ES2944360T3 - Ensayo para la detección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) - Google Patents
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Abstract
La divulgación está dirigida a métodos, kits y composiciones para amplificar y detectar un gran número de diferentes tipos de virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) en una muestra. Los métodos, kits y composiciones emplean tanto un par de cebadores específicos que amplifican el gen de la integrasa (INT) como un par de cebadores específicos que amplifican la región de repetición terminal larga (LTR). Los métodos, kits y composiciones también pueden emplear un sistema de sonda dual con marcador de fluoróforo y extintor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayo para la detección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Incorporación por referencia de material presentado electrónicamente
Se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento una lista de secuencias de nudeótidos/aminoácidos legible por ordenador presentada al mismo tiempo e identificada de la siguiente manera: Un archivo ASCII (texto) de 10.075 bytes llamado "36072WO1ORD_ST25.txt", creado el 2 de octubre de 2018.
Antecedentes de la invención
El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) es el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) (Barre-Sinoussi et al., Science, 220: 868-871 (1983); Popovic et al., Science, 224: 497-500 (1984); y Gallo et al., Science, 224: 500-503 (1984)). El VIH puede transmitirse mediante contacto sexual, exposición a sangre o productos sanguíneos infectados, o de una madre infectada al feto (Curran et al., Science, 239: 610-616 (1988)). Hay dos tipos principales de VIH: el VIH-1 y VIH-2. A nivel mundial, el VIH-1 es el tipo predominante de VIH, representa aproximadamente el 95 % de todas las infecciones en todo el mundo. El virus VIH-2, relativamente poco común, se concentra en África 0ccidental, pero se ha visto en otros países. El VIH-2 es menos infeccioso y se propaga más lentamente que el VIH-1, produciendo un menor número de muertes. Se estima que el VIH-2 se distingue genéticamente del VIH-1 en más del 55 % (véase, p. ej., Campbell-Yesufu, 0. T. y R. T. Ghandi, Clin. Infect. Dis., 52(6): 780-7 (2011); y Nyamweya et al., Rev. Med. Virol., 23(4): 221-40 (2013)).
El síndrome agudo del VIH, caracterizado por síntomas pseudogripales, se desarrolla de tres a cinco semanas después de la infección inicial y se asocia con altos niveles de viremia (Daar et al., New Engl. J. Med., 324: 961-964 (1991); y Clark et al., New Engl. J. Med., 324: 954-960 (1991)). Dentro de las cuatro a seis semanas del inicio de los síntomas, la respuesta inmunitaria específica del VIH es detectable (Albert et al., AIDS, 4:107-112 (1990); y Horsburgh et al., Lancet, 334: 637-640 (1989)). Tras la seroconversión, la carga vírica en la sangre periférica disminuye y la mayoría de los pacientes entran en una fase asintomática que puede durar varios años (Pantaleo et al., New Engl. J. Med., 328: 327-335 (1993)). La medición cuantitativa de las concentraciones de VIH en sangre periférica ha contribuido en gran medida a la comprensión de la patogenia de la infección por VIH (Hoe et al., Nature, 373: 123-126 (1995); y Wei et al., Nature, 373: 117-122 (1995)) y se ha demostrado que es un parámetro esencial en el pronóstico y el tratamiento de las personas infectadas por el VIH (Mellors et al., Science, 272: 1167-1170 (1996); Mellors et al., Ann. Intern. Med., 126(12): 946-54 (1997); Chene et al., Lancet, 362: 679-86 (2003); Egger et al., Lancet, 360: 119-29 (2002); Wood et al., J. Infect. Dis., 188: 1421-1425 (2003); y Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Directrices para el uso de agentes antirretrovíricos en adultos y adolescentes infectados por el VIH-1 (julio de 2016)). Las decisiones relativas al inicio o cambios en la terapia antirretrovírica vienen determinadas por el control de las concentraciones de ARN del VIH (carga vírica) en plasma, la cifra de linfocitos T CD4+ y el estado clínico del paciente (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescents (julio de 2016); y Yeni et al., JAMA, 292: 251-265 (2004)). El objetivo del tratamiento antirretrovírico es reducir el virus del VIH en el plasma por debajo de las concentraciones detectables de las pruebas de carga vírica disponibles (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-1 Infected Adults and Adolescents (julio de 2016; Perelson et al., Nature, 387(6629): 188-191 (1997)). Las concentraciones de ARN del VIH en plasma se pueden cuantificar mediante amplificación de ácidos nucleicos o tecnologías de amplificación de señales (Mulder et al., J. Clin. Microbiol., 32: 292-300 (1994); Dewar et al., J. Inf. Diseases, 170: 1172-9 (1994); y Van Gemen et al., J. Virol. Methods, 43: 177-87 (1993)). El documento US-A-2014/087831 divulga un método para detectar el VIH-1 mediante la amplificación del gen INT y la detección con un sistema de sonda doble. Azzania Fibriani et al.: "Low cost HIV-1 quantitative RT-PCR assay in resource-limited settings: Improvement and implementation", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 185(1), 2 de julio de 2012, las páginas 118-123 divulgan un método de diana doble para detectar el VIH-1. Muchas pruebas de ácido nucleico (PAN) existentes para el VIH utilizan una sola sonda para detectar y cuantificar el ARN del VIH. Debido a la alta tasa de mutación del VIH, sin embargo, estos métodos de detección de una sola sonda pueden dar como resultado una subcuantificación o falta de detección de algunas variantes raras del VIH debido a mutaciones acumuladas dentro de la región diana. Las pruebas de ácido nucleico también se realizan normalmente con reactivos de PCR proporcionados en formato líquido que requieren almacenamiento en estado de congelación y pruebas por lotes, y el tiempo de respuesta para la preparación de muestras y la PCR en tiempo real puede exceder varias horas para algunas pruebas.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos y sistemas de detección del VIH más fiables que se proporcionen en un formato que elimine o reduzca las necesidades de almacenamiento y el desperdicio de reactivos de PCR, y que se realicen rápidamente. La presente divulgación proporciona dichos métodos y sistemas.
Breve sumario de la invención
La presente divulgación proporciona un conjunto de secuencias oligonucleotídicas para amplificar y detectar una o más secuencias de ácido nucleico del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) en una muestra, que
comprende: (a) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción del gen de la integrasa (INT) del VIH-1 que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 1, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 2 y una secuencia de sonda oligonucleotídica, y una secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende (i) una primera secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 y un marcador detectable, y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 y un resto desactivador, y (b) un conjunto de cebadores y sonda que amplifica y detecta al menos una porción de la región de repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 5, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 6; y una primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria, y una segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria, en donde cada una de la primera y segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria comprende un marcador detectable y/o un resto desactivador. También se proporciona un método para detectar el VIH-1 en una muestra utilizando el conjunto de oligonucleótidos mencionado anteriormente.
La divulgación también proporciona un kit para detectar el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en una muestra que comprende: (a) y (b) el conjunto de oligonucleótidos definido anteriormente, reactivos para amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico, y (d) instrucciones de uso.
La divulgación proporciona una composición para detectar un virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en una muestra que comprende: el conjunto de oligonucleótidos definido anteriormente.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una gráfica que ilustra el límite de detección (L0D, Limit Of Detection) del VIH-1 ALINITY m™, en la que se representan las probabilidades observadas y ajustadas frente a la concentración para todos los lotes combinados.
La FIG. 2 es una gráfica que ilustra la linealidad del VIH-1 ALINITY m™, en la que se representa la regresión lineal y no lineal con todos los elementos de la serie.
La FIG. 3 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados para los elementos de la serie de ALINITY m™ HIV-1 dentro del intervalo lineal.
La FIG. 4 es una gráfica de los diagramas de regresión lineal y no lineal del subtipo A del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 con todos los elementos de la serie.
La FIG. 5 es una gráfica de los diagramas de regresión lineal y no lineal del subtipo BF del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 con todos los elementos de la serie.
La FIG. 6 es una gráfica de los diagramas de regresión lineal y no lineal del subtipo C del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 con todos los elementos de la serie.
La FIG. 7 es una gráfica de los diagramas de regresión lineal y no lineal del subtipo AG del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 con todos los elementos de la serie.
La FIG. 8 es una gráfica de los diagramas de regresión lineal y no lineal del subtipo F del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 con todos los elementos de la serie.
La FIG. 9 es una gráfica de los diagramas de regresión lineal y no lineal del subtipo G del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 con todos los elementos de la serie.
La FIG. 10 es una gráfica del diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo A del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 11 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo BF del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 12 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo C del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal con los valores atípicos eliminados. La FIG. 13 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo D del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 14 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo AE del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 15 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo AG del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 16 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo F del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 17 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo G del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 18 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del subtipo H del Grupo M de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 19 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del Grupo N de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 20 es un diagrama de regresión de mínimos cuadrados de linealidad del Grupo 0 de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal.
La FIG. 21 es un diagrama de la regresión de mínimos cuadrados combinada de los subtipos A, B, BF, C, D, AE, AG, F, G, H del Grupo M, el Grupo N y el Grupo 0 de ALINITY m™ HIV-1 para los elementos de la serie dentro
del intervalo lineal.
La FIG. 22 es un diagrama que muestra la media de cada elemento de la serie y la línea de regresión a partir de puntos de datos individuales para los subtipos A, B, BF, C, D, AE, AG, F, G, H del Grupo M, el Grupo N y el Grupo <3 mediante ALINITY m™ HIV-1 dentro del intervalo lineal.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona un conjunto de oligonucleótidos para amplificar y detectar el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) en una muestra. El término "oligonucleótido", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico corta que comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 nucleótidos (p. ej., aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 o 100 nucleótidos, o un intervalo definido por cualquiera de los valores anteriores). La expresión "ácido nucleico" y el término "polinucleótido", como se utilizan en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula y, por lo tanto, incluyen ADN monocatenario y bicatenario, y ARN monocatenario y bicatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN hechos de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, por ejemplo, polinucleótidos metilados y/o protegidos. Los ácidos nucleicos normalmente se unen a través de enlaces de fosfato para formar secuencias de ácido nucleico o polinucleótidos, aunque en la técnica se conocen muchos otros enlaces (p. ej., fosforotioatos, boranofosfatos y similares).
Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o pueden contener porciones de secuencias tanto bicatenarias como monocatenarias. El oligonucleótido puede ser ADN, ADN genómico y complementario (ADNc), ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y combinaciones de bases incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los oligonucleótidos se pueden obtener mediante métodos de síntesis química o métodos recombinantes. Una secuencia oligonucleotídica particular puede abarcar variantes de la misma modificadas de forma conservadora (p. ej., sustituciones de codones), alelos, ortólogos, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, Single Nucleotide Polymorphisms) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente.
Sondas y cebadores oligonucleotídicos
Los oligonucleótidos se utilizan en una variedad de aplicaciones en biotecnología, tales como, por ejemplo, síntesis de genes artificiales, como cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la secuenciación del ADN y como sondas moleculares. Los oligonucleótidos descritos en el presente documento se pueden utilizar como cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos o como sondas para la hibridación y detección de ácidos nucleicos. El término "cebador", y las expresiones "secuencia de cebador" y "cebador oligonucleotídico", como se utilizan en el presente documento, se refieren a un oligonucleótido que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de un producto de extensión de cebador que es una cadena complementaria de ácido nucleico (todos los tipos de ADN o ARN), cuando se coloca en condiciones de amplificación adecuadas (p. ej., tampón, sal, temperatura y pH) en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización de ácidos nucleicos (p. ej., una polimerasa dependiente de ADN o dependiente de ARN). Un cebador puede ser monocatenario o bicatenario. Si es bicatenario, la imprimación puede tratarse primero (p. ej., desnaturalizarse) para permitir la separación de sus hebras antes de utilizarse para preparar productos de extensión. Dicha etapa de desnaturalización normalmente se realiza mediante calor, pero, como alternativa, se puede llevar a cabo mediante un álcali, seguido de neutralización. Los cebadores de la presente divulgación pueden ser de cualquier tamaño adecuado. Los cebadores de la presente divulgación pueden contener nucleótidos adicionales además de los descritos en el presente documento. Por ejemplo, dependiendo del tipo de proceso de amplificación empleado, los cebadores pueden incluir, por ejemplo, un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción 5' con respecto a la secuencia de unión a la diana (véanse, p. ej., patentes de EE. UU. n.° 5.270.184 y 5.455.166), o un promotor de ARN polimerasa unido a la secuencia de unión a la diana del cebador. Un "cebador directo" es un cebador que se hibrida (o se empareja) con una secuencia de ácido nucleico diana (p. ej., cadena molde) para la amplificación. Un "cebador inverso" es un cebador que se hibrida (o se empareja) con la cadena complementaria de la secuencia diana durante la amplificación. Un cebador directo se hibrida con una secuencia diana 5' con respecto a un cebador inverso.
El término "sonda", y las secuencias "secuencia de sonda", y "sonda oligonucleotídica", se refieren a un oligonucleótido que puede hibridarse selectivamente con al menos una porción de una secuencia diana en condiciones de amplificación apropiadas (p. ej., una porción de una secuencia diana que se ha amplificado). En general, una secuencia de sonda se identifica como "complementaria" (es decir, complementaria a la cadena codificante o sentido (+)), o "complementaria inversa" (es decir, complementaria a la cadena antisentido (-)). Una sonda puede ser monocatenaria o bicatenaria. Si es bicatenaria, una secuencia de sonda oligonucleotídica comprende una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un marcador detectable y una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un resto desactivador, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 9.388.455. Las sondas de la presente divulgación pueden tener cualquier tamaño adecuado.
Como se utilizan en el presente documento, los términos "conjunto", "conjunto de cebadores", "conjunto de sondas", y "conjunto de cebadores y sonda", se refiere a dos o más cebadores oligonucleotídicos que juntos son capaces de cebar la amplificación de una secuencia diana o ácido nucleico diana de interés (p. ej., una secuencia diana dentro del VIH-1) y/o al menos una sonda que puede detectar la secuencia diana o ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la expresión "conjunto de cebadores" se refiere a un par de cebadores que incluyen un cebador directo (o cebador 5' (en dirección 5')) que se hibrida con el extremo 5' de la secuencia diana o del ácido nucleico diana que se va a amplificar y un cebador inverso (o cebador 3' (en dirección 3')) que se hibrida con el complemento de la secuencia diana o del ácido nucleico diana que se va a amplificar. Dichos conjuntos de cebadores o pares de cebadores son particularmente útiles en las reacciones de amplificación por PCR.
