CN116134157A - 用于扩增和检测sars-cov-2的基于pcr的诊断试剂盒、组合物和方法 - Google Patents
用于扩增和检测sars-cov-2的基于pcr的诊断试剂盒、组合物和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116134157A CN116134157A CN202180024430.5A CN202180024430A CN116134157A CN 116134157 A CN116134157 A CN 116134157A CN 202180024430 A CN202180024430 A CN 202180024430A CN 116134157 A CN116134157 A CN 116134157A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- oligonucleotide primer
- oligonucleotide
- sars
- cov
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 14
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 164
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 134
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 132
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 118
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- 108091007498 Transmembrane domain 2 Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims abstract description 14
- 101100240079 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 N gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 242
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 87
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 37
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 17
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 12
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 10
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 7
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 45
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 42
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 35
- 239000000047 product Substances 0.000 description 34
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 15
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 14
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 14
- 101150020821 tm-2 gene Proteins 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 10
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 9
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 6
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- -1 nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 4
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- IHXWECHPYNPJRR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxycyclobut-2-en-1-one Chemical compound OC1=CC(=O)C1 IHXWECHPYNPJRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 2
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 2
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 2
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 101800004803 Papain-like protease Proteins 0.000 description 2
- 241000283966 Pholidota <mammal> Species 0.000 description 2
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101710151619 Replicase polyprotein 1ab Proteins 0.000 description 2
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 2
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 2
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 2
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 2
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 2
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 2
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001447 template-directed synthesis Methods 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- YZEUHQHUFTYLPH-UHFFFAOYSA-N 2-nitroimidazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=NC=CN1 YZEUHQHUFTYLPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000535 3C-like proteinase Proteins 0.000 description 1
- 101800002396 3C-like proteinase nsp5 Proteins 0.000 description 1
- 101800001631 3C-like serine proteinase Proteins 0.000 description 1
- XKTYXVDYIKIYJP-UHFFFAOYSA-N 3h-dioxole Chemical compound C1OOC=C1 XKTYXVDYIKIYJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 241000112286 Bat SARS-like coronavirus Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 102100025566 Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 101800001768 Exoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 101800003471 Helicase Proteins 0.000 description 1
- 101800002870 Helicase nsp13 Proteins 0.000 description 1
- 101000856199 Homo sapiens Chymotrypsin-like protease CTRL-1 Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283958 Manis javanica Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- RDXLYGJSWZYTFJ-UHFFFAOYSA-N Niridazole Chemical compound S1C([N+](=O)[O-])=CN=C1N1C(=O)NCC1 RDXLYGJSWZYTFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000934 Non-structural protein 13 Proteins 0.000 description 1
- 101800000515 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101800000514 Non-structural protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101800000508 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 1
- 101800002227 Papain-like protease nsp3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001074 Papain-like proteinase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 101710149210 Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101800004575 RNA-directed RNA polymerase nsp12 Proteins 0.000 description 1
- 101710153041 Replicase polyprotein 1a Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 101000779242 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF3a protein Proteins 0.000 description 1
- 101000596353 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF7a protein Proteins 0.000 description 1
- 101000596375 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ORF7b protein Proteins 0.000 description 1
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000008910 Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N Tranexamic acid Chemical compound NCC1CCC(C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710198378 Uncharacterized 10.8 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N anthraquinone Natural products CCC(=O)c1c(O)c2C(=O)C3C(C=CC=C3O)C(=O)c2cc1CC(=O)OC PYKYMHQGRFAEBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004056 anthraquinones Chemical class 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- RJYSYRSELCQCSO-UHFFFAOYSA-M cesium;2,2,2-trifluoroacetate Chemical compound [Cs+].[O-]C(=O)C(F)(F)F RJYSYRSELCQCSO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical class [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 229940101270 nicotinamide adenine dinucleotide (nad) Drugs 0.000 description 1
- 229960005130 niridazole Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108060006184 phycobiliprotein Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000026425 severe pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000003867 tiredness Effects 0.000 description 1
- 208000016255 tiredness Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本申请涉及一种用于检测样品中是否存在严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS‑CoV‑2)的方法。方法首先涉及使样品与初级寡核苷酸引物组接触。初级寡核苷酸引物组包含：(i)包含与SARS‑CoV‑2跨膜结构域2基因的第一部分互补的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物，和(ii)包含与由所述初级寡核苷酸引物组的第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列的第二寡核苷酸引物。方法可以进一步涉及使样品与二级寡核苷酸引物组接触，其中二级引物组包含(i)包含与SARS‑CoV‑2N基因的第一部分互补的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物，和(ii)包含与由所述二级寡核苷酸引物组的第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列的第二寡核苷酸引物。使经接触的样品经受在适合于产生跨膜结构域2基因和N基因扩增产物的条件下的扩增反应，和检测所述样品中是否存在SARS‑CoV‑2。还公开了分离的寡核苷酸、引物组和试剂盒。
Description
相关申请
本申请要求2020年4月6日提交的美国临时专利申请序列号63/005,781以及2020年6月16日提交的美国临时专利申请序列62/705,208的权益，其在此通过引用整体并入。
技术领域
本申请涉及用于扩增和检测SARS-CoV-2的诊断试剂盒、组合物和方法。
背景技术
严重急性呼吸道冠状病毒2(SARS-CoV-2)已在全球迅速传播。世界卫生组织(WHO)将由这种病毒引起的疾病称为COVID-19。2020年1月30日，该疫情被宣布为国际关注的突发公共卫生事件，并于2020年3月11日被WHO宣布为大流行。截至2020年5月18日，约翰霍普金斯大学冠状病毒资源中心报告全球确诊病例为4,730,323例并且死亡315,482例。据报道，这种病毒通过呼吸道飞沫(如咳嗽)直接在人与人之间接触传播或可能通过受污染的表面传播。
COVID-19的最初症状不是很具体。人们可能会出现流鼻涕、头痛、肌肉疼痛和疲倦。发烧、咳嗽和呼吸道症状通常会在两三天后出现，并可能导致严重的肺炎和死亡。临床症状的严重程度要求大约20％的患者留在医院而5％的患者需要进入重症监护室。最严重的形式主要见于因年龄(70岁以上)或相关疾病而易受患病的人群。然而，在30％至60％的感染对象中，感染也可能是无症状的或缺乏典型症状的(引起很少或没有临床表现)。潜伏期平均为5天，极端为2至12天。更重要的是，据报道，没有症状的人可以将病毒传播给他人，因此显示了开发一种灵敏且可靠的测试来检测SARS-CoV-2以通过限制SARS-CoV-2的传播来帮助挽救生命的重要性。
SARS-CoV-2属于冠状病毒科(β冠状病毒(Betacoronavirus)属)大家族。SARS-CoV-2在基因上与SARS冠状病毒和蝙蝠SARS样冠状病毒相似。其是一种正义单链RNA。尽管蝙蝠可能是SARS-CoV-2的宿主，但仍在研究穿山甲(马来亚穿山甲)是否是这种新型人类病毒的可能中间宿主(Lam et al.,“Identifying SARS-CoV-2Related Coronaviruses inMalayan Pangolins,”Nature doi.org/10.1038/s41586-020-2169-0(2020))。SARS-CoV-2在已知的β冠状病毒中是独一无二的，因为它结合了一个多碱基切割位点，已知这一特性会增加其他病毒的致病性和传播性(Andersen et al.,“The Proximal Origin of SARS-CoV-2,”Nature Medicine 26:450-452(2020)；Walls et al.,“Structure,Function,andAntigenicity of the SARS-CoV-2Spike Glycoprotein,”Cell 181(2):281-292(2020)；Coutard et al.,Antiviral Research176:104742(2020))。
