^TM HIV-1扩增试剂批次进行了三次测试，包括每天八次重复(例如，八次重复/天×三天＝总共24次重复测试)。每个小组成员总共进行了24次重复测试。这样可以确保每个小组成员至少进行20次有效重复。

根据CLSIEP17-A2 Guideline中的建议，样品量至少为一个试剂批次、一台仪器、在LOD要求下为两个样品、每天每个样品两次重复以及总共20个低水平重复。因此，本研究中使用的样品量符合了CLSI EP17-A2 Guideline中建议的最小样品量。

使用一个批次的ALINITY m^TM HIV-1 AMP试剂盒IUO试剂、一个批次的ALINITY m^TMHIV-1 CTRL试剂盒IUO试剂、一个批次的ALINITY m^TM HIV-1 CAL试剂盒IUO试剂、一个批次的样品制备RNA试剂盒IUO试剂、一个批次的ALINITY m^TM裂解溶液IUO、一个批次的ALINITYm^TM Vapor Barrier Solution IUO、一个批次的ALINITY m^TM稀释溶液IUO和两个ALINITYm^TM系统进行该研究。

样品标识约定说明

SID是：GDggyyzz

关键词：GD＝研究(组/亚型检测限)

gg＝组，亚型

A1＝M组，A亚型

BF＝M组，BF亚型

C1＝M组，C亚型

D1＝M组，D亚型

AE＝M组，CRF01-AE

F1＝M组，F亚型

AG＝M组，CRF02-AG

G1＝M组，G亚型

H1＝M组，H亚型

O1＝O组

N1＝N组

yy＝小组编号(01至XX)

01＝10个拷贝/mL

02＝20个拷贝/mL

03＝40个拷贝/mL

zz＝天(01至XX)

下表23列出了本研究中使用的示例样品ID。

表23.

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校准和测定对照有效性标准

在运行样品之前，批次对每种仪器上的ALINITY m^TM HIV-1扩增试剂盒批次、样品制备试剂盒批次和ALINITY m^TM裂解溶液批次的每种组合建立校准。对于研究中使用的每个试剂批次/仪器，每份校准物均一式三份地进行测试，其中阴性对照、低阳性对照和高阳性对照重复一次。根据测定法-应用规格文件中的有效性标准评估校准曲线参数和每个单独的对照值并通过。

每天对ALINITY m^TM HIV-1测定对照进行了检测，以验证测定法的有效性。对照测定特异性有效性标准评估每个单独的对照值并通过。

样品有效性评估

如果样品无效，则将结果排除在分析之外，并在必要时重新测试以达到最小样品量。如果由于技术或仪器错误而导致“未测试”，则将结果排除在分析之外，并在必要时重复进行，以确保达到最小样品量。

统计分析

统计分析的分析变量是ALINITY m^TM HIV-1样品的结果解释。如果样品的结果/解释为“未检测到”，则认为样品未检测到。如果样品具有以下三个结果/解释之一，则被视为“检测到”：检测到＜LLOQ，在线性范围内，和浓度＞ULOQ。

对于每个HIV-1组/亚型，每个小组成员的检出率(命中率)按以下公式估算：

其中重复总数是“检测到”和“未检测到”重复的总和。还计算了检出率的上限单侧95％得分置信区间(CI)。

接受标准

对于每个靶向的HIV-1组/亚型，小组成员在20个拷贝/mL或以上时，检出率(命中率)的上限单侧95％置信区间应大于或等于95.0％。

该数据验证血浆样品中的ALINITY m^TM HIV-1测定法的HIV-1 M组A、BF、C、D、CRF01-AE、F、CRF02-AG、G、H亚型、O组和N组的检测限(LOD)小于或等于20个拷贝/mL。结果示于表24和25中。

表24.HIV-1组/亚型检测限(LOD)

表25.HIV-1 LOD概况表

组/亚型	接受标准
		M组，A亚型	Met
M组，BF亚型	Met
		M组，C亚型	Met
M组，D亚型	Met
		M组.CRF01-AE	Met
M组，F亚型	Met
		M组，CRF02-AG	Met
M组，G亚型	Met
		M组，H亚型	符合
O组	符合
		N组	符合