El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento puede utilizarse para amplificar una o más secuencias de ácido nucleico de VIH-1 diana en una muestra. Las expresiones "secuencia diana" y "ácido nucleico diana" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a una secuencia de ácido nucleico específica, cuya presencia o ausencia se va a detectar mediante el método divulgado. En el contexto de la presente divulgación, una secuencia diana incluye preferentemente una secuencia de ácido nucleico con la que se hibridarán uno o más cebadores, y a partir de la cual se iniciará la amplificación. La secuencia diana también puede incluir una región de hibridación de sonda con la que una sonda puede formar un híbrido estable en condiciones de amplificación apropiadas. Una secuencia diana puede ser monocatenaria o bicatenaria, y se puede amplificar y detectar más de una secuencia diana. Las secuencias de cebador y sonda descritas en el presente documento pueden dirigirse a cualquier secuencia de ácido nucleico adecuada, o combinación de secuencias, presentes en el genoma del VIH-1.
El VIH-1 comprende dos copias de ARN de sentido positivo, sin corte y empalme, unidas de forma no covalente, encerradas en una cápside cónica que comprende la proteína vírica p24, típica de los lentivirus (Montagnier, Luc., Human Immunodeficiency Viruses (Retroviridae). Encyclopedia of Virology (2.a edición), págs. 763-774 (1999); y Lu et al., J. Mol. Biol., 410(4): 609-633 (2011)). La forma integrada del VIH-1, también conocida como provirus, es de aproximadamente 9,8 kilobases de longitud (Muesing et al., Nature, 313(6002): 450-458 (1985)). Ambos extremos del provirus están flanqueados por una secuencia repetida conocida como repetición terminal larga (LTR). Los genes del VIH-1 están ubicados en la región central del ADN provírico y codifican al menos nueve proteínas (Gallo et al., Nature, 333(6173): 504 (1988)), que se dividen en tres clases diferentes: proteínas estructurales, proteínas reguladoras y proteínas accesorias. Las principales proteínas estructurales incluyen Gag, Pol y Env, con las proteínas Gag y Pol traducidas inicialmente como una poliproteína Gag-Pol. Gag es una poliproteína que codifica componentes de la cápside vírica. La poliproteína Pol codifica la transcriptasa inversa (RT), integrasa (INT) y proteasa (PR), que transcribe inversamente el ARN vírico en ADN bicatenario, integra el genoma vírico en el cromosoma de una célula hospedadora y escinde las proteínas derivadas de Gag-Pol en polipéptidos funcionales, respectivamente. Las proteínas Env son proteínas de envoltura implicadas en la unión vírica y la fusión con las células diana. Las proteínas reguladoras del VIH-1 incluyen Tat y Rev, y las proteínas accesorias del VIH-1 incluyen Vpu, Vpr, Vif y Nef.
El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en cualquier número de sondas y cebadores oligonucleotídicos para amplificar y detectar cualquier número adecuado de secuencias de ácido nucleico del VIH. El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento comprende, consiste esencialmente en o consiste en un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción del gen de la integrasa (TNT) del VIH-1 y un conjunto de cebador y sonda que amplifica y detecta al menos una porción de una región de repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, para producir dos amplicones de VIH-1. Una "porción" de una secuencia de ácido nucleico comprende al menos diez nucleótidos (p. ej., de aproximadamente 10 a aproximadamente 5000 nucleótidos). Preferentemente, una "porción" de una secuencia de ácido nucleico comprende 10 o más (p. ej., 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más, 50 o más, o 100 o más) nucleótidos, pero menos de 5000 (p. ej., 4900 o menos, 4000 o menos, 3000 o menos, 2000 o menos, 1000 o menos, 800 o menos, 500 o menos, 300 o menos, o 100 o menos) nucleótidos. Como se utiliza en el presente documento, el término "amplicón" se refiere a un producto de una reacción de amplificación natural o artificial.
En una realización, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento comprende, consiste esencialmente en o consiste en (a) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción de la integrasa del VIH-1 (INT) como se define en la reivindicación 1 y (b) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción de una región de repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, como se define en la reivindicación 1. La sonda oligonucleotídica del conjunto de cebadores y sonda que amplifica y detecta una porción del gen INT del VIH-1 es bicatenaria y comprende una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un marcador detectable y una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un resto desactivador (como se describe en la patente de EE. UU. n.° 9.388.455). La primera secuencia de ácido nucleico comprende un marcador detectable que puede comprender la SEQ ID NO: 3, mientras que la segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un resto desactivador puede comprender la SEQ ID NO: 4. La primera y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica del conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta una porción de la región LTR del VIH-1 también son bicatenarias y cada una comprende una primera secuencia de ácido nucleico que comprende un marcador detectable y una segunda secuencia de ácido nucleico que comprende un resto desactivador. Por ejemplo,
la primera secuencia de sonda oligonucleotídica puede comprender las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica puede comprender las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. El conjunto anterior de oligonucleótidos también se denomina VIH-1 ALINITY m™.
El conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento comprende un diseño de "diana doble", a diferencia de otras pruebas de ácido nucleico del VIH-1 disponibles en el mercado que detectan y cuantifican una sola secuencia diana del VIH-1 (p. ej., el ensayo REALTIME HIV-1 de Abbott (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL; y el ensayo de carga vírica XPERT® HIV-1 (Cepheid, Sunnyvale, CA)). El tiempo de respuesta para la preparación de la muestra y la PCR en tiempo real para dichos sistemas de detección de "una sola diana" puede superar las seis horas en algunos casos. En cambio, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento permite el análisis de muestra a resultado en aproximadamente dos horas. Adicionalmente, como se ha indicado anteriormente, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento mejora la fiabilidad de la detección del VIH-1, ya que el conjunto amplifica y detecta dos regiones separadas del genoma del VIH-1 en lugar de una sola región.
Como alternativa o adicionalmente, el conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta una porción del gen de la INT del VIH-1 puede comprender una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36. De manera análoga, el conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta una porción del gen de la INT del VIH-1 puede comprender, alternativa o adicionalmente, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en cualquiera de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42.
Como alternativa o adicionalmente, la primera o segunda sonda oligonucleotídica del conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta una porción de la LTR de VIH-1 puede comprender la SEQ ID NO: 43 y/o SEQ ID NO: 44. En otra realización, el conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta una porción de la región LTR del VIH-1 puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 45, una primera secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 46, una segunda secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la s Eq ID NO: 47 y una secuencia de sonda oligonucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 48. En otra alternativa más, el conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta una porción de la región LTR del VIH-1 comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 49, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 50, una primera secuencia de sonda oligonucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 51, y una segunda secuencia de sonda oligonucleotídica que comprende la SEQ ID NO: 52.
Una cualquiera o una combinación de los oligonucleótidos descritos en el presente documento puede modificarse de cualquier manera adecuada para estabilizar o mejorar la afinidad de unión (también denominada "temperatura de fusión" o "Tf") de una sonda o un cebador oligonucleotídico por su diana. A este respecto, una secuencia oligonucleotídica como se describe en el presente documento puede comprender una o más bases de oligonucleótidos modificadas. Por ejemplo, la secuencia oligonucleotídica puede comprender una o más bases modificadas con propino, en donde el oligonucleótido comprende un alquino con la fórmula química CH3CECH. La una o más bases modificadas con propino pueden incluir, por ejemplo, 5-(1-propinil)-2'-desoxi-uridina (pdU) y/o 5-(1-propinil)-2'-desoxicitidina (pdC).
Una cualquiera de las secuencias oligonucleotídicas descritas en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en un complemento de cualquiera de las secuencias divulgadas en el presente documento. El término "complemento" o la expresión "secuencia complementaria", como se utilizan en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que forma un dúplex estable con un oligonucleótido descrito en el presente documento a través de las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick y, por lo general, comparte aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 81 %, aproximadamente el 82 %, aproximadamente el 83 %, aproximadamente el 84 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 86 %, aproximadamente el 87 %, aproximadamente el 88 %, aproximadamente el 89 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % más de identidad con el oligonucleótido divulgado. La identidad de la secuencia de ácido nucleico se puede determinar mediante cualquier algoritmo matemático adecuado o software informático conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, CLUSTAL-W, T-Coffee y ALIGN (para la alineación de secuencias de ácido nucleico y aminoácidos), programas BLAST (p. ej., BLAST 2,1, BL2SEQ y versiones posteriores del mismo) y programas FASTA (p. ej., FASTA3X, FASTM y SSEARCH) (para la alineación de secuencias y búsquedas de similitud de secuencias). Los algoritmos de alineación de secuencias también se divulgan en, por ejemplo, Altschul et al., J. Molecular Biol, 215(3): 403-410 (1990); Beigert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 106(10): 3770-3775
(2009), Durbin et al., eds., Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, RU (2009); Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005); Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997); y Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge RU (1997)).
Los oligonucleótidos descritos en el presente documento se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, una variedad de los cuales son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, 2. Suμl. Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press: Nueva York, N. Y.; M. A. Innis (Ed.), PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press: Nueva York, N. Y. (1990); P. Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes - Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (Partes I y II), Elsevier Science (1993); M. A. Innis (Ed.), PCR Strategies, Academic Press: Nueva York, N. Y. (1995); F. M. Ausubel (Ed.), Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons: Secaucus, N. J. (2002); Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90-98 (1979); Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109-151 (1979); y Belousov et al., Nucleic Acids Res., 25: 3440-3444 (1997)). Los pares de cebadores también se pueden diseñar mediante una variedad de herramientas, tales como la herramienta Primer-BLAST proporcionada por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). La síntesis de oligonucleótidos se puede realizar en sintetizadores de oligonucleótidos como los comercializados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) o Milligen (Bedford, MA). Como alternativa, los oligonucleótidos pueden fabricarse a la medida y obtenerse de una variedad de fuentes comerciales bien conocidas en la técnica, que incluye, por ejemplo, the Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), Eurofins Scientific (Louisville, KY), BioSearch Technologies, Inc. (Novato, CA), y similares. Los oligonucleótidos se pueden purificar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida nativa, HPLC de intercambio aniónico (véase, p. ej., Pearson et al., J. Chrom., 255: 137-149 (1983)), y HPLC de fase inversa (véase, p. ej., McFarland et al., Nucleic Acids Res., 7: 1067 1080 (1979)).
La secuencia de los cebadores y las sondas se puede verificar mediante cualquier método de secuenciación adecuado conocido en la técnica, que incluye, pero sin limitación, degradación química (véase, p. ej., Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499-560 (1980)), espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-T0F) (véase, p. ej., Pieles et al., Nucleic Acids Res., 21: 3191-3196 (1993)), espectrometría de masas después de una combinación de digestiones con fosfatasa alcalina y exonucleasa (Wu et al. Anal. Biochem., 290: 347-352 (2001)) y similares.
Las sondas y los cebadores oligonucleotídicos descritos en el presente documento comprenden deseablemente una temperatura de fusión (Tf) en el intervalo de 45 °C a 80 °C. De acuerdo con la presente divulgación, los oligonucleótidos se hibridan específicamente con una secuencia de ácido nucleico de VIH-1 diana sin presentar una hibridación significativa con los ácidos nucleicos que no son de VIH-1. Adicionalmente, los oligonucleótidos se seleccionan de manera que se hibriden con regiones conservadas en el genoma del VIH-1, minimizando así los emparejamientos incorrectos con la secuencia diana. Esta selección garantiza que los oligonucleótidos sean capaces de hibridarse con ácidos nucleicos de VIH-1 de todos los grupos y subtipos. Por otra parte, los oligonucleótidos se seleccionan de modo que muestren la menor probabilidad de formación de dímeros y contengan mínimas repeticiones de secuencia. Dichas propiedades pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el programa de modelado informático 0LIG0® Primer Analysis Software (distribuido por National Biosciences, Inc., Plymouth, Minnesota).
Marcador detectable
Una cualquiera o más de las secuencias de sondas y cebadores oligonucleotídicos descritas en el presente documento pueden comprender un marcador detectable, de modo que se pueda visualizar el cebador y/o la sonda, después de unirse a otra entidad (p. ej., un producto de amplificación o amplicón). La expresión "marcador detectable", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un resto o compuesto que genera una señal que se puede medir y cuya intensidad está relacionada con (p. ej., es proporcional a) la cantidad de entidad unida al mismo. Puede utilizarse cualquier marcador detectable adecuado que pueda conjugarse o unirse a un oligonucleótido para detectar la unión del oligonucleótido a una secuencia diana, muchos de los cuales son conocidos en la técnica. En una realización, el marcador detectable puede detectarse indirectamente. Los marcadores detectables indirectamente normalmente son miembros de unión específica utilizadas junto con un "conjugado" que está unido o acoplado a un marcador detectable directamente. Las químicas de acoplamiento para sintetizar dichos conjugados son bien conocidas en la técnica y están diseñadas de manera que la propiedad de unión específica del miembro de unión específica y la propiedad detectable del marcador permanezcan intactas. Como se utiliza en el presente documento, "miembro de unión específica" y "conjugado" se refieren a los dos miembros de una pareja de unión, es decir, dos moléculas diferentes, donde el miembro de unión específica se une específicamente al polinucleótido de la presente divulgación, y el "conjugado" se une específicamente al miembro de unión específica. La unión entre los dos miembros de la pareja normalmente es de naturaleza química o física. Los ejemplos de dichos pares de unión incluyen, pero sin limitación, antígenos y anticuerpos, avidina/estreptavidina y biotina, haptenos y anticuerpos específicos para haptenos, secuencias de nucleótidos complementarias, cofactores/sustratos enzimáticos y enzimas, y similares.
En otra realización, el marcador detectable puede detectarse directamente. Dichos marcadores detectables directamente incluyen, por ejemplo, radioisótopos, fluoróforos, quimioluminóforos, enzimas, partículas coloidales, micropartículas fluorescentes, colorantes intercalantes (p. ej., SYBR Green o bromuro de etidio), y similares. En una realización, el marcador detectable puede ser un fluoróforo, tal como un colorante de la familia de la fluoresceína, colorante de la familia de la polihalofluoresceína, colorante de la familia de la hexaclorofluoresceína, colorante de la familia de la cumarina, colorante de la familia de la rodamina, colorante de la familia de la cianina, colorante de la familia de la oxazina, colorante de la familia de la tiazina, colorante de la familia del escuadramo, colorante de la familia del lantánido quelado, colorante de la familia del azo, colorante de la familia del trifenilmetano o un colorante de la familia de B0DIPY®. Entre los ejemplos de fluoróforos se incluyen, pero sin limitación, FAM™, HEX™, J0E™, NED™, PET®, R0X™, TAMRA™, T0T™, TEXAS RED® y VIC®. Un experto en la materia apreciará que los marcadores detectables directamente pueden requerir componentes adicionales, tales como sustratos, reactivos desencadenantes, luz, y similares, para habilitar la detección del marcador. Los métodos para marcar oligonucleótidos, tales como sondas, son bien conocidos en la técnica y se describen en, p. ej., L. J. Kricka, Ann. Clin. Biochem., 39: 114-129 (2002); van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 1: 81-91 (2001); Joos et al., J. Biotechnol., 35: 135-153 (1994); Smith et al., Nucl. Acids Res., 13: 2399-2412 (1985); Connoly et al., Nucl. Acids. Res., 13: 4485-4502 (1985); Broker et al., Nucl. Acids Res., 5: 363-384 (1978); Bayer et al., Methods of Biochem. Analysis, 26: 1-45 (1980); Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 78: 6633-6637 (1981); Richardson et al., Nucl. Acids Res., 11: 6167-6184 (1983); Brigati et al., Virol., 126: 32-50 (1983); Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 81: 3466-3470 (1984); Landegent et al., Exp. Cell Res., 15: 61-72 (1984); A. H. Hopman et al., Exp. Cell Res., 169: 357-368 (1987); y Temsamani et al., Mol. Biotechnol., 5: 223-232 (1996).