目前，有两大类SARS-CoV-2诊断测试。第一类包括用于检测病毒本身的分子分析，例如聚合酶链式反应(PCR)，第二类包括用于检测宿主对病毒的反应的免疫测定(Patel etal.,“Report from the American Society for Microbiology COVID-19InternationalSummit,23March 2020:Value of Diagnostic Testing for SARS-CoV-2/COVID-19,”mBio11(2):e00722-20(2020)。
由于对感染产生抗体反应需要时间，因此抗体测试对于检测无症状患者或急性疾病早期患者中的感染没有用处。因此，分子测定在检测样品中是否存在病毒不仅更灵敏，而且它们也是早期检测感染的更佳选择，这对于有效防止COVID-19的传播是必要的。
目前，大多数可用已开发的SARS-CoV-2PCR测试都开发用于检测SARS-CoV-2基因组的多个区域，每个靶扩增子向不同的检测通道提供输出信号(例如SARS-CoV-2第一靶区的所有扩增子在第一通道中产生信号，而SARS-CoV-2第二靶区的所有扩增子在第二通道中产生信号)。每个通道的单个靶检测的局限是可能缺乏稳健性，因为遗传多态性或潜在突变可能会危及病毒检测，并从而可能导致假阴性结果(Nagy et al.,“Evaluation of TaqManqPCR System Integrating Two Identically Labelled Hydrolysis Probes in SingleAssay,”Scientific Reports 7:41392(2017))。在大流行情况下，未能在受感染患者中检测到病毒是一个主要问题，因为它阻碍了病毒的有效遏制，并可能引发继发感染部位或第二“波”感染。
本申请旨在克服本领域中的这些和其他缺陷。
发明内容
本申请的第一方面涉及一种用于检测样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)存在或不存在的方法。该方法包括使样品与初级寡核苷酸(primaryoligonucleotide)引物组接触，其中初级寡核苷酸引物组包含(i)第一寡核苷酸引物，其包含与开放阅读框1a(ORF1a)的SARS-CoV-2跨膜结构域2基因的第一部分互补的核苷酸序列，和(ii)第二寡核苷酸引物，其包含由与初级寡核苷酸引物组的所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。然后使经接触的样品在适合产生跨膜结构域2基因扩增产物的条件下进行扩增反应，并基于这些扩增产物的产生来检测样品中SARS-CoV-2的存在或不存在。
本公开的另一方面涉及一种用于检测样品中SARS-CoV-2存在或不存在的方法，包括使样品与上述初级寡核苷酸引物组和二级寡核苷酸引物组接触。二级寡核苷酸引物组包含(i)包含与SARS-CoV-2N基因的第一部分互补的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物，和(ii)第二寡核苷酸引物，其包含与由二级寡核苷酸引物组的所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。根据这一方面，在适合产生跨膜结构域2和N基因扩增产物的条件下进行扩增反应，并且基于这些扩增产物的产生来检测SARS-CoV-2的存在或不存在。
本申请的另一方面涉及一种适用于检测SARS-CoV-2的分离寡核苷酸。该分离寡核苷酸包含从中选择的核苷酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
本申请的另一方面涉及一种用于检测SARS-CoV-2跨膜结构域2基因的寡核苷酸引物组。寡核苷酸引物组包含含有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物，和含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列的第二寡核苷酸引物。
本申请的另一方面涉及一种用于检测SARS-CoV-2N基因的寡核苷酸引物组。寡核苷酸引物组包含含有SEQ ID NO:4的核苷酸序列的第一寡核苷酸引物，和含有SEQ ID NO:5的核苷酸序列的第二寡核苷酸引物。
本申请公开了一种实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，它为对专用于检测生物样品中SARS-CoV-2的灵敏测定的临床需求提供了一种解决方案。这一测定的特征是寡核苷酸，其适用于确定从疑似患有COVID-19的个体获得的测试样品(例如鼻咽样品)中是否定性存在SARS-CoV-2。提供了一种具有相同标记探针的双靶测定以规避由于遗传多态性或潜在突变导致的假阴性结果的潜在问题。因此，所公开的测定更好地保证了未来测定的包容性。
附图说明
图1是示出SARS-CoV-2上扩增子靶的相对位置的示意图。两个不同的SARS-CoV-2引物和探针组靶向的两个SARS-CoV-2基因组区域位于(i)在位于完整SARS-CoV-2基因组序列内第9928-10007位的开放阅读框1ab(ORF1ab)区域(编码ORF1a的跨膜结构域2(TM2)基因的区域)内，和(ii)在位于完整SARS-CoV-2基因组序列中第29257-29339位的N基因(编码核衣壳磷蛋白)中。扩增子的预期大小如下：ORF1ab区域中的靶为80个碱基对而N基因中的靶为83个碱基对。
图2A-图2C是显示将本申请描述的SARS-CoV-2检测测定(“测试方法”)的灵敏度与Seegene SARS-CoV-2检测测定(图2A)、Roche SARS-CoV-2检测测定(图2B)和VircellSARS-CoV-2检测测定(图2C)进行比较研究的结果(Ct值)的表格。
具体实施方式
本公开涉及适用于检测严重急性呼吸道冠状病毒2(SARS-CoV-2)的方法和试剂。SARS-CoV-2包含一个大小从29.8kb到29.9kb不等的单链RNA基因组。分离的SARS-CoV-2基因组的第一个序列以登录号NC_045512保藏在Genbank。SARS-CoV-2的基因组结构具有其他已知冠状病毒的特征。特别地，超过三分之二的基因组包含ORF1ab区域(包含ORF1a和ORF1b)，该区域位于基因组的5’端并编码ORF1ab多蛋白。其余三分之一的基因组位于ORF1ab区域的3’，由编码结构蛋白的基因组成，该结构蛋白包括表面(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白。此外，SARS-CoV-2包含由ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b和ORF8区域编码的六种辅助蛋白。本文公开的检测SARS-CoV-2的方法是通过检测称为跨膜结构域2基因的ORF1a内的SARS-CoV-2基因组RNA的至少第一独特区域来实现的。该基因区域单独或与位于N基因内的第二独特区域SARS-CoV-2基因组RNA一起检测。
因此，本申请的第一方面涉及一种用于检测样品中SARS-CoV-2的存在或不存在的方法。本方法涉及使所述样品与初级寡核苷酸引物组接触。该初级寡核苷酸引物组包含：(i)第一寡核苷酸引物，其包含与SARS-CoV-2的ORF1a的跨膜结构域2(TM2)基因的第一部分互补的核苷酸序列，和(ii)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。对所接触的样品在适合产生TM2基因扩增产物的条件下进行扩增反应，并且基于产生的那些TM2基因扩增产物检测样品中是否存在SARS-CoV-2。
如上所述，第一个表征的SARS-CoV-2基因组RNA序列是保藏在Genbank且登录号为NC_045512的序列。虽然本文所描述的引物和探针是参考该基因组序列设计的，但应当理解的是，如本文所描述的检测SARS-CoV-2的方法不限于仅检测该病毒分离株，还包括检测SARS-CoV-2病毒的其他分离株和天然变体。迄今为止，在GenBank中发现了超过3500个SARS-CoV-2分离株的基因组序列，并且本文公开的方法适用于检测样品中这些基因组序列中的每一个的存在。
由于可能会或可能不会导致表型变化的基因组序列的一个或多个自然发生的突变，包括但不限于点突变、重排、插入、缺失等，SARS-CoV-2的天然变体具有与SARS-CoV-2的基因组序列不同的序列。在一些实施方式中，使用所公开的方法检测到的SARS-CoV-2变体与SARS-CoV-2的基因组具有至少75％的序列相似性，与SARS-CoV-2基因组具有至少80％的序列相似性，与SARS-CoV-2基因组具有至少85％的序列相似性，与SARS-CoV-2基因组具有至少90％的序列相似性，与SARS-CoV-2基因组具有至少95％的序列相似性，或与SARS-CoV-2的基因组序列的相似性>95％。
如本文所用，“样品”是指任何可能含有SARS-CoV-2的基因组RNA的生物样品。在一些实施方式中，生物样品是生物流体或生物组织。可经受本文公开的方法的生物流体样品包括但不限于鼻咽样品、口咽样品、唾液样品。其他合适的生物流体样品包括尿液、血液、血浆、血清、精液、粪便、痰液、脑脊液、泪液、粘液、羊水等。生物组织样品是包含一种或多种特定类型的细胞聚集体的样品(与形成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一的那些细胞间物质相结合)。可经受本文公开的方法的生物组织样品的实例包括但不限于组织活检或单个细胞。在生物样品的情况下，样品可以是原始样品或在对原始样品进行各种处理或制备后获得的加工样品。
如上所述，SARS-CoV-2基因组是单链RNA基因组。因此，在一些实施方式中，在分析之前或为分析，从样品中提取或分离RNA是有益的或必须的。RNA分子可以从细胞和组织中分离出来并使用本领域已知的方法进行量化，例如胍-酸-苯酚提取、使用氯化铯或三氟乙酸铯的密度梯度离心、玻璃纤维过滤和磁珠分离，根据样品选择特定的提取程序。在某些情况下，使用某些技术，也可以在不从样品中提取RNA的情况下分析核酸。
在实践本申请的方法时，将SARS-CoV-2RNA或其部分逆转录合成互DNA(cDNA)，然后对其进行扩增和检测或直接检测。SARS-CoV-2RNA或其部分的逆转录可以使用逆转录酶(例如，禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶或莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)、脱氧核糖核苷酸的混合物以及适当的缓冲液和本领域技术人员所熟知的反应条件来实现。在一些实施方式中，使用随机六聚体引物或寡(dT)引物引发逆转录反应。在一些实施方式中，使用基因特异性引物引发逆转录反应。例如，在一些实施方式中，使用如本文所描述的初级寡核苷酸引物组的第一引物(即包含与ORF1a内TM2基因区域互补的序列的引物)来引发逆转录反应。在一些实施方式中，使用本文所描述的二级寡核苷酸引物组的第一引物(即包含与N基因区域互补的核苷酸序列的引物)来引发逆转录反应。在一些实施方式中，使用初级寡核苷酸引物组的第一引物和本文所描述的二级寡核苷酸引物组的第一引物来引发逆转录反应。因此，在一些实施方式中，所述样品是包含SARS-CoV-2基因组RNA逆转录产物的样品。
逆转录可以单独进行，也可以与扩增步骤结合进行，例如逆转录聚合酶链式反应，该逆转录聚合酶链式反应可以进一步修改为定量的，例如定量实时RT-PCR，如美国专利号5,639,606和Holland et al.,Proc Natl Acad Sci USA 88(16):7276(1991)中所述，其在此通过引用整体并入。下文更详细地描述了合适的扩增反应过程。
SARS-CoV-2的ORF1ab区域的核酸序列在下面提供为SEQ ID NO:10(Genbank登录号QHD43415.1；UniProt ID No.P0DTC1；Wu et al.,“A New Coronavirus Associatedwith Human Respiratory Disease in China”Nature579(7798):265-269(2020)，其在此通过引用整体并入)。
由ORF1ab编码的两种大型复制酶多蛋白pp1a和pp1ab被蛋白水解切割成16个推定的非结构蛋白(nsps)(Chan et al.,Emer.Microbes Infect.9(1):221-236(2020)，其在此通过引用整体并入)。这些推定的nsps包括两种病毒半胱氨酸蛋白酶，即nsp3(木瓜蛋白酶样蛋白酶)和nsp5(糜蛋白酶样、3C样或主蛋白酶)以及nsp12(RNA-依赖性RNA聚合酶[RdRp])、nsp13(解旋酶)和可能参与病毒转录和复制的其他nsps(Chan et al.,Emer.Microbes Infect.9(1):221-236(2020)，其在此通过引用整体并入)。含有跨膜2域(TM2)基因的nsp4编码区(参见Snijder et al.,“Unique and Conserved Features ofGenome and Proteome of SARS-coronavirus,an Early Split-Off from theCoronavirus Group 2Lineage,”J.Mol.Biol.331(5):99–1004(2003)，其在此通过引用整体并入)是使用本文所描述的方法检测的SARS-CoV-2区域。TM2基因具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列，其显示出对SARS-CoV-2特异的变异性(相对于其他病毒基因序列)。因此，检测TM2基因对于检测SARS-COV-2具有选择性。
ggauacaacuagcuacagagaagcugcuuguugucaucucgcaaaggcucucaaugacuucaguaacucagguucugaugu(SEQ ID NO:12)
在一些实施方式中，本文所描述的方法涉及单独检测SARS-CoV-2的TM2基因。在一些实施方式中，本文所描述的方法涉及检测SARS-CoV-2的TM2基因以及检测SARS-CoV-2的至少一个其他区域。在一些实施方式中，检测到的SARS-CoV-2RNA的第二区域是N基因内的一个区域。因此，本公开的一个方面涉及一种检测样品中是否存在SARS-CoV-2的方法，涉及使所述样品与初级寡核苷酸引物组(与ORF1a的TM2基因互补)和至少二级寡核苷酸引物组接触。二级寡核苷酸引物组包含(i)第一寡核苷酸引物，其包含与SARS-CoV-2N基因的第一部分互补的核苷酸序列，和(ii)第二寡核苷酸引物，其包含与由二级寡核苷酸引物组的第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。
N基因的核苷酸序列如下提供为SEQ ID NO:11(Genbank登录号NC_045512(28274..29533)；Gene ID No.43740575)：
如本文所用，“寡核苷酸引物”是指核酸分子，其以序列特异性方式与互补核酸分子(即靶核酸分子)杂交，并能够在适当条件下使用聚合酶链式反应(PCR)等方法启动模板指导合成(例如在四种核苷酸三磷酸和一种聚合酶(例如DNA聚合酶、逆转录酶等)存在的情况下，在含有任何必要试剂的适当缓冲溶液中并在合适的温度下)。这种模板指导的合成称为引物延伸并导致产生引物延伸产物。
本公开的寡核苷酸引物可以是核糖核苷酸、脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的磷酸糖骨架寡核苷酸、核苷酸类似物及其混合物的形式。在一些实施方式中，寡核苷酸引物是单链脱氧核糖核酸(DNA)分子。在一些实施方式中，本文所描述的方法中用于检测是否存在SARS-CoV-2的引物的长度均至少为10个核苷酸。在一些实施方式中，引物的长度至少约为15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。优选地，引物序列的鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)比例为高于30％、高于35％、高于40％、高于45％、高于50％、高于55％或高于60％，以防止引物的发夹形成。在本文所描述的方法中使用的引物可以使用任何合适的方法制备，例如常规的磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化实施方式，只要引物能够与其目的靶核苷酸序列杂交即可。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、缓冲液、和反应混合物中的核苷酸组成。
本公开的引物包含与“靶核苷酸序列”互补或基本互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，靶核苷酸序列包含SARS-CoV-2基因组RNA的核苷酸序列部分，例如SARS-CoV-2的TM2基因或N基因的核苷酸序列。在一些实施方式中，靶核苷酸序列包含SARS-CoV-基因组RNA的互补序列，例如在逆转录反应中形成的SARS-CoV-2基因组RNA的互补DNA(cDNA)。在一些实施方式中，靶核苷酸序列包含由本公开的引物形成的引物延伸产物内的序列。
术语“互补”和“基本上互补”是指核苷酸之间的碱基配对，诸如例如寡核苷酸引物与其靶核苷酸序列之间的碱基配对。互补核苷酸通常是腺嘌呤和胸腺嘧啶，腺苷和尿嘧啶，以及鸟嘌呤和胞嘧啶。在本文公开的方法的背景下，寡核苷酸引物不需要完全互补性以与其靶核苷酸序列杂交。本文公开的引物序列可以在一定程度上进行修饰，而不会丧失作为特异性引物的效用。根据本公开的方法，所述初级和二级引物组的第一和第二寡核苷酸引物与其靶核苷酸序列至少80％互补。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸引物与与其靶核苷酸序列至少85％、至少90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。
如本领域已知的，互补和部分互补的核酸序列的杂交可以通过调整杂交条件以增加或减少严格性来获得，即通过调整杂交温度或缓冲液的盐含量。所公开序列的微小修饰和杂交条件的任何必要调整以保持特异性仅需要常规实验并且在本领域普通技术范围内。在一些实施方式中，引物可以包含与靶核酸的至少约8、至少约10、至少约15、或约20至约40个连续核苷酸杂交的核苷酸序列(即引物序列将与靶核酸内的连续序列杂交)。相互互补的核酸分子可以在低、中和/或高严格条件下相互杂交。