排除的数据总结如下。当未达到最小样品量时，进行重新测试。

在第3天测试的M组，A亚型10个拷贝/mL的一个重复是无效的，代码：9210内对照循环数太高。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

在第1天测试的M组，CRF02-AG 40个拷贝/mL的一个重复是无效的，代码：9210内对照循环数太高。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

在第2天测试的M组，C亚型10个拷贝/mL的八个重复由于仪器错误是无效的，代码：120无法处理。状态为终止。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试。

在第2天测试的M组，C亚型20个拷贝/mL的四个重复由于仪器错误是无效的，代码：120无法处理。状态为终止。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试。

在第3天测试的M组，C亚型10个拷贝/mL的一个重复是无效的，代码：9212内对照失败。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

在第3天测试的M组，D亚型40个拷贝/mL的三个重复由于仪器错误是无效的，代码：5017移液器抽吸错误。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试。

在第2天测试的M组，F亚型20个拷贝/mL的一个重复由于仪器错误是无效的，代码：5017移液器抽吸错误。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试。

在第3天测试的M组，D亚型40个拷贝/mL的四个重复由于仪器错误是无效的，代码：5018移液器分配错误。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试。

M组，F亚型(多个水平)的七个重复由于仪器错误是无效的，代码：5013移液器探针上的液位检测错误。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试。

在第1天测试的M组，F亚型20个拷贝/mL的一个重复是无效的，代码：9210内对照循环数太高。该样品被排除在分析之外，未进行重新测试。

在第2天测试的M组，H亚型10个拷贝/mL的十二个重复由于仪器错误是无效的，代码：3024对Amp-Detect单元进行污染检查失败。这些样品未经测试就从分析中排除，然后重新测试以实现最小样品量。

在第3天测试的N组10个拷贝/mL的一个重复由于仪器错误是无效的，代码：1993信号响应超过了测定法的最大比率。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

在第1天测试的N组40个拷贝/mL的一个重复是无效的，代码：9210内对照循环数太高。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

复查了所有测试结果。根据方案排除标准，某些观察结果可能已从分析中排除(即对照或有效性标准失败，仪器错误或问题，公认的技术人员错误，不符合纳入标准和/或未遵循方案)。所有未排除的结果均符合分析条件。

表26提供了包含和排除的样品结果总数以及无效/有效的测定对照结果总数的总体行列表概况。表27汇总了对排除观察结果的解释。

表26.ALINITY m^TM HIV-1组/亚型检测限研究总体行列表概况

表27.ALINITY m^TM HIV-1组/亚型检测限研究排除数据概况

该研究总共产生了849个结果：分析中总共包括783个结果，分析中排除了45个样品结果，以及21个有效的对照。

该实施例的结果证实了ALINITY m^TM HIV-1测定使用HIV-1 M组A、BF、C、D、CRF01-AE、F、CRF02-AG、G、H亚型、O组和N组的检测限(LOD)为20个拷贝/mL。

实施例5

该实施例描述了所进行用来验证ALINITY m^TM HIV-1测定通过测试HIV-1 M组A、BF、C、D、CRF01-AE、F、CRF02-AG、G、H亚型、O组和N组线性小组的线性范围的实验。

通过对每个HIV-1组/亚型测试至少10个小组成员，评估了ALINITY m^TM HIV-1测定法的线性。在可能的情况下，线性小组成员跨越了测定法的预期动态范围(20至10,000,000个拷贝/mL)。当局限性导致无法获得足够大的体积和/或足够高的浓度以达到20,000,000个拷贝/mL的最高目标水平的某些组/亚型时，应以尽可能高的浓度制备高端(high-end)稀释小组成员。

通过在HIV-1阴性人类血浆中稀释培养的病毒来制备HIV-1 M组，A、C、D、AE、F、AG、G、H亚型，O组和N组的线性小组。通过在HIV-1阴性人类血浆中稀释HIV-1 M组BF亚型阳性患者标本，制备了HIV-1 M组BF亚型的线性小组。

小组定量值是用Abbott REALTIME^TM HIV-1测定法建立的，其使用内参考标准建立小组定量值，该参考标准可追溯至Virology Quality Assurance(VQA)Laboratory oftheAIDS Clinical Trial Group的病毒标准(参见表28)。