Cualquiera o más de las secuencias sondas y cebadores oligonucleotídicos descritos en el presente documento también pueden comprender un resto desactivador. Cuando un marcador detectable (p. ej., un fluoróforo) y un resto desactivador se mantienen muy cerca, tal como en los extremos de una sonda, el resto desactivador evita la detección de una señal (p. ej., fluorescencia) del marcador detectable. Cuando las dos mitades están físicamente separadas, tal como después de la escisión por una ADN polimerasa, la señal se vuelve detectable. El desactivador se puede seleccionar de cualquier desactivador adecuado conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, BLACK H0LE QUENCHER® 1 (BHQ-1®), BLACK H0LE QUENCHER® 2 (BHQ-2®), BLACK H0LE QUENCHER®-1-dT (BHQ-1dT®), BLACK H0LE QUENCHER®-2-dT (BHQ-2dT®),I0WA BLACK® FQ y I0WA BLACK® RQ. Por ejemplo, una sonda oligonucleotídica puede comprender un fluoróforo FAM y un desactivador BHQ-1dT® o un desactivador BHQ-2dT®.
Cada una de las secuencias de sonda oligonucleotídica del conjunto de secuencias oligonucleotídicas para amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico de VIH-1 descrita en el presente documento comprende deseablemente un marcador detectable. Cada una de las sondas se puede marcar con el mismo marcador detectable o con diferentes marcadores detectables. Cuando las sondas comprenden el mismo marcador detectable (p. ej., FAM), la amplificación de la porción del gen INT del VIH y la región LTR se detectan como una sola señal durante la PCR en tiempo real. Cuando cada sonda comprende un marcador detectable diferente, la amplificación del gen INT del VIH y la región LTR se detectan como dos señales separadas.
La selección de una técnica de marcaje en particular dependerá de varios factores, tales como la facilidad y el coste del método de marcaje, el espaciado espectral entre diferentes marcadores detectables utilizados, la calidad del marcaje de la muestra deseada, los efectos del resto detectable en la reacción de hibridación (p. ej., en la velocidad y/o eficiencia del proceso de hibridación), la naturaleza del método de amplificación utilizado, la naturaleza del sistema de detección, la naturaleza e intensidad de la señal generada por el marcador detectable, y similares.
Control interno
El conjunto de oligonucleótidos para detectar el VIH-1 descrito en el presente documento puede comprender además secuencias de sondas y cebadores oligonucleotídicos para amplificar y detectar una secuencia de control interno (CI). En una realización, las secuencias de control interno se añaden a cada reacción de preparación de muestra. Luego, el control interno se procesa a través de todo el procedimiento de preparación y amplificación de la muestra junto con las muestras de prueba y los calibradores (si están presentes), a fin de demostrar el procesamiento adecuado de la muestra y la validez del ensayo. El control interno puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico adecuada que no sea del VIH, que incluye, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica GAPDH, beta2-mcroglobulina, beta-actina, R18 o ARN 16S. En algunas realizaciones, el control interno deseablemente comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia diana de ARN blindado. La expresión "ARN blindado", como se utiliza en el presente documento, se refiere al ARN resistente a la ribonucleasa que es un complejo de proteína de la cubierta del bacteriófago MS2 y ARN producido en Escherichia coli mediante la inducción de un plásmido de expresión que codifica la proteína de la cubierta y una secuencia patrón de ARN (véase, p. ej., Pasloske et al., J. Clin. Microbiol., 36(12): 3590-359 (1998); y las patentes de EE. UU. n.° 5.677.124, 5.919.625 y 5.939.262). En una realización, por ejemplo, el control interno puede comprender una secuencia de ARN derivada u obtenida del gen de la hidroxipiruvato reductasa de la planta de calabaza, Curcurbita pepo. En este sentido, el conjunto de oligonucleótidos descrito en el presente documento puede comprender además una secuencia de cebador oligonucleotídico directo de control interno que comprende la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso de control interno que comprende la SEQ ID NO: 12, y una
secuencia de sonda oligonucleotídica de control interno que comprende la SEQ ID NO: 13. La sonda de control interno deseablemente comprende un marcador detectable, tal como cualquiera de los descritos en el presente documento. En una realización, la sonda de control interno puede comprender un marcador diferente al de las sondas utilizadas para detectar el VIH-1, lo que permite la detección y diferenciación simultáneas de los productos del control interno y los productos amplificados por el VIH dentro de la misma reacción. La sonda de control interno también puede comprender un resto desactivador, tal como cualquiera de los descritos en el presente documento.
Método para amplificar y detectar el VIH-1
La presente divulgación proporciona un método para detectar un virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en una muestra que se sospecha que contiene VIH-1. El método comprende: (a) poner en contacto una muestra obtenida de un ser humano con el conjunto de secuencias oligonucleotídicas descritas en el presente documento, y reactivos para la amplificación y detección de secuencias de ácido nucleico, (b) amplificar una porción del gen INT del VIH-1 y una porción de la LTR del VIH-1 presente en la muestra, hibridar la sonda oligonucleotídica que detecta una porción del gen INT del VIH-1 con la porción amplificada del gen INT del VIH-1, y/o hibridar la primera y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica que detectan una porción de la región LTR del VIH-1 con la porción amplificada de la región LTR del VIH-1, (d) detectar la hibridación de las secuencias de sondas oligonucleotídicas con las porciones del gen INT del VIH-1 y/o la región LTR evaluando una señal procedente de cada uno de los marcadores detectables, mediante lo que (i) la presencia de la señal procedente del marcador detectable en la secuencia de sonda oligonucleotídica que detecta al menos una porción del gen INT del VIH-1 indica la hibridación de la secuencia de sonda oligonucleotídica con la porción del gen INT del VIH-1 y la presencia de VIH-1 en la muestra; y/o (ii) la presencia de una señal procedente de la primera secuencia de sonda oligonucleotídica y/o la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica indica la hibridación de la primera secuencia de sonda oligonucleotídica y/o la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica con la porción de la región LTR y la presencia de VIH-1 en la muestra, y (iii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VIH-1 en la muestra. Las descripciones de las sondas y los cebadores oligonucleotídicos expuestos en el presente documento con respecto al conjunto de oligonucleótidos mencionado anteriormente también son aplicables a esos mismos aspectos del método divulgado.
Como se define en el presente documento, se "sospecha" que una muestra contiene VIH-1 si la muestra se obtiene de un sujeto, preferentemente un ser humano, que se sospecha que está infectado con el VIH-1. Se sospecha que un sujeto está infectado con el VIH-1 si el sujeto tiene un mayor riesgo de contraer el VIH-1. Los factores de riesgo para la infección por VIH-1 incluyen, por ejemplo, tener relaciones sexuales sin protección, la infección con otra enfermedad de transmisión sexual (ETS), el uso de drogas por vía intravenosa, ser un varón incircunciso, ser un hombre gay o bisexual y la recepción de transfusiones de sangre (véase, p. ej., Hoja informativa mundial: VIH/SIDA I. Conceptos básicos sore el VIH/SIDA, 20.a Conferencia Internacional sobre el SIDA (2014)).
La muestra puede ser cualquier muestra adecuada obtenida de cualquier sujeto adecuado, normalmente un mamífero, tal como un ser humano. La muestra puede obtenerse de cualquier fuente biológica, tal como, un hisopo o cepillo cervical, vaginal o anal, o un fluido fisiológico que incluya, pero sin limitación, sangre completa, suero, plasma, líquido intersticial, saliva, líquido del cristalino, líquido cefalorraquídeo, sudor, orina, leche, líquido ascítico, moco, líquido nasal, esputo, líquido sinovial, líquido peritoneal, secreción vaginal, menstruo, líquido amniótico, semen, y similares. La muestra se puede obtener del sujeto mediante técnicas habituales conocidas por los expertos en la materia, y la muestra se puede utilizar directamente como se obtiene de la fuente biológica o tras un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. Dicho pretratamiento puede incluir, por ejemplo, preparación de plasma a partir de sangre, dilución de líquidos viscosos, filtración, precipitación, dilución, destilación, mezclado, concentración, inactivación de componentes interferentes, adición de reactivos, lisado, etc. Una vez obtenida la muestra de ensayo de un sujeto, la muestra se puede poner en contacto con el conjunto de oligonucleótidos como se describe en el presente documento para formar una mezcla de reacción. A continuación, la mezcla de reacción se coloca en condiciones de amplificación. Los cebadores hibridan con una secuencia de ácido nucleico diana dentro del gen INT del VIH-1 y/o la región LTR del VIH-1 si están presentes en la muestra, y la porción del gen INT del VIH-1 y/o la región LTR del VIH-1 presentes en la muestra se amplifican.
La amplificación de una secuencia de ácido nucleico del VIH-1 en la muestra se puede realizar mediante cualquier método de amplificación de secuencias de ácido nucleico adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), PCR en tiempo real, amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación por círculo rodante, amplificación a base de secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) y reacción en cadena de la ligasa (LCR).
Debido a que el VIH-1 comprende un genoma de ARN, la amplificación de las secuencias de ácido nucleico del VIH-1 se realiza deseablemente mediante RT-PCR, tal como, por ejemplo, RT-PCR en tiempo real. "RT-PCR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la reacción enzimática en donde se sintetizan fragmentos de ADN complementario (ADNc) a partir de una plantilla de sustrato de ARN. La reacción normalmente implica el uso de un cebador oligonucleotídico sintético, que es complementario a las secuencias de nucleótidos en el sustrato de ARN, y el uso de una enzima transcriptasa inversa. La reacción consiste en un ciclo, en el que los cebadores
oligonucleotídicos, que están presentes en gran exceso, se hibridan con el sustrato de ARN para formar estructuras bicatenarias a lo largo de secuencias de nucleótidos complementarias. Los complejos de cebador-sustrato de ADN:ARN servirán luego como sitios de iniciación para una reacción de síntesis de ADNc catalizada por la transcriptasa inversa, dando lugar a la síntesis de una cadena de ADNc complementaria a la cadena de a Rn . El ARN puede ser un ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), Ar N genómico (ARNg), ARN ribosómico (ARNr) o un ARN nuclear pequeño (ARNnp). Los métodos y reactivos para RT-PCR se conocen bien en la técnica y se encuentran disponibles en el mercado de una variedad de fuentes (véase, p. ej., Freeman et al., Biotechniques, 26(1): 112-122, 142-125 (1999); Joyce, C., Methods Mol. Biol, 193: 83-92 (2002); y 0'Connell, J. (ed.), RT-PCR Protocols, 1.a Ed., Springer-Verlag, Nueva York, NY (2010)). La transcripción inversa se puede realizar mediante técnicas de una o dos etapas conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, mediante el uso de kits de transcripción inversa disponibles de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) Qiagen (Hilden, Alemania) y Promega Corp. ej. (Madison, WI).
"PCR en tiempo real", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un método de PCR en el que se mide la acumulación de producto de amplificación a medida que avanza la reacción, en tiempo real, con la cuantificación del producto después de cada ciclo, a diferencia de la PCR convencional en donde el producto de ADN amplificado se detecta en un análisis de punto final. La PCR en tiempo real también se conoce en la técnica como "PCR cuantitativa (qPCR)". La detección en tiempo real de los productos de la PCR suele implicar el uso de colorantes fluorescentes no específicos que se intercalan con cualquier ADN bicatenario y sondas de ADN marcadas con fluorescencia específicas de secuencia. Las técnicas y sistemas de PCR en tiempo real son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Dorak, M. Tevfik, ed. Real-time PCR. Taylor y Francis (2007); y Fraga et al., "PCR en tiempo real", Current protocols essential laboratory techniques: 10-3 (2008)) están disponibles de una variedad de fuentes comerciales (p. ej., sistema PCR m2000rt REALTIME™ (Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL); sistemas de detección de PCR en tiempo real CFX (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA); y el sistema de PCR en tiempo real TAQMAN™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)), cualquiera de los cuales puede emplearse en los métodos descritos en el presente documento.
Tras la amplificación de una porción del gen INT del VIH-1 y/o una porción de la región LTR del VIH-1, si están presentes en la muestra, el método descrito en el presente documento comprende además hibridar la sonda oligonucleotídica que detecta una porción del gen INT del VIH-1 con la porción amplificada del gen INT del VIH-1 e hibridar la primera y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica que detectan una porción de la región LTR del VIH-1 con la porción amplificada de la región LTR del VIH-1. En una realización, una mezcla de reacción que comprende se puede poner en contacto un amplicón de INT del VIH y un amplicón de LTR del VIH-1 con sondas oligonucleotídicas, como se describe en el presente documento, que se hibridan preferentemente con una secuencia de ácido nucleico diana del amplicón, o del complemento del mismo, en condiciones restrictivas de hibridación y lavado, formando así un híbrido bicatenario que es estable para la detección. "Hibridación" como se utiliza en el presente documento, se refiere a la formación de una estructura bicatenaria mediante dos ácidos nucleicos monocatenarios debido al apareamiento de bases complementarias. La hibridación puede ocurrir entre cadenas de ácido nucleico completamente complementarias o entre cadenas de ácido nucleico "sustancialmente complementarias" que contienen regiones menores de emparejamiento incorrecto. La restricción de las condiciones de hibridación depende de la secuencia y es diferente bajo diferentes parámetros ambientales. Por tanto, las condiciones de hibridación que producen grados particulares de restricción variarán dependiendo de la naturaleza del método de hibridación escogido, y la composición y longitud de las secuencias de ácido nucleico de hibridación. Para los fines de la presente divulgación, las "condiciones restrictivas" abarcan condiciones en las que la hibridación solo se producirá si hay menos del 25 % de emparejamiento incorrecto entre la molécula de hibridación y la secuencia diana. Las "condiciones restrictivas" pueden desglosarse en niveles particulares de restricción para una definición más precisa. Por tanto, como se utiliza en el presente documento, las condiciones de "restricción moderada" son aquellas en las que las moléculas con más del 25 % de emparejamiento incorrecto de secuencia no se hibridan; las condiciones de "restricción media" son aquellas en las que las moléculas con más del 15% de emparejamiento incorrecto no se hibridan, y las condiciones de "alta restricción" son aquellas en las que las secuencias con más del 10% de emparejamiento incorrecto no se hibridarán. Las condiciones de "restricción muy alta" son aquellas en las que las secuencias con más del 6 % de emparejamiento incorrecto no se hibridan. Por el contrario, los ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de "baja restricción" incluyen aquellos con mucha menor identidad de secuencia, o con identidad de secuencia solo en subsecuencias cortas del ácido nucleico. Se pueden seleccionar condiciones restrictivas para que sean inferiores al punto de fusión térmica (Tf) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. La Tf puede ser la temperatura (bajo la fuerza iónica, el pH y la concentración nucleica definidos) a la que el 50 % de un oligonucleótido complementario a una diana se hibrida con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tf, el 50 % de las sondas están ocupadas en el equilibrio). En el método divulgado, se puede utilizar cualquier método y condición adecuados para hibridar sondas oligonucleotídicas con una secuencia de ácido nucleico del VIH diana que se conozcan. Las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos y el cálculo de las restricciones se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2012); Tijssen, Hybridization With Nucleic Acid Probes, Parte 1: Theory and Nucleic Acid Preparation, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993 y Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 5.a ed., John Wiley & Sons, Inc. (2002).