本文公开的寡核苷酸引物不是天然存在的基因组序列，因此不是天然产物。SARS-CoV-2基因组由正义单链RNA组成。从全长基因组RNA，ORF1a和ORF1b多蛋白被直接翻译(即不产生基因组RNA的中间补体)，而部分或全部结构蛋白的翻译涉及经由不连续转录事件产生亚基因组RNA。由于病毒基因组和任何亚基因组RNA片段均由核糖核苷酸组成(即附加到胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶核碱基之一的核糖糖)，由脱氧核糖核苷酸组成的本文所描述的寡核苷酸引物(即附加到胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶核碱基之一的脱氧核糖糖)是自然界中不存在的结构独特的分子。
本文所描述的寡核苷酸引物对设计用于使用扩增反应(例如PCR或实时-PCR)描绘和扩增SARS-CoV-2基因组的特定区域。这些示例性扩增反应包含两个或三个步骤循环。两步循环具有高温变性步骤，然后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤、杂交步骤和单独的延伸步骤。在杂交步骤期间，如本文所描述的一个或多个引物组的第一和/或第二寡核苷酸引物与它们各自的靶核苷酸序列杂交，并且在延伸步骤中，所述引物被延伸以形成引物延伸产物。一种引物的引物延伸产物被设计用作靶核苷酸序列，其用于扩增反应中引物组的另一引物。因此，反应循环的重复导致靶区域的指数扩增，即引物包含的SARS-CoV-2的TM2基因区域和/或N基因区域。分别由第一或第二引物核苷酸序列限定在其5’末端上和由所述第二或第一引物核苷酸序列的互补物定义在其3’末端的这一靶区域在本文中称为扩增产物或扩增子。在一些实施方式中，根据此处描述的方法产生的扩增产物是长度至少为20个核苷酸的核酸分子。在一些实施方式中，所述扩增产物的长度为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100个核苷酸。
各种核酸扩增反应在本领域中是众所周知的并且适用于本公开的方法中。这些核酸扩增反应包括但不限于如本文所描述的PCR(美国专利号5,219,727，其在此通过引用整体并入)及其变体例如原位聚合酶链式反应(美国专利号5,538,871，其在此通过引用整体并入)、定量聚合酶链式反应(美国专利号5,219,727，其在此通过引用整体并入)、巢式聚合酶链式反应(美国专利号5,556,773，其在此通过引用整体并入)、自持序列复制及其变体(Guatelli et al.“Isothermal,In vitro Amplification of Nucleic Acids by aMultienzyme Reaction Modeled after Retroviral Replication,”Proc Natl Acad SciUSA 87(5):1874-8(1990)，其在此通过引用整体并入)、转录扩增及其变体(Kwoh et al.“Transcription-based Amplification System and Detection of Amplified HumanImmunodeficiency Virus type 1with a Bead-Based Sandwich HybridizationFormat,”Proc Natl Acad Sci USA 86(4):1173-7(1989)，其在此通过引用整体并入)、Qb复制酶及其变体(Miele et al.“Autocatalytic Replication of a Recombinant RNA.”JMol Biol 171(3):281-95(1983)，其在此通过引用整体并入)、冷-PCR(Li et al.“Replacing PCR with COLD-PCR Enriches Variant DNA Sequences and Redefines theSensitivity of Genetic Testing.”Nat Med 14(5):579-84(2008)，其在此通过引用整体并入)。根据所采用的扩增技术，在扩增过程中(例如实时-PCR)或在扩增之后检测扩增的分子，并且可涉及检测标记的扩增产物、检测包含扩增核酸的成分或扩增过程的副产物，例如与扩增相关的物理、化学、发光或电学方面(例如荧光、pH变化、热变化等)。下文更详细地描述了合适的核酸检测测定。
在一些实施方式中，本公开的方法中采用的核酸扩增反应是实时PCR。实时PCR，也称为定量实时聚合酶链式反应或动力学聚合酶链式反应，用于扩增并同时量化样品中存在的一种或多种核酸分子。它可以检测和量化样品中特定序列(当归一化为核酸输入或其他归一化基因时，作为绝对拷贝数或相对数量)。实时PCR可与逆转录聚合酶链式反应相结合以量化RNA(实时RT-PCR)。在实时PCR的指数期中存在的特定核酸的相对浓度是通过在对数尺度上绘制荧光(产生扩增产物时产生的)对循环数来确定的)。通过将所述结果与由已知量核酸的连续稀释的实时PCR产生的标准曲线进行比较来确定样品中存在的一种或多种核酸分子的量。
在一些实施方式中，扩增反应以“多重”方式进行，以检测样本中是否存在SARS-CoV-2。术语“多重”是指同时进行的多个测定(即在一个反应管中)，其中检测和分析步骤通常并行执行。在本公开的背景下，多重测定涉及将本文所描述的初级寡核苷酸引物组与一种或多种附加寡核苷酸引物组(例如二级寡核苷酸引物组)和本文所描述的对照寡核苷酸引物组组合使用，以同时识别样品中SARS-CoV-2RNA的两个或多个区域。
根据本文所公开的方法，初级引物组的第一寡核苷酸引物包含与SARS-CoV-2的ORF1a的TM2基因的一部分互补的核苷酸序列。如上所述，TM2基因具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列(对应于以上作为SEQ ID NO:10提供的ORF1ab区域的核苷酸9663-9743)。在一些实施方式中，初级引物组的示例性第一寡核苷酸引物与GGATACAACTAGCTACAGAGAA(SEQ IDNO:1)的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性。如本文所用，术语“序列同一性”定义了在两个不同序列之间完全匹配的连续核苷酸残基的量，其中测量与所述两个序列中较短的序列有关。在一些实施方式中，初级引物组的第一寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％和至少98％和至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，初级引物组的第一寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列。
在一些实施方式中，初级引物组的示例性第二寡核苷酸引物包含与由本文所描述的初级引物组的第一寡核苷酸引物形成的引物延伸产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，初级引物组的第二寡核苷酸引物包含与CATCAGAACCTGAGTTACTGAA(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，初级引物组的第二寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％和至少98％和至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，初级引物组的第二寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
根据本文公开的方法，二级引物组的第一寡核苷酸引物包含与SARS-CoV-2基因组RNA的N基因的一部分互补(即与SEQ ID NO:11的核苷酸序列的一部分互补)的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的示例性第一寡核苷酸引物包含与AACGTGGTTGACCTACAC(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的第一寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％和至少98％和至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的第一寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
在一些实施方式中，二级引物组的示例性第二寡核苷酸引物包含与由如本文所描述的二级引物组的第一寡核苷酸引物形成的引物延伸产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的第二寡核苷酸引物包含与GCTTATTCAGCAAAATGACTTGA(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的第二寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、和至少98％、和至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的第二寡核苷酸引物包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列。
在一些实施方式中，初级引物组和/或fg级引物组的至少一个寡核苷酸引物包含可检测的标签。所述可检测标签可共价或非共价偶联至引物的5’端。根据这一实施方式，将可检测标签掺入由引物组的第一和第二引物形成的扩增产物中，并且通过检测标记的TM2和/或N基因扩增产物来检测SARS-CoV-2的存在与否。
在一些实施方式中，如上所述的初级寡核苷酸引物组和/或二级寡核苷酸引物组各自还包含寡核苷酸探针。如本文所用，术语“探针”是指在与靶核苷酸序列相互作用时产生可检测响应的寡核苷酸。在一些实施方式中，如本文所公开的初级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针包括至少一个报告部分以及与由初级寡核苷酸引物组的第一和第二引物形成的TM2扩增产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针包含至少一个报告部分以及与由第二引物组的第一和第二引物形成的N基因扩增产物互补的核苷酸序列。
在一些实施方式中，寡核苷酸探针包含一对形成能量转移对的部分，当探针响应其与结合配偶体的相互作用而发生一些状态变化时可检测到这些部分。在一些实施方式中，本文所描述的寡核苷酸探针包含多于两个部分，例如荧光团和一个或多个猝灭剂部分。根据本公开的方法，探针与其各自扩增产物的互补区域杂交，并且通过在扩增反应期间或之后检测寡核苷酸探针的一个或多个报告基团或者所述报告基团之间的相互作用来确定样品中SARS-CoV-2的存在。
在一些实施方式中，初级引物组的寡核苷酸探针包含与CTGCTTGTTGTCATCTCGCAAAG(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，二级引物组的寡核苷酸探针包含与CCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATT(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
如本文所用，“可检测标签”或“报告部分”包括提供可检测信号并且可以与如本文所描述的寡核苷酸引物或探针偶联的任何分子。许多可用于标记核酸的可检测标记在本领域中是已知的。直接报告分子包括荧光团、发色团和放射团。荧光团的非限制性示例包括红色荧光方酸菁染料诸如例如2,4-双[l,3,3-三甲基-2-亚吲哚甲基]环丁烯二鎓-l,3-二氧戊环、红外染料例如2,4-双[3,3-二甲基-2-(lH-苯并[e]亚吲哚甲基)]环丁烯二鎓-l,3-二氧戊环、或橙色荧光方酸菁染料诸如例如2,4-双[3,5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二烯鎓-1,3-二醇酸酯。荧光团的其他非限制性例子包括量子点，Alexa
染料、AMCA、
630/650、
650/665、
Cascade
CyDyeTM，包括但不限于Cy2TM、Cy3TM和Cy5TM，DNA嵌入染料，6-FAMTM，荧光素，HEXTM，6-JOE，Oregon
488，Oregon
500，Oregon
514，PacificBlueTM，REG，藻胆蛋白包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，Rhodamine GreenTM，Rhodamine RedTM，ROXTM，TAMRATM，TETTM，四甲基罗丹明，或Texas
合适的可检测标签还包括间接报告分子，例如生物素，它必须与另一种分子(例如链霉亲和素-藻红蛋白)结合才能进行检测。在多重反应中，如果可以基于另一特征(例如它们杂交的固体支持物上的大小或特定位置或身份)来确定扩增产物的同一性，则与引物或探针偶联的报告部分或可检测标签对于被检测的多重反应中的每个靶核酸分子可能是相同的。替代地，与多重反应的引物和探针偶联的报告部分或可检测标签对于每个被检测的不同靶核酸分子可能是不同的。
在一些实施方式中，将基于荧光团/猝灭剂的检测系统用于本文公开的方法和组合物中。根据这一实施方式，初级和/或二级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针包括报告部分和一个或多个猝灭剂部分。报告部分和猝灭剂部分彼此接近，从而猝灭剂猝灭报告部分产生的信号。在一些实施方式中，核酸分子的构象变化将报告部分和猝灭剂分开以允许报告部分发出可检测的信号。在一些实施方式中，报告部分或猝灭剂从核酸分子上的切割(例如，通过引物序列的聚合酶延伸)将报告部分与猝灭剂分开以允许报告部分发出可检测的信号。基于报告部分/猝灭剂的检测系统降低了背景并因此提高了例如本文所公开的那些多重反应的灵敏度。
在特定实施方式中，可用作猝灭剂的分子包括但不限于四甲基罗丹明(TAMRA)、DABCYL(DABSYL、DABMI或甲基红)、蒽醌、硝基噻唑、硝基咪唑、孔雀石绿、Black Hole
例如BHQl(Biosearch Technologies)、Iowa
或ZEN猝灭剂(来自Integrated DNA Technologies,Inc.)和TIDE猝灭剂(例如TID猝灭剂2(TQ2)和TIDE猝灭剂3(TQ3))(来自AAT Bioquest)。在一个实施方式中，本文所描述的方法中使用的探针包含两个猝灭剂分子：内部猝灭剂和3’猝灭剂。根据这一实施方式，初级引物组的示例性探针包含在5’端具有荧光报告部分的核苷酸序列、内部猝灭剂和3’猝灭剂，例如FAM-CTGCTTGTT-ZEN-GTCATCTCGCAAAG-IBFQ(SEQ ID NO:3)。类似地，二级引物组的示例性探针包含在5’端具有荧光报告啊分的核苷酸序列、内部猝灭剂和3’猝灭剂，例如FAM-CCATCAAAT-ZEN-TGGATGACAAAGATCCAAATT-IBFQ(SEQ ID NO:6)。根据上述实施方式，初级和二级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的报告部分是相同的报告部分。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物组和第二寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的报告部分是不同的报告部分。
如本文所描述的报告部分和猝灭剂部分可以通过共价键或非共价相互作用与核酸分子连接。在一些实施方式中，报告和/或猝灭剂部分使用连接部分连接。如本文所公开的用于将报告分子或猝灭剂分子连接至寡核苷酸引物或探针的连接部分和方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于3'硫醇基(参见例如Zuckerman et al,Nucleic AcidsResearch 15:5305-5321(1987)，其在此通过引用整体并入)；3'巯基部分(参见例如Sharmaet al,Nucleic Acids Research 19:3019(1991))；可从Applied Biosystems,FosterCity,Calif.获得的经由AminolinkTM II的5'磷氨基(参见例如Giusti et al,PCR Methodsand Applications 2:223-227(1993)，其在此通过引用整体并入)；3'氨基烷基磷酰基(参见例如美国专利号4,739,044，其在此通过引用整体并入)；氨基磷酸酯键，5'巯基和3’氨基(参见Agrawal et al.,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)；Sproat et al,Nucleic Acids Research 15:4837(1987)；和Nelson et al,Nucleic Acids Research17:7187-7194(1989)，其在此通过引用整体并入)。
本领域已知并适用于本文公开的方法的合适的寡核苷酸引物和探针检测系统包括但不限于荧光嵌入染料、基于FRET的检测方法(美国专利号5,945,283；PCT公开WO 97/22719；两者均通过引用整体并入)、Scorpion探针检测系统(Thelwell et al.,NucleicAcids Research 28:3752-3761,2000，其在此通过引用整体并入)、分子信标(Tyagi etal.,Nat.Biotechnol.14(3):303–8(1996)，其在此通过引用整体并入)和TaqMan检测系统(Holland et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 88(16):7276-7280(1991)，其在此通过引用整体并入)。
根据本文所描述的方法产生的核酸扩增产物可以通过多种技术进一步分析以确定分子的存在、量或身份。这些技术的非限制性示例包括测序、质量测定和碱基组成确定。该分析可以识别所有或部分扩增核酸的序列或者其一种或多种性质或特征，以揭示所需信息。
在一些实施方式中，本申请的方法还涉及一种或多种内部对照的结合和检测。在一个实施方式中，内部对照是阳性对照。合适的阳性对照，包括任何非SARS-CoV RNA或cDNA序列。例如，非SARS-CoV序列可以是待测样品的内在成分。替代地，将非SARS-CoV序列刺突到待检测的样品中。在一个实施方式中，刺穿的非SARS-CoV对照模板是另一种不相关病毒的基因组序列或其一部分。在一个实施方式中，阳性对照是源自马动脉炎病毒的基因组序列或其部分。使用对照引物组扩增和检测阳性对照。所述对照引物组具有第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，该第一寡核苷酸引物包含与所述对照核酸模板的第一部分互补的核苷酸序列，该第二寡核苷酸引物包含与由所述对照引物组的第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。使含有对照模板和对照试剂的样品连同初级和二级引物组在同一反应混合物中经受一组扩增反应条件，以用于同时检测目的靶区域，即ORF1a的TM2、N基因和对照模板区域。