表28.HIV-1亚型线性小组

/>

根据研究方案，研究的最小样品量为七个或更多小组成员，每个小组成员12个或更多个重复。因此，本研究中使用的样品量达到或超过了CLSI EP06-A Guideline中建议的最小样品量。

在三个ALINITY m^TM系统上使用两批ALINITY m^TMHIV-1扩增试剂盒、一批校准试剂盒、两批对照试剂盒和三批样品制备RNA试剂盒试剂、一批ALINITY m^TM裂解溶液、三批ALINITY m^TM稀释溶液和两批ALINITY m^TM Vapor Barrier Solution进行了研究。对于每种HIV-1组/亚型，在一台ALINITY m^TM仪器上测试了很多ALINITYm^TM HIV-1扩增试剂盒试剂。

样品标识约定说明

SID是：GLssyy.

关键词：GL＝研究(组/亚型线性)

ss＝组，亚型

A1＝M组，A亚型

BF＝M组，BF亚型

C1＝M组，C亚型

D1＝M组，D亚型

AE＝M组，CRF01-AE

F1＝M组，F亚型

AG＝M组，CRF02-AG

G1＝M组，G亚型

H1＝M组，H亚型

O1＝O组

N1＝N组

yy＝小组编号(01至XX)

下表29列出了本研究中使用的示例样品ID。

表29

校准和测定对照有效性标准

在运行样品之前，对每种仪器上的ALINITY m^TM HIV-1扩增试剂盒批次、样品制备试剂盒批次和ALINITY m^TM裂解溶液批次的每种组合建立校准。对于研究中使用的每个试剂批次/仪器，每份校准物均一式三份地进行测试，其中阴性对照、低阳性对照和高阳性对照重复一次。根据测定法-应用规格文件中的有效性标准评估校准曲线参数和每个单独的对照值并通过。在每个测试当天对ALINITY m^TM HIV-1测定对照进行了检测，以验证测定法的有效性。对照测定特异性有效性标准或等价物评估每个单独的对照值并通过。

样品有效性评估

如果样品无效，则将结果排除在分析之外，并在必要时重新测试以达到最小样品量。如果所有重新测试重复均有效，则重新测试结果以及原始测试的任何有效结果都将包含在分析中。

统计分析

统计分析的分析变量是ALINITY m^TM HIV-1浓度对数拷贝数/mL。对每个组/亚型进行以下分析步骤：

·从100个拷贝/mL到10,000,000个拷贝/mL或更高为0.25个对数拷贝数/mL。

·0.46个对数拷贝数/mL小于或等于60个拷贝/mL(3倍的测定法的预期LLOQ)。

如果SD符合上述标准，则分析将继续执行步骤b)至g)。

离群值标识：

c)执行一阶、二阶和三阶多项式最小二乘回归。测试非线性系数是否在显著性水平0.05上显著。

如果靶浓度最低和/或最高的小组成员的拟合非线性模型和线性模型之间的预测浓度之差(Y)大于0.5个对数IU/mL，则去除差异较大的小组成员。继续执行步骤c)。

如果每个小组成员在拟合的非线性模型和线性模型之间的预测浓度之差(Y)小于或等于0.5个对数IU/mL，则：

·线性范围的下限定义为靶浓度最低的小组成员的靶浓度，

·将该测定定义为线性范围下限和线性范围上限内的线性。

请注意，多项式模型与线性模型之间的最大允许差

(0.5个对数拷贝数/mL)取自The Panel on Antiretroviral Guidelines forAdults and Adolescents.Guidelines for the use of antiretroviral agents inHIV-1-infected adults and adolescents.Department of Health and Human Services(2014)，这表明被认为具有统计意义的病毒载量的最小变化(2个标准差)是三倍或0.5个对数拷贝数/mL变化。

对于每个组/亚型，报告了最小二乘线性回归的线性方程式，并根据最佳拟合非线性回归和线性回归计算了预测平均浓度中的最大差异。如果回归分析中没有显著的非线性系数，则最大差异报告为“NA”。

此外，将每个组/亚型的最小二乘线性回归线与所有组/亚型(包括M组，B亚型)绘制在同一图上。

接受标准

对于每个HIV-1组/亚型，本研究的接受标准为：线性范围的上限应大于或等于10,000,000个拷贝/mL，线性范围的下限应小于或等于20个拷贝/mL。

对于由于可用体积和/或浓度的限制而小组成员未达到10,000,000个拷贝/mL的任何组/亚型，接受标准是测定法应为线性，即从所测试的最高小组水平到小于或等于20个拷贝/mL。

对于每个HIV-1组/亚型，从测试的最低小组成员到最高的小组成员，ALINITY m^TMHIV-1测定均被确定为线性。来自M组，A、BF、C、AG、F和G亚型的结果分析表明，非线性系数是显著的。使用这些小组的ALINITY m^TM HIV-1分析的线性和非线性回归图显示在图4、5、6、7、8和9中。支持图4-9的结果显示在表30-33中。

表30.HIV-1组/亚型的标准偏差列表

/>

表31.离群值检测概况

HIV-1组/亚型小组	检测到离群值
		M组，A亚型	否
M组，BF亚型	否
		M组，C亚型	否
M组，D亚型	否
		M组，AE亚型	否
M组，AG亚型	否
		M组，F亚型	否
M组，G亚型	否
		M组，H亚型	否
N组	否
		O组	否

/>

表33.预测值和差异的列表

/>

剩下的组/亚型(HIV-1 M组，D、AE、H亚型、O组和N组)没有显示出如表32所示的显著的非线性系数。

对于每个组/亚型小组，ALINITY m^TM HIV-1分析的最小二乘回归图显示在图10-图20中，并汇总在表34-44中。

表34.ALINITY m^TM HIV-1 M组，A亚型-线性范围内小组成员概况

表35.ALINITY m^TM HIV-1 M组，BF亚型-线性范围内小组成员概况

表36.ALINITY m^TM HIV-1 M组，C亚型-线性范围内小组成员概况(去除离群值)

表37.ALINITY m^TM HIV-1 M组，D亚型-线性范围内小组成员概况

/>

表38.ALINITY m^TM HIV-1 M组，AE亚型-线性范围内小组成员概况

表39.ALINITY m^TM HIV-1 M组，AG亚型-线性范围内小组成员概况

表40.ALINITY m^TM HIV-1 M组，F亚型-线性范围内小组成员概况

表41.ALINITY m^TM HIV-1 M组，G亚型-线性范围内小组成员概况

表42.ALINITY m^TM HIV-1 M组，H亚型-线性范围内小组成员概况

/>

表43.ALINITY m^TM HIV-1 N组-线性范围内小组成员概况

表44.ALINITY m^TM HIV-1 O组线性最小二乘回归图和线性范围内小组成员概况。

/>

对于HIV-1 M组，A、BF、C、D、AE、F、AG、G、H亚型、O组和N组，如表45中所示，该测定法从所测试的最低病毒小组成员(目标1.00对数拷贝数/mL)到所测试的最高病毒小组成员(目标7.30对数拷贝数/mL)是线性的。

对于HIV-1 M组，BF亚型，如表45中所示，该测定法从所测试的最低病毒小组成员(目标1.00对数拷贝数/mL)到所测试的最高病毒小组成员(目标4.10对数拷贝数/mL)是线性的。

对于HIV-1 M组，C亚型，如表45中所示，该测定法从所测试的最低病毒小组成员(目标1.00对数拷贝数/mL)到所测试的最高病毒小组成员(目标6.80对数拷贝数/mL)是线性的。

对于HIV-1 M组，H亚型，如表45中所示，该测定法从所测试的最低病毒小组成员(目标1.00对数拷贝数/mL)到所测试的最高病毒小组成员(目标5.65对数拷贝数/mL)是线性的。

对于HIV-1 N组，如表45中所示，该测定法从所测试的最低病毒小组成员(目标0.40对数拷贝数/mL)到所测试的最高病毒小组成员(目标5.10对数拷贝数/mL)是线性的。

表45.线性范围概况

/>

图21示出了ALINITY m^TM HIV-1线性小组成员(M组，A、B、BF、C、D、AE、AG、F、G、H亚型、N组和O组组合)的最小二乘回归图。

表46示出了ALINITY m^TM HIV-1线性小组成员(M组，A、B、BF、C、D、AE、AG、F、G、H亚型、N组和O组)的最小二乘回归概况。

表46.不同组/亚型的线性范围内小组成员的最小二乘回归概况

/>

图22是显示线性范围内M组A、B、BF、C、D、AE、AG、F、G、H亚型、N组和O组的每个小组成员的平均值和来自各个数据点的回归分析的回归线的图。

一个M组，A亚型样品无效，代码9210-内对照循环数太高。从分析中排除了该重复，并根据方案对其他重复进行了测试。

一个O组样品由于仪器错误而无效，代码5002-移液器臂Z电机失败。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

三个M组，AE亚型样品由于仪器错误而无效，代码5013-移液器探针上的液位检测错误。从分析中排除了这些样品，并根据方案对其他样品进行了测试。

一个M组，AE亚型样品无效，代码9212-内对照失败。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

两个M组，F亚型样品无效，代码9212-IC失败。这些重复被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个M组，D亚型样品无效，代码9210-内对照循环数太高。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

两个M组，D亚型样品无效，代码9212-IC失败。这些重复被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

三个M组，BF亚型样品无效，代码9210-内对照循环数太高。这些重复被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个M组，H亚型样品无效，代码9210-内对照循环数太高。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个M组，H亚型样品无效，代码9212-内对照失败。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个M组，AG亚型样品由于仪器错误而无效，代码5002-移液器臂Z电机失败。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

两个M组，C亚型样品无效，代码9212-内对照失败。该样品被排除在分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个M组，C亚型样品由于仪器错误而无效，代码5002-移液器臂Z电机失败。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个M组，C亚型样品无效，代码9210-内对照循环数太高。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

九个N组样品由于仪器错误而无效，代码5002-移液器臂Z电机失败。这些样品从分析中排除，并根据需要重新测试，以符合最小样品量。

一个N组样品由于仪器错误而无效，代码5013：移液器探针上的液位检测错误。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一个N组样品无效，代码9210-内对照循环数太高。该样品被排除分析之外，并且由于达到了最小样品量而未进行重新测试。

一次运行由于阴性对照无效(错误代码9209)而无效，因此被排除。没有样品与此对照事件相关联。注意：当测定对照无效时，ALINITY m^TM系统软件会使该对照组中测试的所有对照水平无效。因此，与此对照事件相关的高阳性对照和低阳性对照也无效。在测试样品之前，已成功重新测试了测定对照。

表47提供了包含和排除的样品结果总数以及无效/有效的测定对照结果总数的总体行列表概况。表48汇总了对排除观察结果的解释。

表47.ALINITY m^TM HIV-1组/亚型检测限研究总体行列表概况

表48.ALINITY m^TM HIV-1组/亚型线性研究排除数据概况

/>

组/研究线性研究共产生1564个结果；分析总共包括1493个结果；该分析共排除了32个结果；36个有效对照结果和3个无效对照结果。

该实施例的结果证实，对于HIV-1 M组A、D、AE、AG、F、G亚型和O组，ALINITY m^TMHIV-1测定法在10至20,000,000个拷贝/mL为线性。请求保护的ALINITY m^TM HIV-1测定法的线性范围为20个拷贝/mL至10,000,000个拷贝/mL。对于M组，BF、C、H亚型和N组，如果由于可用体积和/或浓度的限制，小组成员由于没有达到10,000,000个拷贝/mL，则该测定法从小于或等于10个拷贝/mL到所测试的最高小组浓度是线性的。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均以引用的方式并入本文，其程度如同每个参考文献被单独地且具体地指示为通过引用并入本文并在此完整阐述。

除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个(a)”和“一种(an)”和“该”和“至少一个”、“一个或多个”以及类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明或明确与上下文相矛盾，否则使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目的列表(例如，“A和B中的至少一个”)应被解释为表示从列出的项目中选择的一个项目(A或B))或所列项目(A和B)中的两个或更多个的任何组合。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。短语“基本上由......组成”也被解释为开放式短语，意在包括不实质上影响所描述的产品或方法的基本和新颖特征的步骤或材料。短语“由......组成”被解释为是封闭式短语，其排除了说明书或权利要求书中未明确指定的任何要素、步骤或成分。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述说明之后，那些优选实施方案的变型对于本领域技术人员而言将变得显而易见。本发明人预计本领域技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元件在其所有可能的变化中的任何组合。

序列表

<110> 雅培分子公司

<120> 检测人类免疫缺陷病毒（HIV）的测定法

<130> ABBTT-36072/WO-1/ORD

<150> US 62/567,655

<151> 2017-10-03

<160> 54

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

ctttcccctg cactgtaccc cccaat 26

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

acagcagtac agatggcagt attcattcac aattttaaaa gaa 43

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

cggatttgta ctgctg 16

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtg 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

gtccctgttc gggcgccact gctag 25

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

tgtgtgcccg tctgttgtgc gactctggta tctagagatc cctcaga 47

<210> 8

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

acgggcacac a 11

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

agtgtgtgct catctgttca accctggtat ctagagatcc ctc 43

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

gatgagcaca cact 14

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

cagagttggc agcttcactt tctcttg 27

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

gtctggcctt tcagcaagtt tc 22

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

acgagttcat gagggcaggc cgct 24

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

attcccuaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

attcccuaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

attccctaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

attcccuaca atccccaaag tcaaggagt 29

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

attccctaca atccccaaag tcaaggag 28

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

ataccctaca atcctcaaag tcagggagc 29

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

accctacaat cctcaaagtc agggagc 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

gggataccct acaatcctca aagtcag 27

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 27

cgggataccc tacaatcctc aaagtca 27

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 28

cgggataccc tacaatcctc aaagtcag 28

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 29

cctacaatcc tcaaagtcag ggagcag 27

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 30

gataccctac aatcctcaaa gtcagggag 29

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 31

ataccatata atccacaaag tcaaggagt 29

<210> 32

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 32

ataccatata acccacaaag tcaaggagt 29

<210> 33

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 33

gaataccata taatccacaa agtcaaggag t 31

<210> 34

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 34

gaataccata taacccacaa agtcaaggag t 31

<210> 35

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 35

ggaataccat ataatccaca aagtcaagga gt 32

<210> 36

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

ggaataccat ataacccaca aagtcaagga gt 32

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

ttcccctgca ctgtaccccc caat 24

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

tcccctgcac tgtacccccc aatc 24

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

gtctactatt ctttcccctg cactgtaccc 30

<210> 40

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

attatgtcta ctattctttc ccctgcactg t 31

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

gtctgttgct attatgtcta ctattctttc cc 32

<210> 42

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

atttctgctg tccctgtaat aaacccgaa 29

<210> 43

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat ccctc 45

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

cugguaacta gagaucccuc aga 23

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

actctggtaa ctagagatcc ctcaga 26

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

tcagcaagcc gagtcctgcg tcgagag 27

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

cccgttgcgt cggaggtttt cttcc 25

<210> 48

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

aatctctagc agtggcgccc gaacaggg 28

<210> 49

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

aatctctagc agtggcgccc gaacagg 27

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 50

tgacgctctc gcacccatct ctctcct 27

<210> 51

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 51

tctctcgacg caggactcgg cttgctga 28

<210> 52

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

aagaaaacct ccgacgcaac gggctcgg 28

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

ttggcagctt cactttctct tgcag 25

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

agttggcagc ttcactttct cttgca 26

Claims

1.用于扩增和检测样品中的一个或多个人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)核酸序列的寡核苷酸序列的组，其包括：

(a)扩增和检测至少一部分HIV-1整合酶(INT)基因的引物和探针组，其包括由SEQ IDNO:1组成的正向引物寡核苷酸序列、由SEQ ID NO:2组成的反向引物寡核苷酸序列和双链探针寡核苷酸序列，所述双链探针寡核苷酸序列包括(i)由SEQ ID NO:3和可检测的标记组成的第一核酸序列和(ii)由SEQ ID NO:4和淬灭剂部分组成的第二核酸序列；和

(b)扩增和检测至少一部分HIV-1长末端重复(LTR)区域的引物和探针组，其包括由SEQID NO:5组成的正向引物寡核苷酸序列、由SEQ ID NO:6组成的反向引物寡核苷酸序列、第一双链探针寡核苷酸序列和第二双链探针寡核苷酸序列，

其中所述第一双链探针寡核苷酸序列和所述第二双链探针寡核苷酸序列各自包含含有可检测的标记的第一核酸序列和含有猝灭剂部分的第二核酸序列，并且

其中第一双链探针寡核苷酸序列包括由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的核酸序列，并且第二双链探针寡核苷酸序列包括由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的组，其进一步包括：

(c)由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54组成的内对照正向引物寡核苷酸序列，

(d)由SEQ ID NO:12组成的内对照反向引物寡核苷酸序列，和

(e)由SEQ ID NO:13和可检测的标记组成的内对照探针寡核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的组，其中可检测的标记是荧光团。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸序列的组在制备用于检测怀疑含有人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的样品中的HIV-1的试剂盒中的用途，包括：

(a)使从人获得的样品与所述寡核苷酸序列的组和用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，

(b)扩增样品中存在的至少一部分HIV-1INT基因和/或至少一部分HIV-1LTR区域，

(c)将检测一部分HIV-1INT基因的双链探针寡核苷酸与HIV-1INT基因的扩增的部分杂交，和/或将检测一部分HIV-1LTR区域的第一双链探针寡核苷酸序列和第二双链探针寡核苷酸序列与HIV-1LTR区域的扩增的部分杂交，

(d)通过评价来自可检测的标记中的每一种的信号来检测双链探针寡核苷酸序列与HIV-1INT基因和/或LTR区域的部分的杂交，由此

(i)来自检测至少一部分HIV-1INT基因的双链探针寡核苷酸序列上可检测的标记的信号的存在表明双链探针寡核苷酸序列与一部分HIV-1INT基因的杂交以及样品中HIV-1的存在；和/或

(ii)来自第一双链探针寡核苷酸序列和/或第二双链探针寡核苷酸序列的信号的存在表明第一双链探针寡核苷酸序列和/或第二双链探针寡核苷酸序列与一部分LTR区域的杂交以及样品中HIV-1的存在，和

(iii)信号的不存在表明样品中HIV-1的不存在。

5.根据权利要求4所述的用途，其中样品包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、阴道液或精液。

6.用于检测样品中人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的试剂盒，其包括：

(b)扩增和检测至少一部分HIV-1长末端重复(LTR)区域的引物和探针组，其包括由SEQID NO:5组成的正向引物寡核苷酸序列、由SEQ ID NO:6组成的反向引物寡核苷酸序列、第一双链探针寡核苷酸序列和第二双链探针寡核苷酸序列，其中所述第一双链探针寡核苷酸序列和所述第二双链探针寡核苷酸序列各自包含含有可检测的标记的第一核酸序列和含有猝灭剂部分的第二核酸序列，并且其中第一双链探针寡核苷酸序列包括由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的核酸序列，并且第二双链探针寡核苷酸序列包括由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的核酸序列；

(c)用于扩增和检测核酸序列的试剂；和

(d)使用说明。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其进一步包括：

(e)由SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54组成的内对照正向引物寡核苷酸序列，

(f)由SEQ ID NO:12组成的内对照反向引物寡核苷酸序列，和

(g)由SEQ ID NO:13和可检测的标记组成的内对照探针寡核苷酸序列。

8.根据权利要求6或权利要求7所述的试剂盒，其中引物、探针和试剂是冻干的。

9.用于扩增和检测样品中人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的组合物，其包括：

(b)扩增和检测至少一部分HIV-1长末端重复(LTR)区域的引物和探针组，其包括由SEQID NO:5组成的正向引物寡核苷酸序列、由SEQ ID NO:6组成的反向引物寡核苷酸序列、第一双链探针寡核苷酸序列和第二双链探针寡核苷酸序列，其中所述第一双链探针寡核苷酸序列和所述第二双链探针寡核苷酸序列各自包含含有可检测的标记的第一核酸序列和含有猝灭剂部分的第二核酸序列，并且其中第一双链探针寡核苷酸序列包括由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的核酸序列，并且第二双链探针寡核苷酸序列包括由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的核酸序列。

10.根据权利要求9所述的组合物，其进一步包括：

(d)由SEQ ID NO:12组成的内对照反向引物寡核苷酸序列，和

11.根据权利要求9或权利要求10所述的组合物，其中引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和试剂是冻干的。