Tras la hibridación de la sonda oligonucleotídica que detecta una porción del gen INT del VIH-1 con la porción amplificada del gen INT del VIH-1, y/o la hibridación de la primera y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica que detectan una porción de la región LTR del VIH-1 con la porción amplificada de la región LTR del VIH-1, el método comprende detectar la hibridación de las secuencias de sondas oligonucleotídicas con las porciones del gen INT del VIH-1 y/o la región LTR evaluando una señal procedente de cada uno de los marcadores detectables, mediante lo que (i) la presencia de las señales indica la hibridación de las secuencias de sondas oligonucleotídicas con el gen INT del VIH-1 y/o la región LTR, y la presencia del VIH-1 en la muestra, y (ii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VIH-1 en la muestra. La detección de señales de las secuencias de sondas oligonucleotídicas se puede realizar mediante una variedad de metodologías bien conocidas, que incluye, por ejemplo, técnicas homogéneas o heterogéneas.
Los métodos de detección homogéneos implican la detección de productos de la reacción de amplificación a medida que se van formando, es decir, en tiempo real. Como resultado, los híbridos de producto/sonda de amplificación se forman y detectan mientras la mezcla de reacción está en condiciones de amplificación. Los métodos de detección homogéneos incluyen, pero sin limitación, el uso de marcadores FRET que se unen a las sondas y emiten una señal en presencia de la secuencia diana, balizas moleculares (véase, Tyagi et al., Nature Biotechnol., 14: 303-308 (1996); Tyagi et al., Nature Biotechnol., 16: 49-53 (1998); Kostrikis et al., Science, 279: 1228-1229 (1998); Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 95: 11538-11543 (1998); Marras et al., Genet. Anal., 14: 151-156 (1999); y las patentes de EE. UU. n.° 5.846.726, 5.925.517, 6.277.581 y 6.235.504), ensayos TAQMAN® (véase, p. ej., patentes de EE. UU. n.° 5.210.015; 5.804.375; 5.487.792 y 6.214.979 y la Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 01/86001), y ensayos de protección de hibridación (HPA) que utilizan sondas marcadas con éster de acridinio (AE) (véase, p. ej., Weeks et al., Clin. Chem., 29: 1474-1479 (1983); Berry et al., Clin. Chem., 34: 2087-2090 (1988)).
Los sistemas de detección heterogéneos generalmente emplean un agente de captura para separar las secuencias amplificadas de otros materiales en la mezcla de reacción. Los agentes de captura normalmente comprenden un material de soporte sólido (p. ej., pocillos de microtitulación, microesferas, chips y similares) recubiertos con una o más secuencias de unión específicas. Una secuencia de unión puede ser complementaria a una secuencia de cola añadida a las sondas oligonucleotídicas de la divulgación. Como alternativa, una secuencia de unión puede ser complementaria a una secuencia de un oligonucleótido de captura, comprendiendo a su vez una secuencia complementaria a una secuencia de cola de una sonda. Tras la separación de los híbridos de producto/sonda de amplificación unidos a los agentes de captura de la mezcla de reacción restante, los híbridos de producto/sonda de amplificación pueden detectarse utilizando cualquier método de detección adecuado conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
El método descrito en el presente documento también comprende la cuantificación de la porción del gen INT del VIH-1 y/o la porción de la región LTR del VIH-1 detectadas como se ha descrito anteriormente. A este respecto, la cuantificación de los productos de PCR en tiempo real se puede realizar mediante métodos de cuantificación relativa o métodos de cuantificación absoluta (véase, p. ej., Dhanasekaran et al., Immunol. Methods, 354 (1-2): 34-39 (2010)). La cuantificación absoluta proporciona el número exacto de moléculas de ADN diana en comparación con los patrones de ADN mediante una curva de calibración, y requiere que la PCR de la muestra y el patrón tengan la misma eficiencia de amplificación (véase, p. ej., Bar et al., Nucleic Acids Research, 40: gkr778 (2011)). La cuantificación relativa se basa en genes de referencia internos para determinar las diferencias en la expresión de un gen diana. La cuantificación relativa se expresa como el cambio en los niveles de expresión de la secuencia diana y no requiere una curva de calibración, ya que la cantidad de la secuencia diana se compara con la cantidad de una secuencia de referencia de control.
Kits y composiciones para amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico del VIH-1
La divulgación también proporciona un kit para amplificar y detectar el VIH-1 en una muestra. El kit comprende conjuntos de cebadores y sondas que amplifican y detectan una porción del gen INT del VIH-1 y/o una porción de la región LTR del VIH-1, y reactivos e instrucciones para amplificar y detectar el VIH-1. Las descripciones de los cebadores oligonucleotídicos y las sondas oligonucleotídicas que se exponen en el presente documento con respecto a los métodos mencionados anteriormente también son aplicables a los mismos aspectos de los kits descritos en el presente documento. Los ejemplos de reactivos adecuados para su inclusión en el kit (además de los cebadores y las sondas oligonucleotídicos descritos en el presente documento) incluyen reactivos convencionales empleados en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, tales como, por ejemplo, una o más enzimas que tienen actividad polimerasa (p. ej., transcriptasa inversa), cofactores enzimáticos (tales como magnesio o dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD)), sales, tampones, trifosfatos de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos (dNTP/rNTP; por ejemplo, trifosfato de desoxiadenosina, trifosfato de desoxiguanosina, trifosfato de desoxicitidina y trifosfato de desoxitimidina), agentes bloqueantes, agentes de marcaje, un colorante de referencia pasivo, conservantes (p. ej., PR0CLIN™), y similares. Muchos de dichos reactivos se describen en el presente documento o son conocidos en la técnica y están se encuentran disponibles en el mercado.
El kit puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en (a) un conjunto de cebadores y sonda que amplifica y detecta una porción del gen de la integrasa (INT) del VIH-1 como se define en la reivindicación 1 y (b) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta un porción de la región de repetición terminal larga (LTR)
del VIH-1, como se define en la reivindicación 1, (c) reactivos para amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico; y (d) instrucciones de uso, en donde cada una de las secuencias de las sondas oligonucleotídicas comprende un marcador detectable y/o un resto desactivador.
El kit puede comprender instrucciones para usar los reactivos de amplificación, y las sondas y los cebadores oligonucleotídicos descritos en el presente documento, p. ej., para procesar la muestra de prueba, extraer moléculas de ácido nucleico y/o realizar la prueba; y para interpretar los resultados obtenidos, así como un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental. Dichas instrucciones pueden estar opcionalmente en forma impresa, proporcionada en línea, en CD, DVD u otro formato de medios grabados.
La presente divulgación también proporciona una composición para amplificar y detectar el VIH-1 en una muestra. La composición comprende, consiste esencialmente en o consiste en el conjunto de oligonucleótidos como se define en la reivindicación 1. Las descripciones de los cebadores oligonucleotídicos y de las sondas oligonucleotídicas que se exponen en el presente documento con respecto a los métodos y el kit mencionados anteriormente también son aplicables a los mismos aspectos de la composición descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la composición comprende un portador, preferentemente un portador farmacéuticamente (p. ej., fisiológicamente) aceptable. Se puede utilizar cualquier portador adecuado dentro del contexto de la divulgación, y dichos portadores son bien conocidos en la técnica. La composición puede ser opcionalmente estéril o estéril a excepción de los oligonucleótidos descritos en el presente documento.
El kit y la composición mencionados anteriormente pueden comprender además sondas y cebadores oligonucleotídicos que amplifiquen y detecten una secuencia de ácido nucleico de control interno, tal como se describe en el presente documento. En este sentido, el kit y/o la composición pueden comprender una secuencia de cebador oligonucleotídico directo de control interno que comprende la SEQ ID NO: 11, Se Q ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso de control interno que comprende la SEQ ID NO: 12, y una secuencia de sonda oligonucleotídica de control interno que comprende la SEQ ID NO: 13 y un marcador detectable. El kit y/o la composición pueden suministrarse en forma sólida (p. ej., liofilizada) o líquida. En una realización, los cebadores oligonucleotídicos, las sondas oligonucleotídicas y otros reactivos se liofilizan (es decir, se criodesecan). Como se ha indicado anteriormente, muchos sistemas de detección del VIH de una sola diana conocidos en la técnica proporcionan reactivos de PCR en formato líquido que requiere almacenamiento en estado de congelación y pruebas por lotes. La liofilización de los diferentes componentes del kit y composición descritos en el presente documento, sin embargo, elimina la necesidad del almacenamiento en estado de congelación y permite que los componentes del ensayo se suministren en formato de dosis unitaria, de modo que los usuarios puedan realizar la cantidad exacta de ensayos requeridos, minimizando así el desperdicio de reactivos. Los diferentes componentes de los kits y la composición de la presente divulgación pueden estar contenidos opcionalmente dentro de diferentes recipientes (p. ej., vial, ampolla, tubo de ensayo, matraz o frasco) para cada componente individual (p. ej., cebadores oligonucleotídicos, sondas oligonucleotídicas o tampón). Cada componente se encontrará generalmente adecuado en alícuotas en su respectivo recipiente o proporcionado en forma concentrada. También se pueden proporcionar otros recipientes adecuados para realizar determinadas etapas del ensayo de amplificación/detección. Los recipientes individuales se mantienen preferentemente en confinamiento cerrado para la venta comercial.
Los siguientes ejemplos ilustran más la invención, pero, por supuesto, no deben interpretarse de ningún modo como limitantes de su alcance.
EJEMPL01
Este ejemplo demuestra un método para amplificar y detectar el VIH-1 en una muestra de acuerdo con la presente divulgación.
Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL) ha desarrollado un ensayo de detección del VIH-1 con nombre comercial ALINITY m™ HIV, que utiliza RT-PCR en tiempo real para amplificar y detectar secuencias genómicas de ARN del VIH extraídas de muestras de suero o plasma humano. El ensayo está previsto que se utilice: 1) para evaluar el pronóstico de una enfermedad midiendo el nivel inicial del VIH-1 y evaluar la respuesta vírica al tratamiento antirretrovírico midiendo los cambios en los niveles de ARN del VIH-1 en plasma; y 2) como una prueba de diagnóstico, para ayudar en el diagnóstico de la infección por VIH-1, así como para confirmar la infección por VIH-1 en plasma o suero de individuos que tienen resultados reactivos repetidos con inmunoensayos de VIH.
El ensayo ALINITY m™ HIV-1 consiste en la preparación de muestras, el ensamblaje de la RT-PCR, la amplificación/detección, y el cálculo la notificación de resultados. El instrumento ALINITY m™ ejecuta automáticamente todas las etapas del procedimiento del ensayo VIH-1 ALINITY m™. El ARN del VIH-1 del plasma o suero humano se extrae automáticamente a bordo del instrumento Abbott ALINITY m™ utilizando el kit de preparación de muestras de ARN ALINITY m™, la solución de lisis del ALINITY m™ y la solución diluyente del ALINITY m™, que emplean tecnología de micropartículas magnéticas para facilitar la captura, el lavado y la elución del ácido nucleico.
Al comienzo del proceso de preparación de muestras de VIH-1 ALINITY m™, el sistema ALINITY m™ rehidrata automáticamente una dosis unitaria liofilizada de control interno (que contiene una secuencia de ARN blindado) y la administra en cada reacción de preparación de muestra. A continuación, el control interno se procesa en toda la preparación de la muestra y el procedimiento de RT-PCR junto con las muestras, los calibradores y los controles para demostrar el procesamiento adecuado de muestras y la validez del ensayo.
A continuación, se combinan 25 μl de la muestra de ARN purificado con 5 μl de activador líquido, lo que luego se utiliza para rehidratar la dosis unitaria liofilizada del reactivo de mezcla maestra de la RT-PCR del ALINITY m™ HIV-1. La solución activadora se prepara mezclando agua de calidad de biología molecular, cloruro de magnesio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC), cloruro de potasio y ProClin 950. La solución activadora se suministra en formato líquido en placas de varios pocillos selladas y embolsadas, y aporta a la reacción de RT-PCR las sales necesarias para activar las enzimas de RT-PCR y establecer un entorno de fuerza iónica óptimo. La formulación de la solución activadora se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Formulación de reactivos activadores
El material resultante se transfiere luego a un recipiente de reacción, se cubre con 15 μl de solución de barrera de vapor ALINITY m™ (aceite mineral) y se transfiere a un módulo de amplificación/detección para la transcripción inversa, la amplificación por PCR y la detección de fluorescencia en tiempo real del VIH-1.
La formulación del reactivo de mezcla maestra de RT-PCR es compatible con la liofilización y permite completar el ciclo de RT-PCR en menos de una hora. El reactivo de mezcla maestra se prepara combinando ADN polimerasa KAPA 2G, transcriptasa inversa SuperScript III, uracilo-ADN Glicosilasa (u Dg ), excipiente (Ficoll 400, Ficoll 70, trehalosa, melecitosa y agua de calidad de biología molecular), componentes del tampón de PCR (Tris-HCl, Tween 20 y gelatina), dNTP, cebadores oligonucleotídicos (como se describe en el presente documento), sondas oligonucleotídicas y desactivadores (como se describe en el presente documento), colorante de referencia pasivo Cal610 y ProClin 950.
La transcriptasa inversa SuperScript III es una versión diseñada de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-il) con actividad de ribonucleasa H reducida y mayor estabilidad térmica, y puede usarse para sintetizar ADNc de primera cadena a temperaturas de hasta 55 °C, proporcionando una mayor especificidad. La polimerasa KAPA2G es una enzima genomanipulada para que tenga una mayor capacidad de procesamiento y velocidad a través de la evolución dirigida, lo que ofrece velocidades de desactivación significativamente más rápidas que la ADN polimerasa TAQ® de tipo natural. KAPA2G tiene una ADN polimerasa 5'-3' de una alta capacidad de procesamiento, pero carece de actividad de exonucleasa 3'-5'. La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) cataliza la liberación de uracilo libre a partir del ADN que contiene uracilo y proporciona un medio de control de la contaminación para los amplicones externos que contienen uracilo.