本申请的另一方面涉及一种适用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的分离寡核苷酸，其中所述分离寡核苷酸包含与从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中选择的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
如上文更详细描述的，本公开的寡核苷酸包括重组寡核苷酸和化学合成的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核苷酸、修饰的核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的磷酸糖骨架寡核苷酸、核苷酸类似物及其混合物的形式。在一些实施方式中，寡核苷酸是单链DNA分子。在一些实施方式中，寡核苷酸长度至少为10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。优选地，寡核苷酸的鸟嘌呤/胞嘧啶(GC)比例为高于30％、高于35％、高于40％、高于45％、高于50％、高于55％或高于60％，以防止发夹结构的形成。这些寡核苷酸可以使用合适的方法制备，例如化学合成、重组方法或两者。
本申请的另一方面涉及一中用于检测SARS-CoV-2跨膜结构域2基因的寡核苷酸引物组。该寡核苷酸引物组包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，该第一寡核苷酸引物包含与SARS-CoV-2的TM2基因的区域互补的核苷酸序列，该第二寡核苷酸引物包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物包含与选自SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述引物组的第二寡核苷酸引物包含与选自SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸引物组还包含寡核苷酸探针。寡核苷酸探针包含与所述引物组的第一或第二寡核苷酸引物的引物延伸产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸探针包含与选自SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。如上文所述，寡核苷酸探针可以包含报告部分和至少一个猝灭剂分子。报告分子和猝灭剂如前所述。在一个实施方式中，所述引物组的寡核苷酸探针包含5’荧光报告部分、内部猝灭剂分子和3’猝灭剂分子。
本申请的另一方面涉及一种用于检测SARS-CoV-2N基因的寡核苷酸引物组。该寡核苷酸引物组包含第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，该第一寡核苷酸引物包含与SARS-CoV-2的N基因区域互补的核苷酸序列，该第二寡核苷酸引物包含与由第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，第一寡核苷酸引物包含与选自SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述引物组的第二寡核苷酸引物包含与选自SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸引物组还包含寡核苷酸探针。寡核苷酸探针包含与所述引物组的第一或第二寡核苷酸引物的引物延伸产物互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸探针包含与选自SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。如上文所述，寡核苷酸探针可以包含报告部分和至少一种猝灭剂分子。报告分子和猝灭剂如前所述。在一个实施方式中，所述引物组的寡核苷酸探针包含5’荧光报告部分、内部猝灭剂分子和3’猝灭剂分子。
本发明还包括用于检测测试样品中SARS-CoV-2存在的试剂盒。可以包括在试剂盒中的合适的扩增反应试剂可以包括例如缓冲液、具有逆转录酶活性的酶、具有聚合酶活性的酶、酶辅助因子如镁或锰、盐类、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、和脱氧核苷三磷酸(dNTP)(例如适合进行扩增反应的脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸、生物素化的dNTP)中的一种或多种。
取决于程序，试剂盒可还包含以下中的一种或多种：洗涤缓冲液和/或试剂、杂交缓冲液和/或试剂、标记缓冲液和/或试剂，以及检测工具。试剂盒中所含的缓冲液和/或试剂优选针对试剂盒预期的特定扩增/检测技术进行优化。使用这些缓冲液和试剂来执行程序的不同步骤的协议也可包含在试剂盒中。
在一些实施方式中，该试剂盒包含阳性对照。在一些实施方式中，试剂盒包含阴性对照。在一些实施方式中，阴性对照包含不受用于扩增和检测ORF1a的TM2基因或N基因的引物扩增的任何序列。此外，试剂盒可配备内部对照，以检查扩增程序并防止由于扩增程序失败而出现假阴性测试结果。选择最佳的内部对照序列，其方式是使其不会在扩增反应中与SARS-CoV-2靶核酸分子的扩增和检测竞争。在一些实施方式中，内部对照可以是源自不同病毒的序列，例如编码马动脉炎病毒的核苷酸序列或马动脉炎病毒的一个或多个基因。
试剂盒还可以包含用于在扩增之前从样品中分离核酸的试剂，例如适用于从样品中分离基因组RNA的试剂。
可以固体(例如冻干)或液体形式供应试剂。本公开的试剂盒任选地包含用于每种单独的缓冲液和/或试剂的不同容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)。每种组分通常适合在其各自的容器中等份分装或以浓缩形式提供。也可以提供适合进行扩增/检测测定的某些步骤的其他容器。试剂盒的各个容器优选保持密闭以供商业销售。
试剂盒还可以包含使用根据本公开的扩增反应试剂、引物组和/或引物/探针组的使用说明。根据本公开的一种或多种方法使用试剂盒的使用说明可包括处理生物样品、提取核酸分子和/或进行测试的使用说明；解释结果的说明以及政府机构(例如FDA)规范测试试剂的制造、使用或销售和结果而规定的形式的通知。
在一个实施方式中，试剂盒包含如上文所描述的适用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的寡核苷酸。在一些实施方式中，试剂盒包含如上文所描述的用于检测SARS-CoV-2TM2基因的寡核苷酸引物组。在一些实施方式中，试剂盒包含如上文所述检测SARS-CoV-2N基因的寡核苷酸引物组。在一些实施方式中，试剂盒包含如上文所描述的用于检测SARS-CoV-2TM2基因的寡核苷酸引物组和用于检测SARS-CoV-2N基因的寡核苷酸引物组。
在一个实施方式中，试剂盒包含用于进行实时逆转录聚合酶链式反应的一种或多种试剂。示例性试剂包括但不限于本文所描述的引物和探针、包含逆转录酶和DNA聚合酶的酶混合物、以及用于反应的合适缓冲液。
实施例
实施例1：靶向区域和测定设计
提供了以下引物和探针，它们与SARS-Cov-2基因组中存在的靶区域杂交，形成可检测的探针/靶杂交体，表明测试样品中存在SARS-CoV-2。
由两种不同SARS-CoV-2引物和探针组靶向的两个SARS-CoV-2基因组区域位于ORF1ab区域(编码ORF1a的跨膜结构域2(TM2)基因的区域)和N基因(编码核衣壳磷蛋白)(图1)。TM2扩增子的预期大小为80个碱基对而N基因扩增子的预期大小为83个碱基对。
SARS-CoV-2的两种特异性探针均具有5’荧光报告FAM染料、位于在探针序列的5’端上在离报告FAM染料第9和第10个碱基之间的内部
猝灭剂以及3’Iowa
暗猝灭剂(IBFQ)。具有内部猝灭剂的优点是减少FAM染料和猝灭剂之间的距离，并因此与末端3’猝灭剂结合，提供更高程度的猝灭并降低初始背景。认为在同一FAM检测通道上具有两个特异性SARS-CoV-2探针可以防止由于探针结合失败而导致的假阴性结果，并保证测定的包容性。它还改善了荧光反应，因为与单探针测定相比，第二个相同标记的探针对整体反应荧光具有累加效应。这种更高的荧光有助于弱阳性样本的评估和解释(Nagy et al.,“Evaluation of TaqMan qPCR System Integrating Two Identically LabelledHydrolysis Probes in Single Assay,”Scientific Reports 7:41392(2017)；Yip etal.,“Use of Dual TaqMan Probes to Increase the Sensitivity of 1-StepQuantitative Reverse Transcription-PCR:Application to the Detection of SARSCoronavirus,”Clinical Chemistry 51(10):1885-1888(2005)，它们在此通过引用整体并入)。
混合物进一步包括用于检测位于马动脉炎病毒(EAV)基因组中的序列的引物和探针组，该位于马动脉炎病毒(EAV)基因组中的序列用作内部对照(EAV测定的靶区域(NC_002532):1843-1976)。EAV的特异性探针具有5’荧光报告CY5染料和3’Iowa
暗猝灭剂(IBRQ)。
下表包括用于本文所述测定中的所有引物和探针的核酸序列。
表1
在严格的杂交测定条件下，这些引物和探针分别优先与源自SARS-CoV-2和马动脉炎病毒的靶核酸杂交。
实施例2：提取程序
使用用于自动提取的市售核酸提取试剂盒，样品输入体积为200μL且洗脱体积为55μL，从人鼻咽拭子中分离并纯化核酸。在提取过程中，将2μL内部对照(IC)添加到每个样品和阴性对照(NC)中。
实施例3：qPCR程序
将总共10μL纯化的核酸添加到由引物和探针混合物(1.5μL)、酶混合物(RT酶和Taq聚合酶)(1μL)和缓冲液(12.5μL)组成的实时RT-PCR反应混合物中(使用浓度见表1)，并且逆转录成cDNA，随后在Applied
7500实时PCR热循环仪中进行扩增。缓冲液组合物包括Tris、氯化钾、氯化镁、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、重组白蛋白、海藻糖，pH 8.7。循环运行配置如下。由于测定是检测SARS-CoV-2和内部对照的两个基因组区域的多重PCR，因此所有三个靶同时扩增。
PCR程序如下：50℃保持15分钟，94℃保持1分钟，40个循环：94℃保持8秒，和60℃保持1分钟。
实施例4：临床表现评估
本文公开的SAR-CoV-2检测测定的临床表现是使用前瞻性收集的鼻咽拭子(NPS)和口咽拭子(OPS)建立的。从疑似COVID-19的有症状患者收集了总计101份样本。临床表现研究在诊断实验室进行，并且通过将本文公开的方法(按照上述实施例2和3的方法进行)的结果与使用市售的SARS-CoV-2核酸扩增试剂盒(CE-IVD核酸扩增测定(NAAT))获得的结果进行比较来评估。结果(汇总于下表)显示，在使用本文公开的SARS-CoV-2检测测定的两个矩阵中，检测SARS-CoV-2的总体诊断灵敏度为100％(95％置信区间：91.78–100)且总体诊断特异性为100％(95％置信区间：93.84–100)。
通过本文公开的SARS-CoV-2检测测定获得的诊断灵敏度和特异性
进行了SARS-CoV-2特异性测定之间的比较研究，以确定本文公开的方法的灵敏度。特异地，将本文公开的SARS-CoV-2检测测定(“测试方式”)与来自Seegene(图2A)，Roche(图2B)和Vircell(图2C)的SARS-CoV-2测定进行比较。比较了各个临床阳性样品，并且图2A-2C的表格中显示的值对应于循环阈值(Ct)值，即荧光信号超过背景水平所需的循环数。当将本文公开的SARS-CoV-2测定的Ct值与市售的SARS-CoV-2检测测定进行比较时，与使用市售SARS-CoV-2检测测定获得的Ct值相比，本文公开的检测测定总是产生较低的Ct值，表明每个临床样品的灵敏度更高。
尽管本文详细地描绘和描述了优选的实施方式，但对于相关领域技术人员显而易见的是，在不背离本申请的精神的情况下，可以进行各种修改、添加、替换等，因此这些被认为处于所附权利要求书所限定的本申请的范围内。
序列表
<110> 卢森堡快速追踪诊断有限责任公司
<120> 用于扩增和检测SARS-COV-2的基于PCR的诊断试剂盒、组合物和方法
<130> 137519.12002
<150> 62/705,208
<151> 2020-06-16
<150> 63/005,781
<151> 2020-04-06
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggatacaact agctacagag aa 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 2
catcagaacc tgagttactg aa 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 3
ctgcttgttg tcatctcgca aag 23
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 4
aacgtggttg acctacac 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 5
gcttattcag caaaatgact tga 23
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccatcaaatt ggatgacaaa gatccaaatt 30
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 7
catctcttgc tttgctcctt ag 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 8
agccgcacct tcacattg 18
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 引物
<400> 9
cgctgtcaga acaacattat tgcccac 27
<210> 10
<211> 21291
<212> RNA
<213> Beta冠状病毒严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒
<400> 10
auggagagcc uugucccugg uuucaacgag aaaacacacg uccaacucag uuugccuguu 60
uuacagguuc gcgacgugcu cguacguggc uuuggagacu ccguggagga ggucuuauca 120
gaggcacguc aacaucuuaa agauggcacu uguggcuuag uagaaguuga aaaaggcguu 180
uugccucaac uugaacagcc cuauguguuc aucaaacguu cggaugcucg aacugcaccu 240
cauggucaug uuaugguuga gcugguagca gaacucgaag gcauucagua cggucguagu 300
ggugagacac uugguguccu ugucccucau gugggcgaaa uaccaguggc uuaccgcaag 360
guucuucuuc guaagaacgg uaauaaagga gcugguggcc auaguuacgg cgccgaucua 420
aagucauuug acuuaggcga cgagcuuggc acugauccuu augaagauuu ucaagaaaac 480
uggaacacua aacauagcag ugguguuacc cgugaacuca ugcgugagcu uaacggaggg 540
gcauacacuc gcuaugucga uaacaacuuc uguggcccug auggcuaccc ucuugagugc 600
auuaaagacc uucuagcacg ugcugguaaa gcuucaugca cuuuguccga acaacuggac 660
uuuauugaca cuaagagggg uguauacugc ugccgugaac augagcauga aauugcuugg 720
uacacggaac guucugaaaa gagcuaugaa uugcagacac cuuuugaaau uaaauuggca 780
aagaaauuug acaccuucaa uggggaaugu ccaaauuuug uauuucccuu aaauuccaua 840
aucaagacua uucaaccaag gguugaaaag aaaaagcuug auggcuuuau ggguagaauu 900
cgaucugucu auccaguugc gucaccaaau gaaugcaacc aaaugugccu uucaacucuc 960
augaagugug aucauugugg ugaaacuuca uggcagacgg gcgauuuugu uaaagccacu 1020
ugcgaauuuu guggcacuga gaauuugacu aaagaaggug ccacuacuug ugguuacuua 1080
ccccaaaaug cuguuguuaa aauuuauugu ccagcauguc acaauucaga aguaggaccu 1140
gagcauaguc uugccgaaua ccauaaugaa ucuggcuuga aaaccauucu ucguaagggu 1200
ggucgcacua uugccuuugg aggcugugug uucucuuaug uugguugcca uaacaagugu 1260
gccuauuggg uuccacgugc uagcgcuaac auagguugua accauacagg uguuguugga 1320
gaagguuccg aaggucuuaa ugacaaccuu cuugaaauac uccaaaaaga gaaagucaac 1380
aucaauauug uuggugacuu uaaacuuaau gaagagaucg ccauuauuuu ggcaucuuuu 1440
ucugcuucca caagugcuuu uguggaaacu gugaaagguu uggauuauaa agcauucaaa 1500
caaauuguug aauccugugg uaauuuuaaa guuacaaaag gaaaagcuaa aaaaggugcc 1560
uggaauauug gugaacagaa aucaauacug aguccucuuu augcauuugc aucagaggcu 1620
gcucguguug uacgaucaau uuucucccgc acucuugaaa cugcucaaaa uucugugcgu 1680
guuuuacaga aggccgcuau aacaauacua gauggaauuu cacaguauuc acugagacuc 1740
auugaugcua ugauguucac aucugauuug gcuacuaaca aucuaguugu aauggccuac 1800
auuacaggug guguuguuca guugacuucg caguggcuaa cuaacaucuu uggcacuguu 1860
uaugaaaaac ucaaacccgu ccuugauugg cuugaagaga aguuuaagga agguguagag 1920
uuucuuagag acgguuggga aauuguuaaa uuuaucucaa ccugugcuug ugaaauuguc 1980
gguggacaaa uugucaccug ugcaaaggaa auuaaggaga guguucagac auucuuuaag 2040
cuuguaaaua aauuuuuggc uuugugugcu gacucuauca uuauuggugg agcuaaacuu 2100
aaagccuuga auuuagguga aacauuuguc acgcacucaa agggauugua cagaaagugu 2160
guuaaaucca gagaagaaac uggccuacuc augccucuaa aagccccaaa agaaauuauc 2220
uucuuagagg gagaaacacu ucccacagaa guguuaacag aggaaguugu cuugaaaacu 2280
ggugauuuac aaccauuaga acaaccuacu agugaagcug uugaagcucc auugguuggu 2340
acaccaguuu guauuaacgg gcuuauguug cucgaaauca aagacacaga aaaguacugu 2400
gcccuugcac cuaauaugau gguaacaaac aauaccuuca cacucaaagg cggugcacca 2460
acaaagguua cuuuugguga ugacacugug auagaagugc aagguuacaa gagugugaau 2520
aucacuuuug aacuugauga aaggauugau aaaguacuua augagaagug cucugccuau 2580
acaguugaac ucgguacaga aguaaaugag uucgccugug uuguggcaga ugcugucaua 2640
aaaacuuugc aaccaguauc ugaauuacuu acaccacugg gcauugauuu agaugagugg 2700
aguauggcua cauacuacuu auuugaugag ucuggugagu uuaaauuggc uucacauaug 2760
uauuguucuu ucuacccucc agaugaggau gaagaagaag gugauuguga agaagaagag 2820
uuugagccau caacucaaua ugaguauggu acugaagaug auuaccaagg uaaaccuuug 2880
gaauuuggug ccacuucugc ugcucuucaa ccugaagaag agcaagaaga agauugguua 2940
gaugaugaua gucaacaaac uguuggucaa caagacggca gugaggacaa ucagacaacu 3000
acuauucaaa caauuguuga gguucaaccu caauuagaga uggaacuuac accaguuguu 3060
cagacuauug aagugaauag uuuuaguggu uauuuaaaac uuacugacaa uguauacauu 3120
aaaaaugcag acauugugga agaagcuaaa aagguaaaac caacaguggu uguuaaugca 3180
gccaauguuu accuuaaaca uggaggaggu guugcaggag ccuuaaauaa ggcuacuaac 3240
aaugccaugc aaguugaauc ugaugauuac auagcuacua auggaccacu uaaagugggu 3300
gguaguugug uuuuaagcgg acacaaucuu gcuaaacacu gucuucaugu ugucggccca 3360
aauguuaaca aaggugaaga cauucaacuu cuuaagagug cuuaugaaaa uuuuaaucag 3420
cacgaaguuc uacuugcacc auuauuauca gcugguauuu uuggugcuga cccuauacau 3480
ucuuuaagag uuuguguaga uacuguucgc acaaaugucu acuuagcugu cuuugauaaa 3540
aaucucuaug acaaacuugu uucaagcuuu uuggaaauga agagugaaaa gcaaguugaa 3600
caaaagaucg cugagauucc uaaagaggaa guuaagccau uuauaacuga aaguaaaccu 3660
ucaguugaac agagaaaaca agaugauaag aaaaucaaag cuuguguuga agaaguuaca 3720
acaacucugg aagaaacuaa guuccucaca gaaaacuugu uacuuuauau ugacauuaau 3780
ggcaaucuuc auccagauuc ugccacucuu guuagugaca uugacaucac uuucuuaaag 3840
aaagaugcuc cauauauagu gggugauguu guucaagagg guguuuuaac ugcugugguu 3900
auaccuacua aaaaggcugg uggcacuacu gaaaugcuag cgaaagcuuu gagaaaagug 3960
ccaacagaca auuauauaac cacuuacccg ggucaggguu uaaaugguua cacuguagag 4020
gaggcaaaga cagugcuuaa aaaguguaaa agugccuuuu acauucuacc aucuauuauc 4080
ucuaaugaga agcaagaaau ucuuggaacu guuucuugga auuugcgaga aaugcuugca 4140
caugcagaag aaacacgcaa auuaaugccu gucugugugg aaacuaaagc cauaguuuca 4200
acuauacagc guaaauauaa ggguauuaaa auacaagagg gugugguuga uuauggugcu 4260
agauuuuacu uuuacaccag uaaaacaacu guagcgucac uuaucaacac acuuaacgau 4320
cuaaaugaaa cucuuguuac aaugccacuu ggcuauguaa cacauggcuu aaauuuggaa 4380
gaagcugcuc gguauaugag aucucucaaa gugccagcua caguuucugu uucuucaccu 4440
gaugcuguua cagcguauaa ugguuaucuu acuucuucuu cuaaaacacc ugaagaacau 4500
uuuauugaaa ccaucucacu ugcugguucc uauaaagauu gguccuauuc uggacaaucu 4560
acacaacuag guauagaauu ucuuaagaga ggugauaaaa guguauauua cacuaguaau 4620
ccuaccacau uccaccuaga uggugaaguu aucaccuuug acaaucuuaa gacacuucuu 4680
ucuuugagag aagugaggac uauuaaggug uuuacaacag uagacaacau uaaccuccac 4740
acgcaaguug uggacauguc aaugacauau ggacaacagu uugguccaac uuauuuggau 4800
ggagcugaug uuacuaaaau aaaaccucau aauucacaug aagguaaaac auuuuauguu 4860
uuaccuaaug augacacucu acguguugag gcuuuugagu acuaccacac aacugauccu 4920
aguuuucugg guagguacau gucagcauua aaucacacua aaaaguggaa auacccacaa 4980
guuaaugguu uaacuucuau uaaaugggca gauaacaacu guuaucuugc cacugcauug 5040
uuaacacucc aacaaauaga guugaaguuu aauccaccug cucuacaaga ugcuuauuac 5100
agagcaaggg cuggugaagc ugcuaacuuu ugugcacuua ucuuagccua cuguaauaag 5160
acaguaggug aguuagguga uguuagagaa acaaugaguu acuuguuuca acaugccaau 5220
uuagauucuu gcaaaagagu cuugaacgug guguguaaaa cuuguggaca acagcagaca 5280
acccuuaagg guguagaagc uguuauguac augggcacac uuucuuauga acaauuuaag 5340
aaagguguuc agauaccuug uacguguggu aaacaagcua caaaauaucu aguacaacag 5400
gagucaccuu uuguuaugau gucagcacca ccugcucagu augaacuuaa gcaugguaca 5460
uuuacuugug cuagugagua cacugguaau uaccagugug gucacuauaa acauauaacu 5520
ucuaaagaaa cuuuguauug cauagacggu gcuuuacuua caaaguccuc agaauacaaa 5580
gguccuauua cggauguuuu cuacaaagaa aacaguuaca caacaaccau aaaaccaguu 5640
acuuauaaau uggauggugu uguuuguaca gaaauugacc cuaaguugga caauuauuau 5700
aagaaagaca auucuuauuu cacagagcaa ccaauugauc uuguaccaaa ccaaccauau 5760
ccaaacgcaa gcuucgauaa uuuuaaguuu guaugugaua auaucaaauu ugcugaugau 5820
uuaaaccagu uaacugguua uaagaaaccu gcuucaagag agcuuaaagu uacauuuuuc 5880
ccugacuuaa auggugaugu gguggcuauu gauuauaaac acuacacacc cucuuuuaag 5940
aaaggagcua aauuguuaca uaaaccuauu guuuggcaug uuaacaaugc aacuaauaaa 6000
gccacguaua aaccaaauac cugguguaua cguugucuuu ggagcacaaa accaguugaa 6060
acaucaaauu cguuugaugu acugaaguca gaggacgcgc agggaaugga uaaucuugcc 6120
ugcgaagauc uaaaaccagu cucugaagaa guaguggaaa auccuaccau acagaaagac 6180
guucuugagu guaaugugaa aacuaccgaa guuguaggag acauuauacu uaaaccagca 6240
aauaauaguu uaaaaauuac agaagagguu ggccacacag aucuaauggc ugcuuaugua 6300
gacaauucua gucuuacuau uaagaaaccu aaugaauuau cuagaguauu agguuugaaa 6360
acccuugcua cucaugguuu agcugcuguu aauagugucc cuugggauac uauagcuaau 6420
uaugcuaagc cuuuucuuaa caaaguuguu aguacaacua cuaacauagu uacacggugu 6480
uuaaaccgug uuuguacuaa uuauaugccu uauuucuuua cuuuauugcu acaauugugu 6540
acuuuuacua gaaguacaaa uucuagaauu aaagcaucua ugccgacuac uauagcaaag 6600
aauacuguua agagugucgg uaaauuuugu cuagaggcuu cauuuaauua uuugaaguca 6660
ccuaauuuuu cuaaacugau aaauauuaua auuugguuuu uacuauuaag uguuugccua 6720
gguucuuuaa ucuacucaac cgcugcuuua gguguuuuaa ugucuaauuu aggcaugccu 6780
ucuuacugua cugguuacag agaaggcuau uugaacucua cuaaugucac uauugcaacc 6840
uacuguacug guucuauacc uuguaguguu ugucuuagug guuuagauuc uuuagacacc 6900
uauccuucuu uagaaacuau acaaauuacc auuucaucuu uuaaauggga uuuaacugcu 6960
uuuggcuuag uugcagagug guuuuuggca uauauucuuu ucacuagguu uuucuaugua 7020
cuuggauugg cugcaaucau gcaauuguuu uucagcuauu uugcaguaca uuuuauuagu 7080
aauucuuggc uuaugugguu aauaauuaau cuuguacaaa uggccccgau uucagcuaug 7140
guuagaaugu acaucuucuu ugcaucauuu uauuauguau ggaaaaguua ugugcauguu 7200
guagacgguu guaauucauc aacuuguaug auguguuaca aacguaauag agcaacaaga 7260
gucgaaugua caacuauugu uaaugguguu agaagguccu uuuaugucua ugcuaaugga 7320
gguaaaggcu uuugcaaacu acacaauugg aauuguguua auugugauac auucugugcu 7380
gguaguacau uuauuaguga ugaaguugcg agagacuugu cacuacaguu uaaaagacca 7440
auaaauccua cugaccaguc uucuuacauc guugauagug uuacagugaa gaaugguucc 7500
auccaucuuu acuuugauaa agcuggucaa aagacuuaug aaagacauuc ucucucucau 7560
uuuguuaacu uagacaaccu gagagcuaau aacacuaaag guucauugcc uauuaauguu 7620
auaguuuuug augguaaauc aaaaugugaa gaaucaucug caaaaucagc gucuguuuac 7680
uacagucagc uuauguguca accuauacug uuacuagauc aggcauuagu gucugauguu 7740
ggugauagug cggaaguugc aguuaaaaug uuugaugcuu acguuaauac guuuucauca 7800
acuuuuaacg uaccaaugga aaaacucaaa acacuaguug caacugcaga agcugaacuu 7860
gcaaagaaug uguccuuaga caaugucuua ucuacuuuua uuucagcagc ucggcaaggg 7920
uuuguugauu cagauguaga aacuaaagau guuguugaau gucuuaaauu gucacaucaa 7980
ucugacauag aaguuacugg cgauaguugu aauaacuaua ugcucaccua uaacaaaguu 8040
gaaaacauga caccccguga ccuuggugcu uguauugacu guagugcgcg ucauauuaau 8100
gcgcagguag caaaaaguca caacauugcu uugauaugga acguuaaaga uuucauguca 8160
uugucugaac aacuacgaaa acaaauacgu agugcugcua aaaagaauaa cuuaccuuuu 8220
aaguugacau gugcaacuac uagacaaguu guuaauguug uaacaacaaa gauagcacuu 8280
aaggguggua aaauuguuaa uaauugguug aagcaguuaa uuaaaguuac acuuguguuc 8340
cuuuuuguug cugcuauuuu cuauuuaaua acaccuguuc augucauguc uaaacauacu 8400
gacuuuucaa gugaaaucau aggauacaag gcuauugaug guggugucac ucgugacaua 8460
gcaucuacag auacuuguuu ugcuaacaaa caugcugauu uugacacaug guuuagccag 8520
cgugguggua guuauacuaa ugacaaagcu ugcccauuga uugcugcagu cauaacaaga 8580
gaaguggguu uugucgugcc ugguuugccu ggcacgauau uacgcacaac uaauggugac 8640