El reactivo de mezcla maestra se introduce en formato de dosis unitaria en placas de varios pocillos y se liofiliza. A continuación, las placas liofilizadas se sellan y se embolsan. La formulación de la mezcla maestra se establece en la Tabla 2.
Tabla 2. Formulación de la mezcla maestra
continuación
Las condiciones de los ciclos de RT-PCR utilizadas por el ensayo ALINITY m™ HIV-1 se establecen en la Tabla 3.
Tabla 3. Condiciones de los ciclos de RT-PCR
La diana de control interno se prepara mezclando el excipiente (trehalosa y agua de calidad de biología molecular) y el control interno a granel (que consiste en ARN blindado de control interno diluido en agua filtrada, plasma humano desfibrinado (matriz base, SeraCare Life Science, Inc., Milford, MA). La formulación del control interno se muestra a continuación, en la Tabla 4. La secuencia diana de ARN blindado de control interno se obtiene del gen de la hidroxipiruvato reductasa de la planta de calabaza, Cucúrbita pepo, que no está relacionado con el VIH-1. El control interno se introduce en formato de dosis unitaria en placas de varios pocillos y se liofiliza. A continuación, las placas liofilizadas se sellan y se embolsan.
Tabla 4. Formulación de control interno
La formulación de PCR y las condiciones de ciclado descritas anteriormente pueden modificarse aún más para optimizar el ensayo.
EJEMPL02
Este ejemplo describe experimentos para establecer el límite de detección (L0D) del ensayo ALINITY m™ HIV. El L0D para el ensayo ALINITY m™ HIV-1 se determinó mediante el análisis de una serie de diluciones de la 0rganización Mundial de la Salud (0MS) 3.er patrón internacional para el ARN del VIH-1 (10/152), preparado en plasma humano sin expresión del VIH-1.
La serie de dilución del patrón de la 0MS para el VIH-1 consistía en seis elementos de la serie destinados a agrupar el límite de detección (L0D) previsto del ensayo y el límite inferior de cuantificación (LL0Q) esperado de 20 copias/ml. La concentración de los elementos de la serie del L0D utilizados en este estudio fue de 40, 30, 20, 10, 5 y 2,5 copias/ml, dando lugar a tres elementos de la serie dirigidos a tasas de detección de entre el 10 % y el 90 %, y uno o más elementos de la serie dirigidos a tasas de detección superiores al 95 %. Las concentraciones de los elementos de la serie se calcularon en función de la concentración asignada del patrón de VIH-1 de la 0MS (véase la Tabla 5).
Tabla 5. Elementos de la serie del VIH-1
Se analizó un total de 96 réplicas para cada elemento de la serie en cuatro lotes de reactivo de amplificación de ALINITY m™ HIV-1 y dos sistemas ALINITY m™. Para cada elemento de la serie, se realizaron 3 pruebas con cada uno de los cuatro lotes de reactivo de amplificación ALINITY m™ HIV-1 durante tres días, lo que incluyó ocho réplicas por día (p. ej., cuatro lotes de reactivo de amplificación x ocho réplicas/día x tres días = 96 réplicas probadas en total) (véase la Tabla 6).
Tabla 6. Muestreo de estudio
El tamaño de la muestra según la recomendación de la Guía EP17-A2 del Instituto de Patrones Clínicos y de Laboratorio (CLSI) para la Evaluación de la Capacidad de Detección para los Procedimientos de Medición de Laboratorio Clínico es un mínimo de cinco elementos por serie y un mínimo de 60 réplicas por elemento de la serie. El tamaño de la muestra seleccionado para el estudio de análisis estadístico fue de un mínimo de cinco elementos de la serie y un mínimo de 80 réplicas válidas por elemento de la serie. Por lo tanto, el tamaño de la muestra utilizado en este estudio superó el tamaño mínimo de la muestra recomendado en la guía EP17-A2 del CLSI.
El estudio se realizó con cuatro lotes del kit de amplificación de ALINITY m™ HIV-1, un lote del kit de calibración de ALINITY m™ HIV-1, kit de control y reactivos del kit de ARN de preparación de muestras, y un lote de solución de lisis del ALINITY m™, solución diluyente y solución de barrera de vapor en dos sistemas ALINITY m™.
Explicación de la convención de identificación de muestras
Dentro del listado de líneas, cada línea identifica la identificación de la muestra (SID, Sample IDentification) asignada a la muestra analizada. Los calibradores y los controles se nombraron según lo requerido por el software del instrumento ALINITY m™.
El SID era: L0Dyyzz
Clave:
L0D = (límite de detección) del estudio
yy = número de serie (01 de XX)
zz = número de ejecución (01 de XX)
Los ID de muestra de ejemplo utilizados en este estudio se enumeran a continuación, en la Tabla 7:
Tabla 7.
Criterios de validez de la calibración y del control del ensayo
Se estableció una calibración para cada combinación de lotes del kit de amplificación del VIH-1 ALINITY m™, lote del kit de preparación de muestras y la solución de lisis del ALINITY m™ en cada instrumento antes de ejecutar las muestras. Cada calibrador se probó en réplicas de tres junto con 1 réplica de control negativo, control positivo bajo y control positivo alto para cada lote de reactivo/instrumento utilizado en el estudio. Los parámetros de la curva de calibración y cada valor de control individual se evaluaron frente a los criterios de validez del archivo de especificaciones de la aplicación de ensayo, y se aprobaron.
El estudio se realizó durante tres días y los controles del ensayo ALINITY m HIV-1 se probaron cada día en cada instrumento para verificar la validez del ensayo. Cada valor de control individual se evaluó frente a los criterios de validez específicos del ensayo, y se aprobó.
Criterios de validez de las muestras
Cuando una muestra era no válida, se excluía el resultado del análisis y se volvía a analizar en caso necesario para
lograr el tamaño mínimo de la muestra.
Si se producía una "ausencia de prueba" (debido a errores técnicos o de instrumentos), el resultado se excluía del análisis y se repetía en caso necesario para garantizar que se alcanzaba el tamaño mínimo de la muestra.
Análisis estadístico
La variable de análisis para el análisis estadístico fue la interpretación del resultado de las muestras de ALINITY m HIV-1. Si el resultado/la interpretación de la muestra era "Sin detección", entonces se consideraba que, en la muestra, no se había realizado ninguna detección; de lo contrario, la muestra se consideró "Con detección".
El L0D se definió como la concentración correspondiente al 95 % de probabilidad de detección. La tasa de detección, de todos los lotes de reactivo e instrumentos, se estimó para cada elemento de la serie como se describe en la siguiente ecuación:
donde el Número total de réplicas probadas era la suma de las réplicas "Con detección" y las réplicas "Sin detección". Una "réplica" se definió como una reacción de PCR individual, solo se incluyeron réplicas válidas en el análisis.
Para todos los lotes de reactivo e instrumentos combinados, el límite de detección se estimó a partir de un análisis de próbitos. Se ajustó un modelo de regresión de próbitos mediante PR0C PR0BIT en sAs , con log-io de la concentración diana (log-io(X), mediante log-io opcional) como variable independiente y la tasa de detección P(Y=1) como variable de respuesta:
P(Y=1) = C (1-C)0 [po (P1)( log-o(X))]
donde po, p1 representa las estimaciones de los parámetros; X representa la concentración diana (n.° de copias/ml), P representa la probabilidad de detección, C representa la (tasa de detección) natural, 0[z] representa la función de distribución acumulativa normal. El modelo fue ajustado con la opción de log-io y sin la opción 0PTC, ya que se supuso que la tasa de detección natural era cero. Dado que se utilizó el modelo con la transformación en escala log-io de las concentraciones diana, las estimaciones y los intervalos de confianza se obtuvieron tomando la transformación antilogarítmica.
Criterio de aceptación
El criterio de aceptación para este estudio fue que la concentración de VIH-1 correspondiente a la tasa de detección (L0D) del 95 % determinada en el análisis debe ser inferior que o igual a 2o copias/ml. El L0D se define como la concentración correspondiente al 95 % de probabilidad de detección.
PR 2:
El ensayo deberá detectar un número inferior que o igual a 2o copias/ml con un 95 % de probabilidad, al procesar 1 ml o menos de muestra.
PR 21:
El ensayo deberá detectar los subtipos A, B, BF, C, D, CRFoi-AE, F, CRFo2-AG, G, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1.
Este estudio estableció el L0D para el ensayo ALINITY m HIV-1 mediante el 3.er patrón internacional de la 0MS para el ARN del VIH-1 (io/152), que comprende el subtipo B del Grupo M del VIH-1. Por lo tanto, PR2 y la porción del subtipo B del Grupo M de PR21 se verificaron según este protocolo. El rendimiento de L0D de los subtipos/grupos del VIH-1 adicionales enumerados en PR21 se verificará como parte de un estudio independiente. Para el estudio del L0D mediante el subtipo B del Grupo M del VIH-1, los elementos 1 al 4 de la serie se incluyeron en el modelo de regresión de próbitos basado en el porcentaje de detección. El análisis de próbitos demostró que el ensayo es capaz de detectar la presencia de 13,88 copias/ml (intervalo de confianza del 95% de 11,16 a 18,98 copias/ml) de ARN del VIH-1 en muestras de plasma con una probabilidad del 95 % para el subtipo B del Grupo M. Los elementos 4, 5 y 6 de la serie presentaron tasas de detección superiores al 95 %. Por lo tanto, los elementos 5 y 6 de la serie se excluyeron del análisis de próbitos para garantizar que el modelo de regresión utilizara solo un elemento de la serie (el elemento 4 de la serie) con tasas de detección iguales o superiores al 95 %. El límite de detección (L0D) del ensayo ALINITY m HIV-1 se muestra en la Figura 1. Los resultados que respaldan la Figura 1 se muestran en las Tablas 8, 9 y 1o.
Tabla 8. Límite de detección L0D de ALINITY m™ HIV-1 ara todos los lotes combinados
T l . Lími i n L D ALINITY m™ HIV-1 r l l min
continuación
Tabla 10. T l l m n i l L D r l l ombinados
Los controles de ensayo probados en una ejecución no fueron válidos debido a un control negativo no válido (código de error 9209) y se excluyeron. No se asoció ninguna muestra con este conjunto de control. Cuando un control de ensayo resultaba no válido, el software del sistema ALINITY m invalidaba todos los niveles de control probados en ese conjunto de control. Por lo tanto, el Control positivo alto y el Control positivo bajo asociados de esta acción de control también eran invalidados. Los controles del ensayo se volvieron a probar con éxito antes de probar las muestras. Una muestra presentó un indicador de "diluida" y se excluyó por clasificarse incorrectamente. El técnico ordenó incorrectamente que esta réplica se analizara como una muestra diluida (es decir, diluida en el diluyente de muestras ALINITY m™ según el procedimiento de dilución de muestras opcional del ensayo) cuando la muestra no estaba diluida (es decir, probada pura). Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra. El número mínimo de réplicas para el elemento de la serie se cumplió según el protocolo. Se revisaron todos los resultados de las pruebas. Se pueden haber excluido determinadas observaciones del análisis conforme a los criterios de exclusión del protocolo (es decir, incumplimiento de los criterios de control o validez, errores o problemas del instrumento, error técnico reconocido, incumplimiento de los criterios de inclusión y/o incumplimiento del protocolo). Todos los resultados que no fueron excluidos fueron aptos para el análisis.
En la Tabla 11, se resume una explicación de las observaciones excluidas. En la Tabla 12, se proporciona un compendio general del listado de líneas del número total de resultados incluidos, resultados excluidos, errores instrumentales y errores de ejecución para el control de calidad de validez.
Tabla 11. Estudio del límite de detección de ALINITY m™ HIV-1: Com endio eneral del listado de líneas
Tabla 12. Estudio de límite de detección ALINITY m™ HIV-1: Com endio de datos excluidos
En total, se generaron 615 resultados en el estudio; se incluyó un total de 575 resultados en el análisis; se excluyó un total de 1 resultado del análisis; 36 resultados de control válidos y 3 resultados de control no válidos. Los resultados de este ejemplo demuestran que la concentración de VIH-1 correspondiente a la tasa de detección (L0D) del 95 % fue de 13,88 copias/ml, y el Lo D indicado para el ensayo ALINITY m HIV-1 fue de 20 copias/ml.
EJEMPL03
Este ejemplo describe experimentos que establecen el intervalo lineal del ensayo ALINITY m™ HIV-1 probando una serie preparada con el uso de una reserva de virus HIV-1 que representa el Grupo M, subtipo B.
La linealidad se evaluó probando 11 elementos de la serie. 0cho elementos abarcaron el intervalo dinámico previsto del ensayo (de 20 a 10.000.000 copias/ml), incluido un elemento cuyo objetivo es el Límite Inferior de Cuantificación (LL0Q, Lower Limit of Quantification) esperado de 20 copias/ml. También se incluyeron en la prueba un elemento que excedía el límite superior de cuantificación esperado (UL0Q, Upper Limit of Quantification) a 10.000.000 copias/ml y dos elementos de la serie adicionales fuera de este intervalo.
Los elementos de la serie consistían en una reserva de virus VIH-1 que representaba al Grupo M, subtipo B, diluido en plasma negativo. Los valores de cuantificación de la serie se establecieron mediante patrones de referencia internos que se pueden rastrear con un patrón vírico del Laboratorio de Control de Calidad de Virología (VQA) del Grupo de Ensayos Clínicos del SIDA y que se establecen en la Tabla 13.
Tabla 13. Elementos de la serie del VIH-1
Se analizó un total de 24 réplicas para cada elemento de la serie utilizando un lote de reactivos de amplificación de ALINITY m™ HIV-1 y 1 sistema ALINITY m™.
El diseño del estudio se basó en las recomendaciones del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) tituladas "EP06-A, Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach".
El tamaño de la muestra según la recomendación de la directriz EP06-A del CLSI es un mínimo de siete elementos por serie para desabolladores y un mínimo de dos réplicas por elemento de la serie. El tamaño de la muestra seleccionado para el estudio fue de 11 elementos por serie y 24 repeticiones por serie. Por lo tanto, el tamaño de la muestra utilizado en este estudio cumplió o superó el tamaño mínimo de la muestra recomendado en la directriz EP06-A del CLSI.
El estudio se realizó con un lote de reactivos del kit de amplificación solo para uso diagnóstico in vitro (IU0, Only For In Vitro Diagnostic Use) del ALINITY m™ HIV-1, un lote de reactivos del kit de control IU0 del ALINiTy m™ HIV-1, un lote de reactivos del CAL Kit IU0 del ALINITY m™ HIV-1, un lote de reactivos del kit de ARN de preparación de muestras IU0, un lote de solución de lisis IU0 del ALINITY m™, un lote de solución de barrera de vapor IU0 del ALINITY m™, un lote de solución de dilución IU0 del ALINITY m™ y un sistema ALINITY m™.
Explicación de la convención de identificación de muestras
Dentro del listado de líneas, cada línea identifica la identificación de la muestra (ID, Sample IDentification) asignada a la muestra analizada. Los calibradores y los controles se nombraron según lo requerido por el software del instrumento ALINITY m™.
El SID era: DLyyzz
Clave:
DL = estudio (linealidad)
yy = número de serie (01 de XX)
zz = réplica (01 a 24)
Los ID de las muestras de ejemplo utilizados en este estudio se enumeran a continuación en la Tabla 14.
Tabla 14
Criterios de validez de la calibración y del control del ensayo
Se estableció una calibración para el lote del kit de amplificación del ALINITY m™ HIV-1, el lote del kit de preparación de muestras y el lote de solución de lisis del ALINITY m™ en el instrumento, antes de ejecutar las muestras. Cada calibrador se probó en réplicas de 3 junto con 1 réplica del control negativo, control positivo bajo y control positivo alto para cada lote de reactivo/instrumento utilizado en el estudio. Los parámetros de la curva de calibración y cada valor de control individual se evaluaron frente a los criterios de validez del archivo de especificaciones de la aplicación de ensayo, y se aprobaron.
Los controles del ensayo ALINITY m™ HIV-1 se probaron el día de la prueba para verificar la validez del ensayo. Cada valor de control individual se evaluó frente a los criterios de validez específicos del ensayo o su equivalente, y se aprobó.
Evaluación de la validez de las muestras
Cuando una muestra era no válida, se excluía el resultado del análisis y se volvía a analizar en caso necesario para lograr el tamaño mínimo de la muestra. Si todas las réplicas de la nueva prueba eran válidas, los resultados de la nueva prueba se incluían en el análisis junto con cualquier resultado válido de la prueba original. Para identificar la repetición de la prueba de muestras no válidas, se añadía una "R" al final del ID de la muestra.
Si se producía una "ausencia de prueba" (debido a errores técnicos o de instrumentos), el resultado se excluía del análisis y se repetía en caso necesario para garantizar que se alcanzara el tamaño mínimo de la muestra. Para identificar la repetición de la prueba de las muestras "ausencia prueba", se añadía una "A" al final del ID de la muestra.
Análisis estadístico
La variable de análisis para el análisis estadístico es el número de copias/ml en escala logarítmica de la
concentración de VIH-1 ALINITY m™. Se realizaron las siguientes etapas analíticas:
a) Para cada nivel de serie, se calculó la desviación típica (DT) de los resultados de ALINITY m™ HIV-1 y se confirmó que la DT no superaba los siguientes requisitos para la precisión del ensayo:
• 0,25 copias/ml en escala logarítmica del ensayo de 100 copias/ml a 20.000.000 copias/ml.
• 0,46 copias/ml en escala logarítmica a menos de o igual a 3 veces el LL0Q.
Dado que la DT cumplió con los criterios anteriores, los análisis continúan con las etapas b) a g).
b) Identificación de valores atípicos:
Los valores atípicos se detectaron y excluyeron comprobando si algún resultado de ALINITY m™ HIV-1 estaba fuera del intervalo medio de ± 4 x DT para cualquier serie. Los siguientes análisis (etapa c - etapa g) se realizaron con y sin valores atípicos.
c) Se realizó la regresión polinómica por mínimos cuadrados de primer, segundo y tercer grado, y se comprobó si los coeficientes no lineales eran significativos al nivel de significación 0,05.
d) Si no había un coeficiente no lineal significativo, entonces el ensayo se definía como lineal dentro del intervalo abarcado por los elementos de la serie. Se continúa a la etapa f).
e) Si había un coeficiente no lineal significativo, se seleccionaba el modelo de regresión no lineal con el menor Error Cuadrático Medio (ECM) como modelo no lineal ajustado y se calculaba la diferencia en la concentración predicha (Y) entre el modelo no lineal ajustado y el modelo lineal para cada elemento de la serie.
Si la diferencia en la concentración predicha (Y) entre el modelo no lineal ajustado y el modelo lineal para el elemento de la serie con la concentración diana más baja y/o más alta era superior a 0,5 copias/ml en escala logarítmica, entonces se eliminaba el elemento de la serie con la mayor diferencia. Se continúa a la etapa c).
Si la diferencia en la concentración predicha (Y) entre el modelo no lineal ajustado y el modelo lineal para cada elemento de la serie era menor de o igual a 0,5 copias/ml en escala logarítmica, entonces:
• el límite inferior del intervalo lineal se definía como la concentración diana del elemento de la serie con la concentración diana más baja,
• el límite superior del intervalo lineal se definía como la concentración diana del elemento de la serie con la concentración diana más alta, y
• el ensayo se definía como lineal dentro del límite inferior del intervalo lineal y del límite superior del intervalo lineal.
0bsérvese que la diferencia máxima permitida entre los modelos polinómico y lineal (0,5 copias/ml en escala logarítmica) se tomó del Grupo de Directrices Antirretrovíricas para Adultos y Adolescentes. Directrices para el uso de agentes antirretrovíricos en adultos y adolescentes infectados por el VIH-1. Departamento de Salud y Servicios Humanos (2014), que establece que el cambio mínimo en la carga vírica considerado estadísticamente significativo (2 desviaciones típicas) es del triple, o un cambio de 0,5 copias/ml en escala logarítmica.
f) Se realizó una regresión lineal por mínimos cuadrados y se generó un diagrama de regresión que incluía a los elementos de la serie que se encontraban dentro del intervalo lineal determinado a partir de la etapa d) o de la etapa e).
g) Si había un coeficiente no lineal significativo a partir del análisis de regresión con todos los elementos de la serie, se generaba un diagrama para todos los elementos de la serie utilizando los resultados individuales de ALINITY m™ HIV-1 como eje Y y la concentración diana como eje X. En el diagrama se presentan dos símbolos diferentes que representan los resultados dentro y fuera del intervalo lineal. También se presentan en el diagrama dos líneas que representan las concentraciones medias predichas a partir del modelo no lineal ajustado y del modelo lineal. Los elementos de la serie que se encuentran fuera del intervalo lineal aparecen resaltados en el diagrama.
Criterio de aceptación
El criterio de aceptación para este estudio es que el límite inferior del intervalo lineal debe ser menor de o igual a 20 copias/ml y el límite superior del intervalo lineal debe ser mayor de o igual a 10.000.000 copias/ml para el subtipo B del Grupo M del VIH-1.
El ensayo ALINITY m™ HIV-1 se definió como lineal dentro del elemento de la serie de virus más bajo probado (objetivo de 10 copias/ml) y el elemento de la serie de virus más alto probado (objetivo de 20.000.000 copias/ml)
para el subtipo B del Grupo M del VIH-1. El análisis de los resultados del plasma mostró que un coeficiente no lineal era significativo. Los diagramas de regresión lineal y no lineal del ensayo ALINITY m™ HIV-1 se presentan en la Figura 2, y los resultados que respaldan la Figura 2 se muestran de la Tabla 15 a la Tabla 18. Para todos los elementos de la serie, el diagrama de regresión de mínimos cuadrados del ensayo ALINITY m™ HIV-1 se presenta en la Figura 3 y se proporciona un compendio en la Tabla 19. El intervalo de linealidad es de 10 a 20.000.000 copias/ml, y se muestra en la Tabla 20. En total, se generaron 267 resultados en el estudio: se incluyó en los análisis un total de 264 resultados de muestras, 0 resultados de muestra fueron excluidos de los análisis y 3 resultados de control válidos. Se revisaron todos los resultados de las pruebas. No se excluyeron resultados durante el análisis. En la Tabla 21, se proporciona un compendio general del listado de líneas del número total de resultados de muestras incluidos y excluidos, y resultados de control de ensayo no válidos/válidos.
Tabla 15. Listado de desviaciones tí icas de la linealidad de ALINITY m™ HIV-1
Tabla 16. Listado de valores atípicos estadísticos de la linealidad de ALINITY m™ HIV-1
T l 1. Li v l r if r ni r ih l lin li ALINITY m™ HIV-1
Tabla 19. Comendio de los elementos de la serie dentro del intervalo lineal
Tabla 20. Com endio del intervalo lineal
Tabla 21. Comendio eneral del listado de líneas del estudio de la linealidad de ALINITY m™ HIV-1
Los resultados de este ejemplo demuestran que el ensayo ALINITY m™ HIV-1 fue lineal entre 10copias/ml y 20.000.000 copias/ml para el subtipo B del Grupo M del VIH-1.
EJEMPL04
El ejemplo describe experimentos para verificar el límite de detección (L0D) del ensayo ALINITY m™ HIV-1 para los subtipos A, BF, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, G, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1 en muestras
de plasma.
Para cada grupo/subtipo de VIH-1, se prepararon tres elementos de la serie diluyendo una muestra clínica o una reserva vírica en plasma humano sin expresión del VIH-1. Las concentraciones de la serie se seleccionaron intencionadamente para incluir concentraciones en el L0D y el límite inferior de cuantificación (LL0Q) previstos del ensayo a 20 copias/ml. Los valores de cuantificación de la serie se establecieron con el ensayo REALTIME™ HIV-1 de Abbott, que utiliza patrones de referencia internos que se pueden rastrear con respecto a un patrón vírico del Laboratorio de control de calidad de virología (VQA) del Grupo de ensayos clínicos del SIDA (véase la Tabla 22).
Tabla 22. Elementos de la serie del VIH-1
Para cada elemento de la serie de cada grupo o subtipo, se realizaron tres ejecuciones de prueba con un lote de reactivo de amplificación de ALINITY m™ HIV-1 durante varios días, incluidas ocho réplicas por día (p. ej., ocho réplicas/día x tres días = 24 réplicas analizadas en total). Se probó un total de 24 réplicas de cada elemento de la serie. Esto garantizó un mínimo de 20 réplicas válidas por elemento de la serie.
El tamaño de la muestra según la recomendación de la directriz EP17-A2 del CLSI es un mínimo de un lote de reactivo, un instrumento, dos muestras en la especificación de L0D, dos réplicas por muestra por día y 20 réplicas de bajo nivel en total. Por lo tanto, el tamaño de la muestra utilizado en este estudio cumplió con el tamaño mínimo de la muestra recomendado en la directriz EP17-A2 del CLSI.
El estudio se realizó con un lote de reactivos del kit de amplificación solo para uso diagnóstico in vitro (IU0, Only For In Vitro Diagnostic Use) del ALINITY m™ HIV-1, un lote de reactivos del kit de control IU0 del ALINiTy m™ HIV-1, un lote de reactivos del CAL Kit IU0 del ALINITY m™ HIV-1, un lote de reactivos del kit de ARN de preparación de muestras IU0, un lote de solución de lisis IU0 del ALINITY m™, un lote de solución de barrera de vapor IU0 del ALINITY m™, un lote de solución de dilución IU0 del ALINITY m™ y dos sistemas ALINITY m™.
Explicación de la convención de identificación de muestras
Dentro del listado de líneas, cada línea identifica la identificación de la muestra (ID, Sample IDentification) asignada a la muestra analizada. Los calibradores y los controles se nombraron según lo requerido por el software del instrumento ALINITY m™.
El SID era: GDggyyzz
Clave:
GD = estudio (Grupo; Subtipo límite de detección)
gg = Grupo, subtipo
A1 = Grupo M, subtipo A
BF = Grupo M, subtipo BF
C1 = Grupo M, subtipo C
D1 = Grupo M, subtipo D
AE = Grupo M, CRF01-AE
F1 = Grupo M, subtipo F
AG = Grupo M, CRF02-AG
G1 = Grupo M, subtipo G
H1 = Grupo M, subtipo H
O1 = Grupo O
N1 = Grupo N
yy = número de serie (01 de XX)
01 = 10 copias/ml
02 = 20 copias/ml
03 = 40 copias/ml
zz = Día (01 de XX)
Los ID de las muestras de ejemplo utilizados en este estudio se enumeran a continuación, en la Tabla 23.
Tabla 23.
Criterios de validez de la calibración y del control del ensayo
Se estableció una calibración para cada combinación de lotes del kit de amplificación del VIH-1 ALINITY m™, lote del kit de preparación de muestras y lote de solución de lisis del ALINITY m™ en cada instrumento, antes de ejecutar las muestras. Cada calibrador se probó en réplicas de tres junto con una réplica de control negativo, control positivo bajo y control positivo alto para cada lote de reactivo/instrumento utilizado en el estudio. Los parámetros de la curva de calibración y cada valor de control individual se evaluaron frente a los criterios de validez del archivo de especificaciones de la aplicación de ensayo, y se aprobaron.
Los controles del ensayo ALINITY m™ HIV-1 se probaron cada día para verificar la validez del ensayo. Cada valor de control individual se evaluó frente a los criterios de validez específicos del ensayo, y se aprobó.
Evaluación de la validez de las muestras
Cuando una muestra era no válida, se excluía el resultado del análisis y se volvía a analizar en caso necesario para lograr el tamaño mínimo de la muestra. Si se producía una "ausencia de prueba" (debido a errores técnicos o de instrumentos), el resultado se excluía del análisis y se repetía en caso necesario para garantizar que se alcanzaba el tamaño mínimo de la muestra.
Análisis estadístico
La variable de análisis para el análisis estadístico es el resultado/interpretación de las muestras de VIH-1 ALINITY m™. Si el resultado/la interpretación de la muestra era "Sin detección", entonces se consideraba que, en la muestra, no se había realizado ninguna detección. Una muestra se consideró "Con detección" si tenía uno de los tres resultados/interpretaciones siguientes: Detección < LL0Q, dentro del intervalo lineal y concentración > UL0Q. Para cada grupo/subtipo de VIH-1, la tasa de detección (tasa de aciertos) para cada elemento de la serie se estimó como se describe en la siguiente ecuación:
donde el Número total de réplicas es la suma de las réplicas "Con detección" y las réplicas "Sin detección". También se calculó el intervalo de confianza (IC) de la puntuación del 95 % unilateral superior de la tasa de detección.
Criterio de aceptación
Para cada grupo/subtipo de VIH-1 diana, el intervalo de confianza del 95 % unilateral superior para la tasa de detección (tasa de aciertos) será mayor de o igual al 95,0 % para los elementos de la serie en, y por encima de, 20 copias/ml.
Los datos verificaron que el límite de detección (L0D) del ensayo ALINITY m™ HIV-1 para los subtipos A, BF, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, G, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1 fue inferior o igual a 20 copias/ml. Los resultados se presentan en las Tablas 24 y 25.