uuuuugcauu ucuuaccuag aguuuuuagu gcaguuggua acaucuguua cacaccauca 8700
aaacuuauag aguacacuga cuuugcaaca ucagcuugug uuuuggcugc ugaauguaca 8760
auuuuuaaag augcuucugg uaagccagua ccauauuguu augauaccaa uguacuagaa 8820
gguucuguug cuuaugaaag uuuacgcccu gacacacguu augugcucau ggauggcucu 8880
auuauucaau uuccuaacac cuaccuugaa gguucuguua gagugguaac aacuuuugau 8940
ucugaguacu guaggcacgg cacuugugaa agaucagaag cugguguuug uguaucuacu 9000
agugguagau ggguacuuaa caaugauuau uacagaucuu uaccaggagu uuucuguggu 9060
guagaugcug uaaauuuacu uacuaauaug uuuacaccac uaauucaacc uauuggugcu 9120
uuggacauau cagcaucuau aguagcuggu gguauuguag cuaucguagu aacaugccuu 9180
gccuacuauu uuaugagguu uagaagagcu uuuggugaau acagucaugu aguugccuuu 9240
aauacuuuac uauuccuuau gucauucacu guacucuguu uaacaccagu uuacucauuc 9300
uuaccuggug uuuauucugu uauuuacuug uacuugacau uuuaucuuac uaaugauguu 9360
ucuuuuuuag cacauauuca guggaugguu auguucacac cuuuaguacc uuucuggaua 9420
acaauugcuu auaucauuug uauuuccaca aagcauuucu auugguucuu uaguaauuac 9480
cuaaagagac guguagucuu uaaugguguu uccuuuagua cuuuugaaga agcugcgcug 9540
ugcaccuuuu uguuaaauaa agaaauguau cuaaaguugc guagugaugu gcuauuaccu 9600
cuuacgcaau auaauagaua cuuagcucuu uauaauaagu acaaguauuu uaguggagca 9660
auggauacaa cuagcuacag agaagcugcu uguugucauc ucgcaaaggc ucucaaugac 9720
uucaguaacu cagguucuga uguucuuuac caaccaccac aaaccucuau caccucagcu 9780
guuuugcaga gugguuuuag aaaaauggca uucccaucug guaaaguuga ggguuguaug 9840
guacaaguaa cuugugguac aacuacacuu aacggucuuu ggcuugauga cguaguuuac 9900
uguccaagac augugaucug caccucugaa gacaugcuua acccuaauua ugaagauuua 9960
cucauucgua agucuaauca uaauuucuug guacaggcug guaauguuca acucaggguu 10020
auuggacauu cuaugcaaaa uuguguacuu aagcuuaagg uugauacagc caauccuaag 10080
acaccuaagu auaaguuugu ucgcauucaa ccaggacaga cuuuuucagu guuagcuugu 10140
uacaaugguu caccaucugg uguuuaccaa ugugcuauga ggcccaauuu cacuauuaag 10200
gguucauucc uuaaugguuc augugguagu guugguuuua acauagauua ugacuguguc 10260
ucuuuuuguu acaugcacca uauggaauua ccaacuggag uucaugcugg cacagacuua 10320
gaagguaacu uuuauggacc uuuuguugac aggcaaacag cacaagcagc ugguacggac 10380
acaacuauua caguuaaugu uuuagcuugg uuguacgcug cuguuauaaa uggagacagg 10440
ugguuucuca aucgauuuac cacaacucuu aaugacuuua accuuguggc uaugaaguac 10500
aauuaugaac cucuaacaca agaccauguu gacauacuag gaccucuuuc ugcucaaacu 10560
ggaauugccg uuuuagauau gugugcuuca uuaaaagaau uacugcaaaa ugguaugaau 10620
ggacguacca uauuggguag ugcuuuauua gaagaugaau uuacaccuuu ugauguuguu 10680
agacaaugcu cagguguuac uuuccaaagu gcagugaaaa gaacaaucaa ggguacacac 10740
cacugguugu uacucacaau uuugacuuca cuuuuaguuu uaguccagag uacucaaugg 10800
ucuuuguucu uuuuuuugua ugaaaaugcc uuuuuaccuu uugcuauggg uauuauugcu 10860
augucugcuu uugcaaugau guuugucaaa cauaagcaug cauuucucug uuuguuuuug 10920
uuaccuucuc uugccacugu agcuuauuuu aauauggucu auaugccugc uaguugggug 10980
augcguauua ugacaugguu ggauaugguu gauacuaguu ugucugguuu uaagcuaaaa 11040
gacuguguua uguaugcauc agcuguagug uuacuaaucc uuaugacagc aagaacugug 11100
uaugaugaug gugcuaggag aguguggaca cuuaugaaug ucuugacacu cguuuauaaa 11160
guuuauuaug guaaugcuuu agaucaagcc auuuccaugu gggcucuuau aaucucuguu 11220
acuucuaacu acucaggugu aguuacaacu gucauguuuu uggccagagg uauuguuuuu 11280
auguguguug aguauugccc uauuuucuuc auaacuggua auacacuuca guguauaaug 11340
cuaguuuauu guuucuuagg cuauuuuugu acuuguuacu uuggccucuu uuguuuacuc 11400
aaccgcuacu uuagacugac ucuugguguu uaugauuacu uaguuucuac acaggaguuu 11460
agauauauga auucacaggg acuacuccca cccaagaaua gcauagaugc cuucaaacuc 11520
aacauuaaau uguugggugu ugguggcaaa ccuuguauca aaguagccac uguacagucu 11580
aaaaugucag auguaaagug cacaucagua gucuuacucu caguuuugca acaacucaga 11640
guagaaucau caucuaaauu gugggcucaa uguguccagu uacacaauga cauucucuua 11700
gcuaaagaua cuacugaagc cuuugaaaaa augguuucac uacuuucugu uuugcuuucc 11760
augcagggug cuguagacau aaacaagcuu ugugaagaaa ugcuggacaa cagggcaacc 11820
uuacaagcua uagccucaga guuuaguucc cuuccaucau augcagcuuu ugcuacugcu 11880
caagaagcuu augagcaggc uguugcuaau ggugauucug aaguuguucu uaaaaaguug 11940
aagaagucuu ugaauguggc uaaaucugaa uuugaccgug augcagccau gcaacguaag 12000
uuggaaaaga uggcugauca agcuaugacc caaauguaua aacaggcuag aucugaggac 12060
aagagggcaa aaguuacuag ugcuaugcag acaaugcuuu ucacuaugcu uagaaaguug 12120
gauaaugaug cacucaacaa cauuaucaac aaugcaagag augguugugu ucccuugaac 12180
auaauaccuc uuacaacagc agccaaacua augguuguca uaccagacua uaacacauau 12240
aaaaauacgu gugaugguac aacauuuacu uaugcaucag cauuguggga aauccaacag 12300
guuguagaug cagauaguaa aauuguucaa cuuagugaaa uuaguaugga caauucaccu 12360
aauuuagcau ggccucuuau uguaacagcu uuaagggcca auucugcugu caaauuacag 12420
aauaaugagc uuaguccugu ugcacuacga cagaugucuu gugcugccgg uacuacacaa 12480
acugcuugca cugaugacaa ugcguuagcu uacuacaaca caacaaaggg agguagguuu 12540
guacuugcac uguuauccga uuuacaggau uugaaauggg cuagauuccc uaagagugau 12600
ggaacuggua cuaucuauac agaacuggaa ccaccuugua gguuuguuac agacacaccu 12660
aaagguccua aagugaagua uuuauacuuu auuaaaggau uaaacaaccu aaauagaggu 12720
augguacuug guaguuuagc ugccacagua cgucuacaag cugguaaugc aacagaagug 12780
ccugccaauu caacuguauu aucuuucugu gcuuuugcug uagaugcugc uaaagcuuac 12840
aaagauuauc uagcuagugg gggacaacca aucacuaauu guguuaagau guuguguaca 12900
cacacuggua cuggucaggc aauaacaguu acaccggaag ccaauaugga ucaagaaucc 12960
uuugguggug caucguguug ucuguacugc cguugccaca uagaucaucc aaauccuaaa 13020
ggauuuugug acuuaaaagg uaaguaugua caaauaccua caacuugugc uaaugacccu 13080
guggguuuua cacuuaaaaa cacagucugu accgucugcg guauguggaa agguuauggc 13140
uguaguugug aucaacuccg cgaacccaug cuucagucag cugaugcaca aucguuuuua 13200
aaccggguuu gcgguguaag ugcagcccgu cuuacaccgu gcggcacagg cacuaguacu 13260
gaugucguau acagggcuuu ugacaucuac aaugauaaag uagcugguuu ugcuaaauuc 13320
cuaaaaacua auuguugucg cuuccaagaa aaggacgaag augacaauuu aauugauucu 13380
uacuuuguag uuaagagaca cacuuucucu aacuaccaac augaagaaac aauuuauaau 13440
uuacuuaagg auuguccagc uguugcuaaa caugacuucu uuaaguuuag aauagacggu 13500
gacaugguac cacauauauc acgucaacgu cuuacuaaau acacaauggc agaccucguc 13560
uaugcuuuaa ggcauuuuga ugaagguaau ugugacacau uaaaagaaau acuugucaca 13620
uacaauuguu gugaugauga uuauuucaau aaaaaggacu gguaugauuu uguagaaaac 13680
ccagauauau uacgcguaua cgccaacuua ggugaacgug uacgccaagc uuuguuaaaa 13740
acaguacaau ucugugaugc caugcgaaau gcugguauug uugguguacu gacauuagau 13800
aaucaagauc ucaaugguaa cugguaugau uucggugauu ucauacaaac cacgccaggu 13860
aguggaguuc cuguuguaga uucuuauuau ucauuguuaa ugccuauauu aaccuugacc 13920
agggcuuuaa cugcagaguc acauguugac acugacuuaa caaagccuua cauuaagugg 13980
gauuuguuaa aauaugacuu cacggaagag agguuaaaac ucuuugaccg uuauuuuaaa 14040
uauugggauc agacauacca cccaaauugu guuaacuguu uggaugacag augcauucug 14100
cauugugcaa acuuuaaugu uuuauucucu acaguguucc caccuacaag uuuuggacca 14160
cuagugagaa aaauauuugu ugaugguguu ccauuuguag uuucaacugg auaccacuuc 14220
agagagcuag guguuguaca uaaucaggau guaaacuuac auagcucuag acuuaguuuu 14280
aaggaauuac uuguguaugc ugcugacccu gcuaugcacg cugcuucugg uaaucuauua 14340
cuagauaaac gcacuacgug cuuuucagua gcugcacuua cuaacaaugu ugcuuuucaa 14400
acugucaaac ccgguaauuu uaacaaagac uucuaugacu uugcuguguc uaaggguuuc 14460
uuuaaggaag gaaguucugu ugaauuaaaa cacuucuucu uugcucagga ugguaaugcu 14520
gcuaucagcg auuaugacua cuaucguuau aaucuaccaa caauguguga uaucagacaa 14580
cuacuauuug uaguugaagu uguugauaag uacuuugauu guuacgaugg uggcuguauu 14640
aaugcuaacc aagucaucgu caacaaccua gacaaaucag cugguuuucc auuuaauaaa 14700
ugggguaagg cuagacuuua uuaugauuca augaguuaug aggaucaaga ugcacuuuuc 14760
gcauauacaa aacguaaugu caucccuacu auaacucaaa ugaaucuuaa guaugccauu 14820
agugcaaaga auagagcucg caccguagcu ggugucucua ucuguaguac uaugaccaau 14880
agacaguuuc aucaaaaauu auugaaauca auagccgcca cuagaggagc uacuguagua 14940
auuggaacaa gcaaauucua uggugguugg cacaacaugu uaaaaacugu uuauagugau 15000
guagaaaacc cucaccuuau ggguugggau uauccuaaau gugauagagc caugccuaac 15060
augcuuagaa uuauggccuc acuuguucuu gcucgcaaac auacaacgug uuguagcuug 15120
ucacaccguu ucuauagauu agcuaaugag ugugcucaag uauugaguga aauggucaug 15180
uguggcgguu cacuauaugu uaaaccaggu ggaaccucau caggagaugc cacaacugcu 15240
uaugcuaaua guguuuuuaa cauuugucaa gcugucacgg ccaauguuaa ugcacuuuua 15300
ucuacugaug guaacaaaau ugccgauaag uauguccgca auuuacaaca cagacuuuau 15360
gagugucucu auagaaauag agauguugac acagacuuug ugaaugaguu uuacgcauau 15420
uugcguaaac auuucucaau gaugauacuc ucugacgaug cuguugugug uuucaauagc 15480
acuuaugcau cucaaggucu aguggcuagc auaaagaacu uuaagucagu ucuuuauuau 15540
caaaacaaug uuuuuauguc ugaagcaaaa uguuggacug agacugaccu uacuaaagga 15600