Tabla 24. Límite de detección L0D del ru o/subti o de VIH-1
continuación
Tabla 25. Tabla del com endio de los L0D del VIH-1
Los datos excluidos se compendio a continuación. Cuando no se alcanzó el tamaño mínimo de muestras, se realizaron nuevas pruebas.
Una réplica de 10 copias/ml del Grupo M, subtipo A, probada el Día 3 no fue válida con el código 9210: Número de ciclos de control interno demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Una réplica de 40 copias/ml del Grupo M, CRF02-AG, probada el Día 1 no fue válida con el código 9210: Número de ciclos de control interno demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
0cho réplicas de 10 copias/ml del Grupo M, subtipo C, probadas el Día 2 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 120: No se puede procesar. El estado es detenido. Estas muestras se excluyeron del análisis como no probadas y se volvieron a probar.
Cuatro réplicas de 20 copias/ml del Grupo M, subtipo C, probadas el Día 2 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 120: No se puede procesar. El estado es detenido. Estas muestras se excluyeron del análisis como no probadas y se volvieron a probar.
Una réplica de 10 copias/ml del Grupo M, subtipo C, probada el Día 3 no fue válida con el código 9212: Falló el control interno. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Tres réplicas de 40 copias/ml del Grupo M, subtipo D, probadas el Día 3 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 5017: Error de aspiración del pipeteador. Estas muestras se excluyeron del análisis como no probadas y se volvieron a probar.
Una réplica de 20 copias/ml del Grupo M, subtipo F, probadas el Día 2 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 5017: Error de aspiración del pipeteador. Estas muestras se excluyeron del análisis como no probadas y se volvieron a probar.
Cuatro réplicas de 40 copias/ml del Grupo M, subtipo D, probadas el Día 3 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 5018: Error de dispensación del pipeteador. Estas muestras se excluyeron del análisis como no probadas y se volvieron a probar.
Siete repeticiones del Grupo M, subtipo F, (múltiples niveles) no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 5013: Error de detección de nivel de líquido en la sonda del pipeteador. Estas muestras se excluyeron del análisis como no probadas y se volvieron a probar.
Una réplica de 20 copias/ml del Grupo M, subtipo F, probada el Día 1 no fue válida con el código 9210: Número de ciclos de control interno demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar.
Doce réplicas de 10 copias/ml del Grupo M, subtipo H, probadas el Día 2 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 3024: Falló la verificación de contaminación en la unidad Amp-Detect. Estas muestras se excluyeron del análisis como no analizadas y se volvieron a analizar para lograr el tamaño mínimo de la muestra. Una réplica de 10 copias/ml del Grupo N probadas el Día 3 no fueron válidas debido a un error instrumental con el código 1993: La respuesta de la señal excede la relación máxima para el ensayo. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Una réplica de 40 copias/ml del Grupo N probada el Día 1 no fue válida con el código 9210: Número de ciclos de control interno demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Se revisaron todos los resultados de las pruebas. Se pueden haber excluido determinadas observaciones del análisis conforme a los criterios de exclusión del protocolo (es decir, incumplimiento de los criterios de control o validez, errores o problemas del instrumento, error técnico reconocido, incumplimiento de los criterios de inclusión y/o incumplimiento del protocolo). Todos los resultados que no fueron excluidos fueron aptos para el análisis.
En la Tabla 26, se proporciona un compendio general del listado de líneas del número total de resultados de muestras incluidos y excluidos, y resultados de control de ensayo no válidos/válidos. En la Tabla 27, se resume una explicación de las observaciones excluidas.
Tabla 26. Compendio del listado general de líneas del estudio del límite de detección por grupo/subtipo de ALINITY m™ HIV-1
Tabla 27. Compendio de los datos excluidos del estudio del límite de detección por grupo/subtipo de ALINITY m™
HIV-1
En total, se generaron 849 resultados en el estudio: se incluyó un total de 783 resultados en los análisis, se excluyó de los análisis un total de 45 resultados y 21 controles válidos.
Los resultados de este ejemplo demuestran un L0D de 20 copias/ml para el ensayo ALINITY m™ HIV-1 usando los subtipos A, BF, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, G, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1.
EJEMPL05
Este ejemplo describe los experimentos realizados para verificar el intervalo lineal del ensayo ALINITY m™ HIV-1 analizando las series de linealidad para los subtipos A, BF, C, D, CRF01-AE, F, CRF02-AG, Ci, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1.
La linealidad del ensayo ALINITY m™ HIV-1 se evaluó analizando un mínimo de 10 elementos de la serie para cada grupo/subtipo de HIV-1. En la medida de lo posible, los elementos de la serie de linealidad abarcaron el intervalo dinámico previsto del ensayo (de 20 a 10.000.000 copias/ml). Cuando las limitaciones impidieron obtener ciertos grupos/subtipos en volúmenes suficientemente grandes y/o a concentraciones suficientemente altas para alcanzar el nivel diana superior de 20.000.000 copias/ml, los elementos de la serie de dilución de gama alta se prepararon a la concentración más alta posible.
Las series de linealidad para los subtipos A, C, D, AE, F, AG, G, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1 se prepararon diluyendo virus cultivados en plasma humano sin expresión de VIH-1. La serie de linealidad para el subtipo BF del Grupo M del VIH-1 se preparó diluyendo una muestra de paciente con expresión del subtipo BF del Grupo M del VIH-1 en plasma humano sin expresión del VIH-1.
Los valores de cuantificación de la serie se establecieron con el ensayo REALTIME™ HIV-1 de Abbott, que utiliza patrones de referencia internos que se pueden rastrear con respecto a un patrón vírico del Laboratorio de control de calidad de virología (VQA) del Grupo de ensayos clínicos del SIDA (véase la Tabla 28).
Tabla 28. Series de linealidad de los subti os del VIH-1
(continuación)
(continuación)
(continuación)
El diseño del estudio se basó en las recomendaciones del Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) tituladas "EP06-A, Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach". Según el protocolo del estudio, el tamaño mínimo de la muestra para el estudio fue de siete o más elementos de la serie y 12 o más réplicas por elemento de la serie. Por lo tanto, el tamaño de la muestra utilizado en este estudio cumplió o superó el tamaño mínimo de la muestra recomendado en la directriz EP06-A del CLSI.
El estudio se realizó con dos lotes del kit de amplificación de ALINITY m™ HIV-1, un lote de kit de calibración, dos lotes de kit de control, tres lotes de reactivos del kit de ARN de preparación de muestras, un lote de solución de lisis del ALINITY m™, tres lotes de solución diluyente del ALINITY m™ y dos lotes de solución de barrera de vapor del ALINITY m™ en tres sistemas ALINITY m™. Para cada grupo/subtipo de VIH-1, se analizó un lote de reactivos del kit de amplificación del ALINITY m™ HIV-1 en un instrumento ALINITY m™.
Explicación de la convención de identificación de muestras
Dentro del listado de líneas, cada línea identifica la identificación de la muestra (SID, Sample IDentification) asignada a la muestra analizada. Los calibradores y los controles se nombraron según lo requerido por el software del instrumento ALINITY m™.
El SID era: GLssyy.
Claves:
GL = estudio (Linealidad del Grupo/Subtipo)
ss = Grupo, subtipo
A1 = Grupo M, subtipo A
BF = Grupo M, subtipo BF
C1 = Grupo M, subtipo C
D1 = Grupo M, subtipo D
AE = Grupo M, CRF01-AE
F1 = Grupo M, subtipo F
AG = Grupo M, CRF02-AG
G1 = Grupo M, subtipo G
H1 = Grupo M, subtipo H
01 = Grupo 0
N1 = Grupo N
yy = número de serie (01 de XX)
Los ID de las muestras de ejemplo utilizados en este estudio se enumeran a continuación, en la Tabla 29.
Tabla 29
Criterios de validez de la calibración y del control del ensayo
Se estableció una calibración para cada combinación de lotes del kit de amplificación del VIH-1 ALINITY m™, lote del kit de preparación de muestras y la solución de lisis del ALINITY m™ en cada instrumento antes de ejecutar las muestras. Cada calibrador se probó en réplicas de tres junto con una réplica de control negativo, control positivo bajo y control positivo alto para cada lote de reactivo/instrumento utilizado en el estudio. Los parámetros de la curva de calibración y cada valor de control individual se evaluaron frente a los criterios de validez del archivo de especificaciones de la aplicación de ensayo, y se aprobaron. Los controles del ensayo ALINITY m™ HIV-1 se probaron el día de cada prueba para verificar la validez del ensayo. Cada valor de control individual se evaluó frente a los criterios de validez específicos del ensayo o su equivalente, y se aprobó.
Evaluación de la validez de las muestras
Cuando una muestra era no válida, se excluía el resultado del análisis y se volvía a analizar en caso necesario para lograr el tamaño mínimo de la muestra. Si todas las réplicas de la nueva prueba eran válidas, los resultados de la nueva prueba se incluían en el análisis junto con cualquier resultado válido de la prueba original.
Si se producía una "ausencia de prueba" (debido a errores técnicos o de instrumentos), el resultado se excluía del análisis y se repetía en caso necesario para garantizar que se alcanzara el tamaño mínimo de la muestra.
Análisis estadístico
La variable de análisis para el análisis estadístico es el número de copias/ml en escala logarítmica de la concentración de VIH-1 ALINITY m™. Se realizaron las siguientes etapas analíticas para cada Grupo/subtipo: a) Para cada nivel de serie, se calculó la desviación típica (DT) de los resultados de ALINITY m™ HIV-1 y se confirmó que la DT no superaba los siguientes requisitos para la precisión del ensayo:
• 0,25 copias/ml en escala logarítmica de 100 copias/ml a 10.000.000 copias/ml o más.
• 0,46 copias/ml en escala logarítmica a menos de o igual a 60 copias/ml (3 veces el LL0Q previsto del ensayo).
Si la DT cumplió con los criterios anteriores, entonces los análisis continuaron a las etapas b) a g).
b) Identificación de valores atípicos:
Los valores atípicos se detectaron y excluyeron comprobando si algún resultado de ALINITY m™ HIV-1 estaba fuera del intervalo medio de ± 4 x DT para cualquier serie. Los siguientes análisis (etapa c - etapa g) se realizaron con y sin valores atípicos.
c) Se realizó la regresión polinómica por mínimos cuadrados de primer, segundo y tercer grado. Se probó si los coeficientes no lineales eran significativos al nivel de significación 0,05.
d) Si no había un coeficiente no lineal significativo, entonces el ensayo se definía como lineal dentro del intervalo abarcado por los elementos de la serie. Se continúa a la etapa f).
e) Si había un coeficiente no lineal significativo, se seleccionaba el modelo de regresión no lineal con el menor Error Cuadrático Medio (ECM) como modelo no lineal ajustado y se calculaba la diferencia en la concentración predicha (Y) entre el modelo no lineal ajustado y el modelo lineal para cada elemento de la serie.
Si la diferencia en la concentración predicha (Y) entre el modelo no lineal ajustado y el modelo lineal para el elemento de la serie con la concentración diana más baja y/o más alta era superior a 0,5 UI/ml en escala logarítmica, entonces se eliminaba el elemento de la serie con la mayor diferencia. Se continúa a la etapa c).
Si la diferencia en la concentración predicha (Y) entre el modelo no lineal ajustado y el modelo lineal para cada elemento de la serie era menor de o igual a 0,5 UI/ml en escala logarítmica, entonces:
• el límite inferior del intervalo lineal se definía como la concentración diana del elemento de la serie con la concentración diana más baja,
• el límite superior del intervalo lineal se definía como la concentración diana del elemento de la serie con la concentración diana más alta, y
• el ensayo se definía como lineal dentro del límite inferior del intervalo lineal y del límite superior del intervalo lineal.
0bsérvese que la diferencia máxima permitida entre los modelos polinómico y lineal (0,5 copias/ml en escala logarítmica) se toma del Grupo de Directrices Antirretrovíricas para Adultos y Adolescentes. Directrices para el uso de agentes antirretrovíricos en adultos y adolescentes infectados por el VIH-1. Departamento de Salud y Servicios Humanos (2014), que establece que el cambio mínimo en la carga vírica considerado estadísticamente significativo (2 desviaciones típicas) es del triple, o un cambio de 0,5 copias/ml en escala logarítmica.
f) Se realizó una regresión lineal por mínimos cuadrados y se generó un diagrama de regresión que incluía a los elementos de la serie que se encontraban dentro del intervalo lineal determinado a partir de la etapa d) o de la etapa e).
g) Si había un coeficiente no lineal significativo a partir del análisis de regresión con todos los elementos de la serie, se generaba un diagrama para todos los elementos de la serie utilizando los resultados individuales de ALINITY m™ HIV-1 como eje Y y la concentración diana como eje X. En el diagrama se presentaron dos símbolos diferentes que representaban los resultados dentro y fuera del intervalo lineal. También se presentaron en el diagrama dos líneas que representan las concentraciones medias predichas a partir del modelo no lineal ajustado y del modelo lineal. Los elementos de la serie que se encontraban fuera del intervalo lineal aparecían resaltados en el diagrama. Para cada grupo/subtipo, se notificó la ecuación lineal de la regresión lineal de mínimos cuadrados y se calculó la diferencia máxima en las concentraciones medias predichas de la regresión no lineal y la regresión lineal de mejor ajuste. En caso de no existir un coeficiente no lineal significativo del análisis de regresión, se notificó "ND" para la diferencia máxima.
Adicionalmente, la línea de regresión lineal de mínimos cuadrados para cada grupo/subtipo se representó con todos los grupos/subtipos, incluido el subtipo B del Grupo M, en la misma gráfica.
Criterio de aceptación
Para cada grupo/subtipo de VIH-1, el criterio de aceptación para este estudio fue que el límite superior del intervalo lineal debe ser mayor de o igual a 10.000.000 copias/ml y el límite inferior del intervalo lineal debe ser menor de o igual a 20copias/ml.
Para cualquier grupo/subtipo donde el elemento de la serie no alcanzó las 10.000.000 copias/ml debido a limitaciones en el volumen disponible y/o la concentración, el criterio de aceptación fue que el ensayo fuera lineal desde el nivel más alto de la serie probado hasta menos de o igual a 20 copias/ml.
Se determinó que el ensayo ALINITY m™ HIV-1 era lineal para cada grupo/subtipo del VIH-1 desde el componente de la serie más bajo probado hasta el componente de la serie más alto probado. El análisis de los resultados de los subtipos A, BF, C, AG, F y G del Grupo M mostraron un coeficiente no lineal significativo. Los gráficos de regresión lineal y no lineal del ensayo ALINITY m™ HIV-1 con estas series se presentan en las FIGS. 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Los resultados que respaldan las FIGS. 4-9 se muestran de la Tabla 30 a la Tabla 33.
T l . Li vi i n í i r l r i l VIH-1
continuación
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Tabla 31. Comendio de la detección de valores atíicos
El grupo/subtipos restantes (los subtipos D, AE, H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1) no demostraron un coeficiente no lineal significativo como se muestra en la Tabla 32.
El diagrama de regresión de mínimos cuadrados del ensayo ALINITY m™ HIV-1 para cada serie de grupos/subtipos se presenta en la FIG. 10-FIG. 20 y se resume en las Tablas 34-44.
Tabla 34. Subtipo A del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 35. Subtipo BF del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 36. Subtipo C del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal valor atí ico eliminado
Tabla 37. Subtipo D del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 38. Subtipo AE del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 39. Subtipo AG del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 40. Subtipo F del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
(continuación)
Tabla 41. Subtipo G del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 42. Subtipo H del Grupo M del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 43. Grupo N del ALINITY m™ HIV-1: Compendio para los elementos de la serie del intervalo lineal
Tabla 44. Diagrama de regresión de mínimos cuadrados de la linealidad del Grupo O del ALINITY m™ HIV-1 y compendio para los elementos de la serie dentro del intervalo lineal
continuación
Para los subtipos A, BF, C, D, AE, F, AG, G y H del Grupo M, el Grupo 0 y el Grupo N del VIH-1, el ensayo fue lineal desde el elemento de la serie de virus más bajo probado (objetivo de 1,00 copias/ml en escala logarítmica) hasta el elemento de la serie de virus más alto probado (objetivo de 7,30 copias/ml en escala logarítmica) como se muestra en la Tabla 45.
Para el subtipo BF del Grupo M del VIH-1, el ensayo fue lineal desde el elemento de la serie de virus más bajo probado (objetivo de 1,00 copias/ml en escala logarítmica) hasta el elemento de la serie de virus más alto probado (objetivo de 4,10 copias/ml en escala logarítmica) como se muestra en la Tabla 45.
Para el subtipo C del Grupo M del VIH-1, el ensayo fue lineal desde el elemento de la serie de virus más bajo probado (objetivo de 1,00 copias/ml en escala logarítmica) hasta el elemento de la serie de virus más alto probado (objetivo de 6,80 copias/ml en escala logarítmica) como se muestra en la Tabla 45.
Para el subtipo H del Grupo M del VIH-1, el ensayo fue lineal desde el elemento de la serie de virus más bajo probado (objetivo de 1,00 copias/ml en escala logarítmica) hasta el elemento de la serie de virus más alto probado (objetivo de 5,65 copias/ml en escala logarítmica) como se muestra en la Tabla 45.
Para el Grupo N del VIH-1, el ensayo fue lineal desde el elemento de la serie de virus más bajo probado (objetivo de 0,40 copias/ml en escala logarítmica) hasta el elemento de la serie de virus más alto probado (objetivo de 5,10 copias/ml en escala logarítmica) como se muestra en la Tabla 45.
Tabla 45. Com endio del intervalo lineal
continuación
En la FIG. 21, se presenta un diagrama de regresión de mínimos cuadrados para los elementos de la serie de linealidad de VIH-1 ALINITY m™, incluidos los subtipos A, B, BF, C, D, AE, AG, F, G, H del grupo M, el grupo N y el grupo 0 combinados.
En la Tabla 46, se muestra un compendio de regresión de mínimos cuadrados para los elementos de la serie de linealidad de VIH-1 ALINITY m™, incluidos los subtipos A, B, BF, C, D, AE, AG, F, G, H del grupo M, el grupo N y el grupo 0.
Tabla 46. Compendio de regresión de mínimos cuadrados para elementos de la serie dentro del intervalo lineal para diferentes ru os/subti os
En la FIG. 22, se presenta un diagrama con la media de cada elemento de la serie y la línea de regresión del análisis de regresión con todos los puntos de datos individuales para los subtipos A, B, BF, C, D, AE, AG, F, G, H del Grupo M, el Grupo N y el Grupo 0.
Una muestra del Grupo M, subtipo A, fue inválida con el Código 9210: El número de ciclo de control interno es demasiado alto. Esta réplica se excluyó del análisis y se probaron réplicas adicionales según el protocolo.
Una muestra del Grupo 0 no fue válida debido al código de error instrumental 5002: Falló el motor del brazo Z del pipeteador. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Tres muestras del Grupo M, subtipo AE, no fueron válidas debido al código de error instrumental 5013: Error de detección de nivel de líquido en la sonda del pipeteador. Estas muestras se excluyeron del análisis y se probaron muestras adicionales según el protocolo.
Una muestra del Grupo M, subtipo AE, no fue válida con el Código 9212: Error de control interno. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Dos muestras del Grupo M, subtipo F no fueron válidas con el Código 9212: Fallo del CI. Estas réplicas se excluyeron del análisis y no se volvieron a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo M, subtipo D, fue inválida con el Código 9210: El número de ciclo de control interno es demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Dos muestras del Grupo M, subtipo D no fueron válidas con el Código 9212: Fallo del CI. Estas réplicas se excluyeron del análisis y no se volvieron a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Tres muestras del Grupo M, subtipo BF, no fueron válidas para el código 9210: El número del ciclo de control interno es demasiado alto. Estas réplicas se excluyeron del análisis y no se volvieron a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo M, subtipo H, fue inválida con el Código 9210: El número de ciclo de control interno es demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo M, subtipo H, no fue válida con el Código 9212: Error de control interno. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo M, subtipo AG, no fue válida debido al código de error instrumental 5002: Falló el motor del brazo Z del pipeteador. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Dos muestras del Grupo M, subtipo C, no fueron válidas debido al Código 9212: Error de control interno. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a probar al haberse alcanzado el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo M, subtipo C, no fue válida debido al código de error instrumental 5002: Falló el motor del brazo Z del pipeteador. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo M, subtipo C, fue inválida con el Código 9210: El número de ciclo de control interno es demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Nueve muestras del grupo N fueron válidas debido al código de error instrumental 5002: Fallo del motor del brazo Z del pipeteador. Estas muestras se excluyeron del análisis y se volvieron a probar, según sea necesario, para cumplir con el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del Grupo N no fue válida debido al código de error instrumental 5013: Error de detección de nivel de líquido en la sonda del pipeteador. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra.
Una muestra del grupo N no fue válida con el Código 9210: El número del ciclo de control interno es demasiado alto. Esta muestra se excluyó del análisis y no se volvió a analizar porque se alcanzó el tamaño mínimo de la muestra. Una ejecución no fue válida debido a un control negativo no válido (código de error 9209) y se excluyó. No se asoció ninguna muestra con esta acción de control. Cabe señalar que cuando un control de ensayo no es válido, el software del sistema ALINITY m™ invalida todos los niveles de control probados en ese conjunto de control. Por lo tanto, el Control positivo alto y el Control positivo bajo asociados de esta acción de control también eran invalidados. Los controles del ensayo se volvían a probar con éxito antes de la prueba de las muestras.
Se revisaron todos los resultados de las pruebas. Se pueden haber excluido determinadas observaciones del análisis conforme a los criterios de exclusión del protocolo (es decir, incumplimiento de los criterios de control o validez, errores o problemas del instrumento, error técnico reconocido, incumplimiento de los criterios de inclusión y/o incumplimiento del protocolo). Todos los resultados que no fueron excluidos fueron aptos para el análisis.
En la Tabla 47, se proporciona un compendio general del listado de líneas del número total de resultados de muestras incluidos y excluidos, y resultados de control de ensayo no válidos/válidos. En la Tabla 48, se resume una explicación de las observaciones excluidas.
Tabla 47. Compendio general del listado de líneas del estudio de la linealidad de los Grupos/subtipos de ALINITY m™ HIV-1
Tabla 48. Compendio de datos excluidos del estudio de linealidad de los Grupos/subtipos de VIH-1 de ALINITY m™
Se generó un total de 1564 resultados en el estudio de linealidad de los Grupos del estudio: se incluyó un total de 1493 resultados en los análisis, se excluyó un total de 32 resultados de los análisis, 36 resultados de control válidos y 3 resultados de control no válidos.
Los resultados de este ejemplo confirman que el ensayo ALINITY m™ HIV-1 es lineal entre 10 y 20.000.000 copias/ml para los subtipos A, D, AE, Ag , F y G del grupo M, y el Grupo 0 del VIH-1. El intervalo lineal reivindicado para el ensayo ALINITY m™ HIV-1 es de 20 copias/ml a 10.000.000 copias/ml. Para los subtipos BF, C y H del Grupo M y para el Grupo N, cuando el elemento de la serie no alcanzó las 10.000.000 copias/ml debido a limitaciones en el volumen disponible y/o la concentración, el ensayo fue lineal desde menos de o igual a 10
El uso de los términos "uno" y "una", y "el/la", "al menos uno/a", "uno/a o más", y referentes similares usados en el contexto para describir la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) debe considerarse inclusivo tanto del plural como del singular, a menos que se afirme lo contrario o se contradiga claramente por el contexto. El uso de la expresión "al menos uno" seguido de una lista de uno o más elementos (por ejemplo, "al menos uno de A y B") debe interpretarse como un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) ) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se afirme lo contrario o se contradiga claramente por el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye", y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significa "que incluye, aunque no de forma limitativa"), a menos que se indique lo contrario. La expresión "que consiste esencialmente en" también se interpreta como una expresión abierta destinada a incluir etapas o materiales que no afectan materialmente las características básicas y novedosas de un producto o método descrito. La expresión "que consiste en" se interpreta como una expresión cerrada que excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado explícitamente en la memoria descriptiva o en las reivindicaciones. La enumeración de los intervalos de valores en el presente documento simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que entre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpore a la especificación como si se hubiera recitado individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, está destinado simplemente a clarificar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna redacción de la memoria descriptiva debe tomarse como una indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la divulgación.
Las realizaciones preferidas de la presente invención se describen en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido por el inventor para llevar a cabo la invención. Las variaciones de esas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los artesanos expertos empleen dichas variaciones como apropiadas, y los inventores pretenden que la invención se ponga en práctica de otro modo diferente que el específicamente descrito en el presente documento.
Claims (12)
1. Un conjunto de secuencias oligonucleotídicas para amplificar y detectar una o más secuencias de ácido nucleico del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) en una muestra, que comprende:
(a) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción del gen de la integrasa (INT) del VIH-1 que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 1, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende (i) una primera secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 y un marcador detectable y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 y un resto desactivador, y
(b) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción de una región de repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 5, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 6, una primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria y una segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria, en donde cada una de la primera y segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria comprende un marcador detectable y un resto desactivador.
2. El conjunto de la reivindicación 1, en donde la primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria comprende las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria comprende las secuencias de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.
3. El conjunto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende, además:
(c) una secuencia de cebador oligonucleotídico directo de control interno que comprende la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54,
(d) una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso de control interno que comprende la SEQ ID NO: 12, y (e) una secuencia de sonda oligonucleotídica de control interno que comprende la SEQ ID NO: 13 y un marcador detectable.
4. El conjunto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el marcador detectable es un fluoróforo.
5. Un método para detectar el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en una muestra que se sospecha que contiene VIH-1, en donde el método comprende:
(a) poner en contacto una muestra obtenida de un ser humano con el conjunto de secuencias oligonucleotídicas de una cualquiera de las reivindicaciones 14 y reactivos para la amplificación y detección de secuencias de ácido nucleico,
(b) amplificar al menos una porción del gen INT del VIH-1 y/o al menos una porción de la región LTR del VIH-1 presente en la muestra,
(c) hibridar la sonda oligonucleotídica bicatenaria que detecta una porción del gen INT del VIH-1 con la porción amplificada del gen INT del VIH-1, y/o hibridar la primera y la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria que detectan una porción de la región LTR del VIH-1 con la porción amplificada de la región LTR del VIH-1,
(d) detectar la hibridación de las secuencias de sondas oligonucleotídicas bicatenarias con las porciones del gen INT del VIH-1 y/o la región LTR evaluando una señal procedente de cada uno de los marcadores detectables, mediante lo que
(i) la presencia de la señal procedente del marcador detectable en la secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria que detecta al menos una porción del gen INT del VIH-1 indica la hibridación de la secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria con la porción del gen INT del VIH-1 y la presencia de VIH-1 en la muestra; y/o
(ii) la presencia de una señal procedente de la primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria y/o la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria indica la hibridación de la primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria y/o la segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria con la porción de la región LTR y la presencia de VIH-1 en la muestra, y
(iii) la ausencia de las señales indica la ausencia de VIH-1 en la muestra.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la muestra comprende sangre, suero, plasma, saliva, orina, secreción vaginal o semen.
7. Un kit para detectar el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en una muestra que comprende:
(a) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción del gen de la integrasa (INT) del VIH-1 que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID
NO: 1, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende (i) una primera secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 y un marcador detectable y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 y un resto desactivador, y
(b) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción de la región de repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 5, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 6, una primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria y una segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria, en donde cada una de la primera y segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria comprende un marcador detectable y un resto desactivador;
(c) reactivos para amplificar y detectar secuencias de ácido nucleico; y
(d) instrucciones de uso.
8. El kit de la reivindicación 7, que comprende además:
(e) una secuencia de cebador oligonucleotídico directo de control interno que comprende la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54,
(f) una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso de control interno que comprende la SEQ ID NO: 12, y (g) una secuencia de sonda oligonucleotídica de control interno que comprende la SEQ ID NO: 13 y un marcador detectable.
9. El kit de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde los cebadores, las sondas y los reactivos están liofilizados.
10. Una composición para amplificar y detectar el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en una muestra, que comprende:
(a) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción del gen de la integrasa (INT) del VIH-1 que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 1, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria que comprende (i) una primera secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 y un marcador detectable y (ii) una segunda secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4 y un resto desactivador, y
(b) un conjunto de cebadores y sondas que amplifica y detecta al menos una porción de la región de repetición terminal larga (LTR) del VIH-1, que comprende una secuencia de cebador oligonucleotídico directo que comprende la SEQ ID NO: 5, una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso que comprende la SEQ ID NO: 6, una primera secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria y una segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria, en donde cada una de la primera y segunda secuencia de sonda oligonucleotídica bicatenaria comprende un marcador detectable y un resto desactivador.
11. La composición de la reivindicación 10, que comprende además:
(c) una secuencia de cebador oligonucleotídico directo de control interno que comprende la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54,
(d) una secuencia de cebador oligonucleotídico inverso de control interno que comprende la SEQ ID NO: 12, y (e) una secuencia de sonda oligonucleotídica de control interno que comprende la SEQ ID NO: 13 y un marcador detectable.
12. La composición de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde los cebadores oligonucleotídicos, las sondas oligonucleotídicas y los reactivos están liofilizados.
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