ccucaugaau uuugcucuca acauacaaug cuaguuaaac agggugauga uuauguguac 15660
cuuccuuacc cagauccauc aagaauccua ggggccggcu guuuuguaga ugauaucgua 15720
aaaacagaug guacacuuau gauugaacgg uucgugucuu uagcuauaga ugcuuaccca 15780
cuuacuaaac auccuaauca ggaguaugcu gaugucuuuc auuuguacuu acaauacaua 15840
agaaagcuac augaugaguu aacaggacac auguuagaca uguauucugu uaugcuuacu 15900
aaugauaaca cuucaaggua uugggaaccu gaguuuuaug aggcuaugua cacaccgcau 15960
acagucuuac aggcuguugg ggcuuguguu cuuugcaauu cacagacuuc auuaagaugu 16020
ggugcuugca uacguagacc auucuuaugu uguaaaugcu guuacgacca ugucauauca 16080
acaucacaua aauuagucuu gucuguuaau ccguauguuu gcaaugcucc agguugugau 16140
gucacagaug ugacucaacu uuacuuagga gguaugagcu auuauuguaa aucacauaaa 16200
ccacccauua guuuuccauu gugugcuaau ggacaaguuu uugguuuaua uaaaaauaca 16260
uguguuggua gcgauaaugu uacugacuuu aaugcaauug caacauguga cuggacaaau 16320
gcuggugauu acauuuuagc uaacaccugu acugaaagac ucaagcuuuu ugcagcagaa 16380
acgcucaaag cuacugagga gacauuuaaa cugucuuaug guauugcuac uguacgugaa 16440
gugcugucug acagagaauu acaucuuuca ugggaaguug guaaaccuag accaccacuu 16500
aaccgaaauu augucuuuac ugguuaucgu guaacuaaaa acaguaaagu acaaauagga 16560
gaguacaccu uugaaaaagg ugacuauggu gaugcuguug uuuaccgagg uacaacaacu 16620
uacaaauuaa auguugguga uuauuuugug cugacaucac auacaguaau gccauuaagu 16680
gcaccuacac uagugccaca agagcacuau guuagaauua cuggcuuaua cccaacacuc 16740
aauaucucag augaguuuuc uagcaauguu gcaaauuauc aaaagguugg uaugcaaaag 16800
uauucuacac uccagggacc accugguacu gguaagaguc auuuugcuau uggccuagcu 16860
cucuacuacc cuucugcucg cauaguguau acagcuugcu cucaugccgc uguugaugca 16920
cuaugugaga aggcauuaaa auauuugccu auagauaaau guaguagaau uauaccugca 16980
cgugcucgug uagaguguuu ugauaaauuc aaagugaauu caacauuaga acaguauguc 17040
uuuuguacug uaaaugcauu gccugagacg acagcagaua uaguugucuu ugaugaaauu 17100
ucaauggcca caaauuauga uuugaguguu gucaaugcca gauuacgugc uaagcacuau 17160
guguacauug gcgacccugc ucaauuaccu gcaccacgca cauugcuaac uaagggcaca 17220
cuagaaccag aauauuucaa uucagugugu agacuuauga aaacuauagg uccagacaug 17280
uuccucggaa cuugucggcg uuguccugcu gaaauuguug acacugugag ugcuuugguu 17340
uaugauaaua agcuuaaagc acauaaagac aaaucagcuc aaugcuuuaa aauguuuuau 17400
aaggguguua ucacgcauga uguuucaucu gcaauuaaca ggccacaaau aggcguggua 17460
agagaauucc uuacacguaa cccugcuugg agaaaagcug ucuuuauuuc accuuauaau 17520
ucacagaaug cuguagccuc aaagauuuug ggacuaccaa cucaaacugu ugauucauca 17580
cagggcucag aauaugacua ugucauauuc acucaaacca cugaaacagc ucacucuugu 17640
aauguaaaca gauuuaaugu ugcuauuacc agagcaaaag uaggcauacu uugcauaaug 17700
ucugauagag accuuuauga caaguugcaa uuuacaaguc uugaaauucc acguaggaau 17760
guggcaacuu uacaagcuga aaauguaaca ggacucuuua aagauuguag uaagguaauc 17820
acuggguuac auccuacaca ggcaccuaca caccucagug uugacacuaa auucaaaacu 17880
gaagguuuau guguugacau accuggcaua ccuaaggaca ugaccuauag aagacucauc 17940
ucuaugaugg guuuuaaaau gaauuaucaa guuaaugguu acccuaacau guuuaucacc 18000
cgcgaagaag cuauaagaca uguacgugca uggauuggcu ucgaugucga ggggugucau 18060
gcuacuagag aagcuguugg uaccaauuua ccuuuacagc uagguuuuuc uacagguguu 18120
aaccuaguug cuguaccuac agguuauguu gauacaccua auaauacaga uuuuuccaga 18180
guuagugcua aaccaccgcc uggagaucaa uuuaaacacc ucauaccacu uauguacaaa 18240
ggacuuccuu ggaauguagu gcguauaaag auuguacaaa uguuaaguga cacacuuaaa 18300
aaucucucug acagagucgu auuugucuua ugggcacaug gcuuugaguu gacaucuaug 18360
aaguauuuug ugaaaauagg accugagcgc accuguuguc uaugugauag acgugccaca 18420
ugcuuuucca cugcuucaga cacuuaugcc uguuggcauc auucuauugg auuugauuac 18480
gucuauaauc cguuuaugau ugauguucaa caaugggguu uuacagguaa ccuacaaagc 18540
aaccaugauc uguauuguca aguccauggu aaugcacaug uagcuaguug ugaugcaauc 18600
augacuaggu gucuagcugu ccacgagugc uuuguuaagc guguugacug gacuauugaa 18660
uauccuauaa uuggugauga acugaagauu aaugcggcuu guagaaaggu ucaacacaug 18720
guuguuaaag cugcauuauu agcagacaaa uucccaguuc uucacgacau ugguaacccu 18780
aaagcuauua aguguguacc ucaagcugau guagaaugga aguucuauga ugcacagccu 18840
uguagugaca aagcuuauaa aauagaagaa uuauucuauu cuuaugccac acauucugac 18900
aaauucacag augguguaug ccuauuuugg aauugcaaug ucgauagaua uccugcuaau 18960
uccauuguuu guagauuuga cacuagagug cuaucuaacc uuaacuugcc ugguugugau 19020
gguggcaguu uguauguaaa uaaacaugca uuccacacac cagcuuuuga uaaaagugcu 19080
uuuguuaauu uaaaacaauu accauuuuuc uauuacucug acaguccaug ugagucucau 19140
ggaaaacaag uagugucaga uauagauuau guaccacuaa agucugcuac guguauaaca 19200
cguugcaauu uagguggugc ugucuguaga caucaugcua augaguacag auuguaucuc 19260
gaugcuuaua acaugaugau cucagcuggc uuuagcuugu ggguuuacaa acaauuugau 19320
acuuauaacc ucuggaacac uuuuacaaga cuucagaguu uagaaaaugu ggcuuuuaau 19380
guuguaaaua agggacacuu ugauggacaa cagggugaag uaccaguuuc uaucauuaau 19440
aacacuguuu acacaaaagu ugaugguguu gauguagaau uguuugaaaa uaaaacaaca 19500
uuaccuguua auguagcauu ugagcuuugg gcuaagcgca acauuaaacc aguaccagag 19560
gugaaaauac ucaauaauuu ggguguggac auugcugcua auacugugau cugggacuac 19620
aaaagagaug cuccagcaca uauaucuacu auugguguuu guucuaugac ugacauagcc 19680
aagaaaccaa cugaaacgau uugugcacca cucacugucu uuuuugaugg uagaguugau 19740
ggucaaguag acuuauuuag aaaugcccgu aaugguguuc uuauuacaga agguaguguu 19800
aaagguuuac aaccaucugu aggucccaaa caagcuaguc uuaauggagu cacauuaauu 19860
ggagaagccg uaaaaacaca guucaauuau uauaagaaag uugauggugu uguccaacaa 19920
uuaccugaaa cuuacuuuac ucagaguaga aauuuacaag aauuuaaacc caggagucaa 19980
auggaaauug auuucuuaga auuagcuaug gaugaauuca uugaacggua uaaauuagaa 20040
ggcuaugccu ucgaacauau cguuuaugga gauuuuaguc auagucaguu aggugguuua 20100
caucuacuga uuggacuagc uaaacguuuu aaggaaucac cuuuugaauu agaagauuuu 20160
auuccuaugg acaguacagu uaaaaacuau uucauaacag augcgcaaac agguucaucu 20220
aagugugugu guucuguuau ugauuuauua cuugaugauu uuguugaaau aauaaaaucc 20280
caagauuuau cuguaguuuc uaagguuguc aaagugacua uugacuauac agaaauuuca 20340
uuuaugcuuu gguguaaaga uggccaugua gaaacauuuu acccaaaauu acaaucuagu 20400
caagcguggc aaccgggugu ugcuaugccu aaucuuuaca aaaugcaaag aaugcuauua 20460
gaaaagugug accuucaaaa uuauggugau agugcaacau uaccuaaagg cauaaugaug 20520
aaugucgcaa aauauacuca acugugucaa uauuuaaaca cauuaacauu agcuguaccc 20580
uauaauauga gaguuauaca uuuuggugcu gguucugaua aaggaguugc accagguaca 20640
gcuguuuuaa gacagugguu gccuacgggu acgcugcuug ucgauucaga ucuuaaugac 20700
uuugucucug augcagauuc aacuuugauu ggugauugug caacuguaca uacagcuaau 20760
aaaugggauc ucauuauuag ugauauguac gacccuaaga cuaaaaaugu uacaaaagaa 20820
aaugacucua aagaggguuu uuucacuuac auuugugggu uuauacaaca aaagcuagcu 20880
cuuggagguu ccguggcuau aaagauaaca gaacauucuu ggaaugcuga ucuuuauaag 20940
cucaugggac acuucgcaug guggacagcc uuuguuacua augugaaugc gucaucaucu 21000
gaagcauuuu uaauuggaug uaauuaucuu ggcaaaccac gcgaacaaau agaugguuau 21060
gucaugcaug caaauuacau auuuuggagg aauacaaauc caauucaguu gucuuccuau 21120
ucuuuauuug acaugaguaa auuuccccuu aaauuaaggg guacugcugu uaugucuuua 21180
aaagaagguc aaaucaauga uaugauuuua ucucuucuua guaaagguag acuuauaauu 21240
agagaaaaca acagaguugu uauuucuagu gauguucuug uuaacaacua a 21291
<210> 11
<211> 1260
<212> RNA
<213> Betacoronavirus severe acute respiratory syndrome-relatedcoronavirus
<400> 11
augucugaua auggacccca aaaucagcga aaugcacccc gcauuacguu ugguggaccc 60
ucagauucaa cuggcaguaa ccagaaugga gaacgcagug gggcgcgauc aaaacaacgu 120
cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180
aaggaagacc uuaaauuccc ucgaggacaa ggcguuccaa uuaacaccaa uagcagucca 240
gaugaccaaa uuggcuacua ccgaagagcu accagacgaa uucguggugg ugacgguaaa 300
augaaagauc ucaguccaag augguauuuc uacuaccuag gaacugggcc agaagcugga 360
cuucccuaug gugcuaacaa agacggcauc auauggguug caacugaggg agccuugaau 420
acaccaaaag aucacauugg cacccgcaau ccugcuaaca augcugcaau cgugcuacaa 480
cuuccucaag gaacaacauu gccaaaaggc uucuacgcag aagggagcag aggcggcagu 540
caagccucuu cucguuccuc aucacguagu cgcaacaguu caagaaauuc aacuccaggc 600
agcaguaggg gaacuucucc ugcuagaaug gcuggcaaug gcggugaugc ugcucuugcu 660
uugcugcugc uugacagauu gaaccagcuu gagagcaaaa ugucugguaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaacugucac uaagaaaucu gcugcugagg cuucuaagaa gccucggcaa 780
aaacguacug ccacuaaagc auacaaugua acacaagcuu ucggcagacg ugguccagaa 840
caaacccaag gaaauuuugg ggaccaggaa cuaaucagac aaggaacuga uuacaaacau 900
uggccgcaaa uugcacaauu ugcccccagc gcuucagcgu ucuucggaau gucgcgcauu 960
ggcauggaag ucacaccuuc gggaacgugg uugaccuaca caggugccau caaauuggau 1020
gacaaagauc caaauuucaa agaucaaguc auuuugcuga auaagcauau ugacgcauac 1080
aaaacauucc caccaacaga gccuaaaaag gacaaaaaga agaaggcuga ugaaacucaa 1140
gccuuaccgc agagacagaa gaaacagcaa acugugacuc uucuuccugc ugcagauuug 1200
gaugauuucu ccaaacaauu gcaacaaucc augagcagug cugacucaac ucaggccuaa 1260
<210> 12
<211> 81
<212> RNA
<213> Beta冠状病毒严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒
<400> 12
ggauacaacu agcuacagag aagcugcuug uugucaucuc gcaaaggcuc ucaaugacuu 60
caguaacuca gguucugaug u 81
Claims (25)
1.一种用于检测样品中是否存在严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的方法，所述方法包括：
使所述样品与初级寡核苷酸引物组接触，其中所述初级寡核苷酸引物组包含：
(i)第一寡核苷酸引物，其包含与ORF1a的SARS-CoV-2跨膜结构域2基因的第一部分互补的核苷酸序列，和
(ii)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述初级寡核苷酸引物组的第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列，
在适合于产生跨膜结构域2基因扩增产物的条件下使经接触的样品经受扩增反应；和
基于所述经受，检测样品中是否存在SARS-CoV-2。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初级引物组的至少一个寡核苷酸引物包含可检测的标签，并且所述检测包含检测标记的跨膜结构域2基因扩增产物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述初级寡核苷酸引物组还包含寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包含报告部分和与跨膜结构域2基因扩增产物互补的核苷酸序列，其中所述探针在所述经受期间与跨膜结构域2基因扩增产物的其互补核苷酸序列杂交，并且所述检测包括在所述经受期间检测所述初级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的报告部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述接触还包含：
使所述样品与二级寡核苷酸引物组接触，其中所述二级寡核苷酸引物组包含：
(i)第一寡核苷酸引物，其包含与SARS-CoV-2N基因的第一部分互补的核苷酸序列，和
(ii)第二寡核苷酸引物，其包含与由所述二级寡核苷酸引物组的第一寡核苷酸引物形成的延伸产物互补的核苷酸序列，其中在所述经受期间产生N基因和跨膜结构域2基因扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述二级寡核苷酸引物组还包含寡核苷酸探针，其中所述二级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针包含报告部分和与N基因扩增产物互补的核苷酸序列，其中所述探针在所述经受期间与N基因扩增产物的其互补核苷酸序列杂交，并且所述检测包含在所述经受期间检测所述初级寡核苷酸引物组和二级寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的一个或两个报告部分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸引物组和第二寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的报告部分是相同的报告部分。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸引物组和第二寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的报告部分是不同的报告部分。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中，所述第一寡核苷酸引物组和第二寡核苷酸引物组的寡核苷酸探针的报告部分包含荧光分子。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述经受还包括：
在所述扩增反应之前使所述样品经受逆转录反应。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述初级引物组的第一寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，并且所述初级引物组的第二寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中，所述二级引物组的第一寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，并且所述二级引物组的第二寡核苷酸引物包含与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
12.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中，所述初级引物组的寡核苷酸探针包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
13.根据权利要求5至12中任一项所述的方法，其中，所述二级引物组的寡核苷酸探针包含与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述扩增反应是是实时逆转录聚合酶链式反应。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述样品选自鼻咽样品、口咽样品和唾液样品。
16.一种适用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含与从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6中选择的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
17.一种用于检测SARS-CoV-2跨膜结构域2基因的寡核苷酸引物组，其中，所述寡核苷酸引物组包含：
第一寡核苷酸引物，其包含与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和
第二寡核苷酸引物，其包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
18.根据权利要求17所述的寡核苷酸引物组，还包含：
包含与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的寡核苷酸探针。
19.根据权利要求18所述的寡核苷酸引物组，其中，所述寡核苷酸探针包含报告部分和至少一种猝灭剂分子。
20.一种用于检测SARS-CoV-2N基因的寡核苷酸引物组，其中，所述寡核苷酸引物组包含：
第一寡核苷酸引物，其包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和
第二寡核苷酸引物，其包含与SEQ ID NO:5的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的寡核苷酸引物组，还包含：
寡核苷酸探针，其包含与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
22.根据权利要求20所述的寡核苷酸引物组，其中，所述寡核苷酸探针包含报告部分和至少一个猝灭剂分子。
23.一种用于检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的试剂盒，所述试剂盒包含：权利要求16所述的分离的寡核苷酸、权利要求17至22中任一项所述的寡核苷酸引物组、或它们的任何组合。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，还包含：
用于进行逆转录聚合酶链式反应的一种或多种试剂。
25.根据权利要求23所述的试剂盒，还包含：
用于进行实时聚合酶链式反应的一种或多种试剂。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063005781P | 2020-04-06 | 2020-04-06 | |
| US63/005,781 | 2020-04-06 | ||
| US202062705208P | 2020-06-16 | 2020-06-16 | |
| US62/705,208 | 2020-06-16 | ||
| PCT/EP2021/058556 WO2021204642A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-04-01 | Pcr based diagnostic kit, compositions and methods for amplification and detection of sars-cov-2 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116134157A true CN116134157A (zh) | 2023-05-16 |
Family
ID=75478012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180024430.5A Pending CN116134157A (zh) | 2020-04-06 | 2021-04-01 | 用于扩增和检测sars-cov-2的基于pcr的诊断试剂盒、组合物和方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230151444A1 (zh) |
| EP (1) | EP4133113A1 (zh) |
| CN (1) | CN116134157A (zh) |
| WO (1) | WO2021204642A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210324486A1 (en) * | 2020-04-20 | 2021-10-21 | Thomas Jefferson University | Method and Primers for the Sensitive and Specific Detection of SARS-CoV-2 |
| CN114350849A (zh) * | 2021-12-21 | 2022-04-15 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 检测SARS-CoV-2的组合物、试剂盒、方法及其用途 |
| CN114085928B (zh) * | 2022-01-19 | 2022-04-26 | 广东和信健康科技有限公司 | 一种用于新型冠状病毒Omicron突变株分型的快速检测体系 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4739044A (en) | 1985-06-13 | 1988-04-19 | Amgen | Method for derivitization of polynucleotides |
| US5219727A (en) | 1989-08-21 | 1993-06-15 | Hoffmann-Laroche Inc. | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
| AU645915B2 (en) | 1991-07-23 | 1994-01-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improvements in the in situ PCR |
| US5639606A (en) | 1993-04-06 | 1997-06-17 | The University Of Rochester | Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction |
| US5556773A (en) | 1993-08-06 | 1996-09-17 | Yourno; Joseph | Method and apparatus for nested polymerase chain reaction (PCR) with single closed reaction tubes |
| US5945283A (en) | 1995-12-18 | 1999-08-31 | Washington University | Methods and kits for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer |
-
2021
- 2021-04-01 CN CN202180024430.5A patent/CN116134157A/zh active Pending
- 2021-04-01 EP EP21718049.6A patent/EP4133113A1/en active Pending
- 2021-04-01 WO PCT/EP2021/058556 patent/WO2021204642A1/en active Application Filing
- 2021-04-01 US US17/995,543 patent/US20230151444A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021204642A1 (en) | 2021-10-14 |
| EP4133113A1 (en) | 2023-02-15 |
| US20230151444A1 (en) | 2023-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA3174243A1 (en) | Assays for the detection of sars-cov-2 | |
| EP3990667B1 (en) | Methods for the specific and sensitive detection of sars-cov-2 | |
| US11149320B1 (en) | Assays for the detection of SARS-CoV-2 | |
| US20230151444A1 (en) | Pcr based diagnostic kit, compositions and methods for amplification and detection of sars-cov-2 | |
| CN108330210B (zh) | 寨卡病毒、登革热病毒和基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒及其用途 | |
| CN111041129A (zh) | 检测6项呼吸道病毒的引物探针组合、试剂盒及应用 | |
| US20210340636A1 (en) | Assays for the Detection of SARS-CoV-2 | |
| WO2012060779A1 (en) | Method for detection of enterovirus ev71 | |
| JP2006524052A (ja) | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する試薬および方法 | |
| JP5754100B2 (ja) | エンテロウイルス７１ｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| KR102297191B1 (ko) | RdRp 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트 | |
| EP1911853A2 (en) | Nucleic acid sequences that can be used as primers and probes in the amplification and detection of SARS coronavirus | |
| KR102435209B1 (ko) | 인플루엔자 a형 및 b형 바이러스와 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스를 구별하여 동시에 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| US20050244813A1 (en) | Detection of human papillomavirus e6 mrna | |
| TWI723675B (zh) | 用於檢測登革熱病毒的方法以及套組 | |
| WO2001079546A2 (en) | Flavivirus detection and quantification assay | |
| US6793488B1 (en) | Flavivirus detection and quantification assay | |
| AU2006343645B2 (en) | Methods and agents for detecting Parechovirus | |
| US20220243290A1 (en) | Molecular detection of novel coronaviruses | |
| KR102281380B1 (ko) | S 유전자에 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2 검출용 프라이머 및 이를 포함하는 키트 | |
| EP4043588A1 (en) | Assays for the detection of sars-cov-2 mutants | |
| US20120122081A1 (en) | Differentiating picorna viruses, nucleic acids therefor, use thereof and bioassay methods employing them | |
| WO2021116735A1 (en) | Methods and kits for detecting dengue virus | |
| AU2012201607B2 (en) | Methods and agents for detecting Parechovirus | |
| JP2003093057A (ja) | ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |