JP2003093057A - ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 - Google Patents
ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型
の迅速かつ簡易な同定法を提供する。 【解決手段】 ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基
配列に基づいて遺伝子系統解析を行い、ヒトライノウイ
ルスの血清型または遺伝子型を同定する。特に、試料か
らＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを
得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域を
含むウイルス遺伝子を増幅し、前記ＶＰ４領域の塩基配
列を得ることによって、試料中のヒトライノウイルスの
血清型または遺伝子型を迅速かつ簡易に同定することが
できる。
の迅速かつ簡易な同定法を提供する。 【解決手段】 ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基
配列に基づいて遺伝子系統解析を行い、ヒトライノウイ
ルスの血清型または遺伝子型を同定する。特に、試料か
らＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを
得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域を
含むウイルス遺伝子を増幅し、前記ＶＰ４領域の塩基配
列を得ることによって、試料中のヒトライノウイルスの
血清型または遺伝子型を迅速かつ簡易に同定することが
できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトライノウイル
スの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法に関
する。
スの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトライノウイルスは、ピコルナウイル
ス科（family picornaviridae）ライノウイルス属（gen
us rhinovirus）に含まれるプラス一本鎖RNAをゲノムに
持つ小型ウイルスであり、鼻を意味するギリシャ語rhin
にその名が由来するように、鼻かぜ、いわゆる感冒の原
因ウイルスである。至適増殖温度が33℃と低いため、ヒ
トライノウイルスによる炎症は上気道に起こることが多
い。細菌等による二次感染が起こった場合、気管支炎、
副鼻腔炎、中耳炎などを引き起こすこともある。ヒトラ
イノウイルスによる感冒は、集中的に流行するインフル
エンザウイルス等によるものと異なり通年みられるが、
春と秋に多いとされている。１つの地域に複数の血清型
のヒトライノウイルスが存在すること、及び、感染した
血清型のヒトライノウイルスに対する免疫を獲得しても
血清型が１００以上も存在するために、他の血清型のヒ
トライノウイルスに感染することから、ライノウイルス
感染の早期診断には迅速なウイルスの検出と同定が必須
である。
ス科（family picornaviridae）ライノウイルス属（gen
us rhinovirus）に含まれるプラス一本鎖RNAをゲノムに
持つ小型ウイルスであり、鼻を意味するギリシャ語rhin
にその名が由来するように、鼻かぜ、いわゆる感冒の原
因ウイルスである。至適増殖温度が33℃と低いため、ヒ
トライノウイルスによる炎症は上気道に起こることが多
い。細菌等による二次感染が起こった場合、気管支炎、
副鼻腔炎、中耳炎などを引き起こすこともある。ヒトラ
イノウイルスによる感冒は、集中的に流行するインフル
エンザウイルス等によるものと異なり通年みられるが、
春と秋に多いとされている。１つの地域に複数の血清型
のヒトライノウイルスが存在すること、及び、感染した
血清型のヒトライノウイルスに対する免疫を獲得しても
血清型が１００以上も存在するために、他の血清型のヒ
トライノウイルスに感染することから、ライノウイルス
感染の早期診断には迅速なウイルスの検出と同定が必須
である。
【０００３】ヒトライノウイルスは、培養細胞での増殖
が遅くウイルス分離が困難なこと、及び、血清型が１０
０以上も存在するため、型特異的抗血清を用いた型同定
が困難かつ煩雑なことから、ライノウイルスの流行の実
態はいまだ明らかでない。ライノウイルスは他の多くの
RNAウイルスと同様、ウイルスの遺伝子自体がコードす
るRNA依存性RNAポリメラーゼによって複製される。しか
しながら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たな
いために、RNA合成の過程で生じた塩基変異が子孫ウイ
ルスの遺伝子に蓄積され易い。従って、アミノ酸変異を
伴う塩基変異がウイルス構造蛋白質コード領域に生じた
場合、いわゆる難中和性ウイルスが生じる可能性があ
る。これは、表現型（phenotype）を指標にした中和試
験に固有の問題である。
が遅くウイルス分離が困難なこと、及び、血清型が１０
０以上も存在するため、型特異的抗血清を用いた型同定
が困難かつ煩雑なことから、ライノウイルスの流行の実
態はいまだ明らかでない。ライノウイルスは他の多くの
RNAウイルスと同様、ウイルスの遺伝子自体がコードす
るRNA依存性RNAポリメラーゼによって複製される。しか
しながら、この酵素は校正(proofreading)機能を持たな
いために、RNA合成の過程で生じた塩基変異が子孫ウイ
ルスの遺伝子に蓄積され易い。従って、アミノ酸変異を
伴う塩基変異がウイルス構造蛋白質コード領域に生じた
場合、いわゆる難中和性ウイルスが生じる可能性があ
る。これは、表現型（phenotype）を指標にした中和試
験に固有の問題である。
【０００４】分子系統分析を行うことによりウイルスの
血清型を同定する方法がエンテロウイルスについて報告
されている（特開平11-346799）。この報告には、エン
テロウイルスのＰＣＲによる検出において、ライノウイ
ルスも検出され得ることが記載されているが、ライノウ
イルスの血清型または遺伝子型の同定については記載が
ない。
血清型を同定する方法がエンテロウイルスについて報告
されている（特開平11-346799）。この報告には、エン
テロウイルスのＰＣＲによる検出において、ライノウイ
ルスも検出され得ることが記載されているが、ライノウ
イルスの血清型または遺伝子型の同定については記載が
ない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の様な
問題点のないヒトライノウイルスの迅速かつ簡易な血清
型または遺伝子型の同定法を提供することを目的とす
る。
問題点のないヒトライノウイルスの迅速かつ簡易な血清
型または遺伝子型の同定法を提供することを目的とす
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトライ
ノウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を解析したとこ
ろ、この塩基配列の遺伝子系統解析により血清型が同定
できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完
成するに至った。
ノウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を解析したとこ
ろ、この塩基配列の遺伝子系統解析により血清型が同定
できるという知見を得、この知見に基づき、本発明を完
成するに至った。
【０００７】かくして、本発明は、ヒトライノウイルス
のＶＰ４領域の塩基配列に基づいて遺伝子系統解析を行
い、ヒトライノウイルスの血清型を同定することを特徴
とするヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型の同
定法（以下、本発明同定法ともいう）を提供する。
のＶＰ４領域の塩基配列に基づいて遺伝子系統解析を行
い、ヒトライノウイルスの血清型を同定することを特徴
とするヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型の同
定法（以下、本発明同定法ともいう）を提供する。
【０００８】本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基
配列は、試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡか
らｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって
ＶＰ４領域を含むウイルス遺伝子を増幅することにより
得ることができる。
配列は、試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡか
らｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲによって
ＶＰ４領域を含むウイルス遺伝子を増幅することにより
得ることができる。
【０００９】ＰＣＲに使用されるプライマーとしては、
配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列
番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ
る。
配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列
番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明同定法は、ヒトライノウイ
ルスの血清型または遺伝子型を同定するために、ヒトラ
イノウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて遺伝子
系統解析を行うことを特徴とする。
ルスの血清型または遺伝子型を同定するために、ヒトラ
イノウイルスのＶＰ４領域の塩基配列に基づいて遺伝子
系統解析を行うことを特徴とする。
【００１１】本明細書において、ＶＰ４領域とは、ヒト
ライノウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一
つであるＶＰ４タンパク質（通常、６９アミノ酸）をコ
ードする領域（通常、２０７ｂｐ）を意味する。
ライノウイルスのキャプシドを形成するタンパク質の一
つであるＶＰ４タンパク質（通常、６９アミノ酸）をコ
ードする領域（通常、２０７ｂｐ）を意味する。
【００１２】ＶＰ４領域の塩基配列を得る方法は特に限
定されないが、血清型の未同定のヒトライノウイルスを
含む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以
下の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲ
ＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得
られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域を含むウ
イルス遺伝子を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配
列解析を行う方法である。
定されないが、血清型の未同定のヒトライノウイルスを
含む試料からＶＰ４領域の塩基配列を得る場合には、以
下の方法によることが好ましい。すなわち、試料からＲ
ＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを得、得
られたｃＤＮＡからＰＣＲによってＶＰ４領域を含むウ
イルス遺伝子を増幅し、増幅された産物を用いて塩基配
列解析を行う方法である。
【００１３】試料は、ヒトライノウイルスを含むかまた
は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、
例としては、鼻腔又は咽頭拭い液、鼻腔洗浄液などの臨
床材料、または、これらの臨床材料より分離されたウイ
ルス培養液などを挙げることができる。これらの試料か
らのＲＮＡの抽出は公知の方法により行うことができ
る。また、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成方法も公知であ
る。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域を
含むウイルス遺伝子を増幅できるように選択されたオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方
法に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写
(RT)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡ
の増幅を行うこともできる。RT-PCRによれば、高感度か
つ迅速な増幅が可能になる。
は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、
例としては、鼻腔又は咽頭拭い液、鼻腔洗浄液などの臨
床材料、または、これらの臨床材料より分離されたウイ
ルス培養液などを挙げることができる。これらの試料か
らのＲＮＡの抽出は公知の方法により行うことができ
る。また、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成方法も公知であ
る。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＰ４領域を
含むウイルス遺伝子を増幅できるように選択されたオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして、公知のＰＣＲの方
法に従って行うことができる。また、ＲＮＡから逆転写
(RT)-PCRにより同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡ
の増幅を行うこともできる。RT-PCRによれば、高感度か
つ迅速な増幅が可能になる。
【００１４】増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳
動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公
知の方法で行うことができる。通常には、ヒトライノウ
イルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配
列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公
知の方法で行うことができる。通常には、ヒトライノウ
イルスの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配
列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００１５】ＶＰ４領域の全領域を含む塩基配列を増幅
できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例として
は、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドが挙げられる。
できるように選択されたオリゴヌクレオチドの例として
は、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌク
レオチドが挙げられる。
【００１６】ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよ
く、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目の
ＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２
回目のＰＣＲを行うことができる。２段階の増幅を行う
ことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅する
ことが可能になる。
く、例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴ
ヌクレオチド及び配列番号２に示す塩基配列からなるオ
リゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第１回目の
ＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列からなる
オリゴヌクレオチド及び配列番号３に示す塩基配列から
なるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて第２
回目のＰＣＲを行うことができる。２段階の増幅を行う
ことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅する
ことが可能になる。
【００１７】増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法に
よって行うことができる。決定された塩基配列の内、Ｖ
Ｐ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。
よって行うことができる。決定された塩基配列の内、Ｖ
Ｐ４領域の塩基配列を系統解析に用いる。
【００１８】本発明同定法において、ＶＰ４領域の塩基
配列に基づく系統解析は、公知の系統解析法によって行
うことができる。このような方法としては、Higgins
法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法及
びN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により系
統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DN
ASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士
通)など）。
配列に基づく系統解析は、公知の系統解析法によって行
うことができる。このような方法としては、Higgins
法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法及
びN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により系
統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DN
ASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士
通)など）。
【００１９】血清型は、系統解析においてそれぞれの血
清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、また
は、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別
されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解
析により得られた系統樹において各血清型に属する株が
それぞれ単一のクラスターを形成するような値であれば
よい。
清型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、また
は、一定値以上の確率で他の血清型のクラスターと区別
されるか否かによって決定できる。一定値とは、系統解
析により得られた系統樹において各血清型に属する株が
それぞれ単一のクラスターを形成するような値であれば
よい。
【００２０】より具体的には、ホモロジーで８０％以
上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別され
る確率が７０％以上という値があげられる。例えば、ラ
イノウイルス標準株１００血清型の系統解析によると、
血清型は９８．６％以上のホモロジーで区別され、分離
株を加えたブーツストラップでは、８６％の確率で他の
血清型と区別された。
上、ブーツストラップ法で他のクラスターから区別され
る確率が７０％以上という値があげられる。例えば、ラ
イノウイルス標準株１００血清型の系統解析によると、
血清型は９８．６％以上のホモロジーで区別され、分離
株を加えたブーツストラップでは、８６％の確率で他の
血清型と区別された。
【００２１】ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基配
列に基づく遺伝子系統解析では、血清型によく対応した
分類が得られるため、すなわち、血清型とＶＰ４領域の
遺伝子型が十分に一致するため、血清型に対応する遺伝
子型として型の同定を行ってもよい。従って、本発明に
より血清型または遺伝子型の同定方法が提供される。
列に基づく遺伝子系統解析では、血清型によく対応した
分類が得られるため、すなわち、血清型とＶＰ４領域の
遺伝子型が十分に一致するため、血清型に対応する遺伝
子型として型の同定を行ってもよい。従って、本発明に
より血清型または遺伝子型の同定方法が提供される。
【００２２】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明す
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。
るが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲が何ら限定されるものではない。
【００２３】
【実施例１】（１）ヒトライノウイルスＶＰ４全領域の
塩基配列解析 １）ウイルスRNAの抽出とcDNA合成 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
に登録されている100血清型（HRV1〜100）のヒトライノ
ウイルスのうち、GenBankにその遺伝子の全塩基配列が
登録されている７株（HRV1B、HRV2、HRV9、HRV14、HRV1
6、HRV85、HRV89）を除いた９３株をATCCから入手し
た。
塩基配列解析 １）ウイルスRNAの抽出とcDNA合成 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)
に登録されている100血清型（HRV1〜100）のヒトライノ
ウイルスのうち、GenBankにその遺伝子の全塩基配列が
登録されている７株（HRV1B、HRV2、HRV9、HRV14、HRV1
6、HRV85、HRV89）を除いた９３株をATCCから入手し
た。
【００２４】それぞれの試料から、スマイテストＲキッ
ト（ゲノムサイエンス研究所）を用いてRNAを抽出し、
乾固させた。このRNAに、リボヌクレアーゼフリー蒸留
水８μl、リボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μl、p
romega）１μl、及び、50μM下流プライマー（OL68-1:
5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'(配列番号１)、
20mer）１μlを加えてRNAを溶解させた。100℃で１分間
加熱変性後、氷中にて急冷した。これに、10×Taq緩衝
液（100 M Tris-HCl pH 8.3、500 mM KCl、15 mMMgC
l2、0.01%(w/v)ゼラチン） 2μl、10 mM dNTPs 2μl、M
-MLV由来逆転写酵素（200 U/μl、GIBCO BRL)）0.6μ
l、及び、リボヌクレアーゼフリー蒸留水4.4μlを加
え、37℃で60分間の反応条件でcDNAを合成した。
ト（ゲノムサイエンス研究所）を用いてRNAを抽出し、
乾固させた。このRNAに、リボヌクレアーゼフリー蒸留
水８μl、リボヌクレアーゼインヒビター（40 U/μl、p
romega）１μl、及び、50μM下流プライマー（OL68-1:
5'GGTAA(C/T)TTCCACCACCA(A/G/C/T)CC3'(配列番号１)、
20mer）１μlを加えてRNAを溶解させた。100℃で１分間
加熱変性後、氷中にて急冷した。これに、10×Taq緩衝
液（100 M Tris-HCl pH 8.3、500 mM KCl、15 mMMgC
l2、0.01%(w/v)ゼラチン） 2μl、10 mM dNTPs 2μl、M
-MLV由来逆転写酵素（200 U/μl、GIBCO BRL)）0.6μ
l、及び、リボヌクレアーゼフリー蒸留水4.4μlを加
え、37℃で60分間の反応条件でcDNAを合成した。
【００２５】２）PCR
ウイルスのＶＰ４全領域の塩基配列を増幅するため、ヒ
トライノウイルス及びエンテロウイルスに共通な配列と
思われるウイルス遺伝子の5'非翻訳領域及びVP2領域に
設定したプライマーを用いてPCRを行った。第１回(1st)
PCRは、上記で得られた反応液10μlに、10×Taq緩衝液
4.5μl、50μM 上流プライマー（EVP2: 5'CCTCCGGCCCCT
GAATGCGGCTAAT3'(配列番号２)、25mer）0.5μl、蒸留水
34.75μl及びAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5 U/μl)(Roc
he Diagnostics)0.25μlを加え、ミネラルオイルを重層
し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用い
て、95℃30秒で変性、55℃30秒でアニーリング及び72℃
１分間で伸長のサイクルを40サイクルの条件で行った。
第２回(2nd)PCRは、1st PCRで得られた反応液５μlに、
10×Taq緩衝液4.5μl、10 mM dNTPs １μl、50μM上流
プライマー(EVP4: 5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'(配列番号
３)、20mer) 0.5μl、50μM 下流プライマー(OL68-1)
0.5μl、蒸留水38.25μl及びAmpli Taq DNAポリメラー
ゼ0.25μlを加え、1st PCRと同じ条件で行った。PCR産
物は、３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウ
ムブロマイド染色後、紫外線で検出した。
トライノウイルス及びエンテロウイルスに共通な配列と
思われるウイルス遺伝子の5'非翻訳領域及びVP2領域に
設定したプライマーを用いてPCRを行った。第１回(1st)
PCRは、上記で得られた反応液10μlに、10×Taq緩衝液
4.5μl、50μM 上流プライマー（EVP2: 5'CCTCCGGCCCCT
GAATGCGGCTAAT3'(配列番号２)、25mer）0.5μl、蒸留水
34.75μl及びAmpli Taq DNAポリメラーゼ(5 U/μl)(Roc
he Diagnostics)0.25μlを加え、ミネラルオイルを重層
し、GeneAmp PCR System 9600(PERKIN ELMER)を用い
て、95℃30秒で変性、55℃30秒でアニーリング及び72℃
１分間で伸長のサイクルを40サイクルの条件で行った。
第２回(2nd)PCRは、1st PCRで得られた反応液５μlに、
10×Taq緩衝液4.5μl、10 mM dNTPs １μl、50μM上流
プライマー(EVP4: 5'CTACTTTGGGTGTCCGTGTT3'(配列番号
３)、20mer) 0.5μl、50μM 下流プライマー(OL68-1)
0.5μl、蒸留水38.25μl及びAmpli Taq DNAポリメラー
ゼ0.25μlを加え、1st PCRと同じ条件で行った。PCR産
物は、３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウ
ムブロマイド染色後、紫外線で検出した。
【００２６】この条件でのPCRでは、1st PCRで約630 b
p、2nd PCRで約530 bp（5'非翻訳領域の一部、ＶＰ４全
領域及びＶＰ２領域のＮ末端側約１／３を含む）が増幅
される。この条件では、全ヒトエンテロウイルスの同領
域の増幅も可能であるが、ヒトエンテロウイルスの場合
の増幅領域は1st PCRで約750 bp、2nd PCRで約650 bpで
ある（特開平11-346799参照）。ヒトライノウイルス
は、ヒトエンテロウイルスと比較した場合、5'非翻訳領
域の3'末端に約120 bpの欠損があり、ヒトエンテロウイ
ルスとはアガロースゲル電気泳動で容易に鑑別可能であ
った。また、今回用いた全てのヒトライノウイルス標準
株及び分離ウイルス株において増幅が確認できたことか
ら、上記プライマーの塩基配列は、ヒトエンテロウイル
スのみならず、ヒトライノウイルスの全血清型に保存さ
れていることが明らかとなった。
p、2nd PCRで約530 bp（5'非翻訳領域の一部、ＶＰ４全
領域及びＶＰ２領域のＮ末端側約１／３を含む）が増幅
される。この条件では、全ヒトエンテロウイルスの同領
域の増幅も可能であるが、ヒトエンテロウイルスの場合
の増幅領域は1st PCRで約750 bp、2nd PCRで約650 bpで
ある（特開平11-346799参照）。ヒトライノウイルス
は、ヒトエンテロウイルスと比較した場合、5'非翻訳領
域の3'末端に約120 bpの欠損があり、ヒトエンテロウイ
ルスとはアガロースゲル電気泳動で容易に鑑別可能であ
った。また、今回用いた全てのヒトライノウイルス標準
株及び分離ウイルス株において増幅が確認できたことか
ら、上記プライマーの塩基配列は、ヒトエンテロウイル
スのみならず、ヒトライノウイルスの全血清型に保存さ
れていることが明らかとなった。
【００２７】３）塩基配列の解析
上記のようにして得られた、ＶＰ４全領域を含むPCR産
物の塩基配列を解析した。PCR産物は、QIAquick PCR pu
rificationキット(QIAGEN)を用いて、未反応のプライマ
ーとdNTPsを除去し、DNA濃度が5 ng/μl以上になるよう
に蒸留水に溶解した。塩基配列解析用に、ＶＰ４領域上
流の、ヒトライノウイルス及びエンテロウイルスに共通
な配列と思われる塩基配列の上記プライマーEVP4を用い
た。塩基配列の解析は、ダイターミネーター(dye termi
nator)法を用いたサイクルシークエンスキット(BECMAN
COULTER)を用いて、96℃20秒、50℃20秒及び60℃４分の
サイクルを40サイクルの条件で反応を行い、マルチキャ
ピラリーDNA解析システム(BECMAN COULTER)で塩基配列
を決定した。
物の塩基配列を解析した。PCR産物は、QIAquick PCR pu
rificationキット(QIAGEN)を用いて、未反応のプライマ
ーとdNTPsを除去し、DNA濃度が5 ng/μl以上になるよう
に蒸留水に溶解した。塩基配列解析用に、ＶＰ４領域上
流の、ヒトライノウイルス及びエンテロウイルスに共通
な配列と思われる塩基配列の上記プライマーEVP4を用い
た。塩基配列の解析は、ダイターミネーター(dye termi
nator)法を用いたサイクルシークエンスキット(BECMAN
COULTER)を用いて、96℃20秒、50℃20秒及び60℃４分の
サイクルを40サイクルの条件で反応を行い、マルチキャ
ピラリーDNA解析システム(BECMAN COULTER)で塩基配列
を決定した。
【００２８】この結果、プライマーEVP4を用いて全ての
型のヒトライノウイルスの塩基配列が決定された。この
ことから、プライマーEVP4は、ヒトエンテロウイルスの
みならず、ヒトライノウイルスの全血清型に保存されて
いることが明らかとなった。塩基配列を決定した結果、
ヒトライノウイルスの標準株、及び、分離ウイルス株の
いずれの株についても、塩基配列に挿入や欠失は認めら
れず、ＶＰ４領域の長さはは207 bpと一様であった。
型のヒトライノウイルスの塩基配列が決定された。この
ことから、プライマーEVP4は、ヒトエンテロウイルスの
みならず、ヒトライノウイルスの全血清型に保存されて
いることが明らかとなった。塩基配列を決定した結果、
ヒトライノウイルスの標準株、及び、分離ウイルス株の
いずれの株についても、塩基配列に挿入や欠失は認めら
れず、ＶＰ４領域の長さはは207 bpと一様であった。
【００２９】ＶＰ４全領域の塩基配列の解析を行った標
準株93血清型とGenBankに登録されている標準株７血清
型とを合わせた100種のヒトライノウイルス血清型標準
株のVP4領域のホモロジーは50.2〜98.6％であった（シ
ンプルホモロジー法(DINASIS)により算出）。
準株93血清型とGenBankに登録されている標準株７血清
型とを合わせた100種のヒトライノウイルス血清型標準
株のVP4領域のホモロジーは50.2〜98.6％であった（シ
ンプルホモロジー法(DINASIS)により算出）。
【００３０】（２）系統解析
新たに塩基配列を解析した標準株93株、ならびに、GenB
ankに登録されているHRV1B、HRV2、HRV9、HRV14、HRV1
6、HRV85及びHRV89（７血清型）のＶＰ４領域の塩基配
列を用いた。系統樹は、２−パラメーター法を用いたUP
GMA法及びN-J法(SINCA、富士通)により作成し、作成さ
れた系統樹の確かさは、ブーツストラップ法(SINCA)を
用いて統計的評価を行った。
ankに登録されているHRV1B、HRV2、HRV9、HRV14、HRV1
6、HRV85及びHRV89（７血清型）のＶＰ４領域の塩基配
列を用いた。系統樹は、２−パラメーター法を用いたUP
GMA法及びN-J法(SINCA、富士通)により作成し、作成さ
れた系統樹の確かさは、ブーツストラップ法(SINCA)を
用いて統計的評価を行った。
【００３１】臨床分離株の塩基配列を標準株と共に系統
解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラ
ップ解析より血清型同定を行った。
解析を行って得られた系統樹の枝分かれとブーツストラ
ップ解析より血清型同定を行った。
【００３２】先ず、標準株のＶＰ４領域の全領域の塩基
配列による系統樹を作成した結果、ヒトライノウイルス
の遺伝子型は、HRV87を除いて、大きく２つのグループ
に分類された。すなわち、HRV1〜2、7〜13、15〜16、18
〜25、36、38〜41、43〜47、49〜51、53〜68、71、73〜
78、80〜82、85、88〜90、94〜96、98及び100の第１群
と、HRV3〜6、14、17、26〜27、37、42、48、52、69〜7
0、72、79、83〜84、86、91〜93、97及び99の第２群の
２グループである。これは、UPGMA法及びN-J法のいずれ
も同様の結果となった。
配列による系統樹を作成した結果、ヒトライノウイルス
の遺伝子型は、HRV87を除いて、大きく２つのグループ
に分類された。すなわち、HRV1〜2、7〜13、15〜16、18
〜25、36、38〜41、43〜47、49〜51、53〜68、71、73〜
78、80〜82、85、88〜90、94〜96、98及び100の第１群
と、HRV3〜6、14、17、26〜27、37、42、48、52、69〜7
0、72、79、83〜84、86、91〜93、97及び99の第２群の
２グループである。これは、UPGMA法及びN-J法のいずれ
も同様の結果となった。
【００３３】ヒトライノウイルスは分子生物学的特徴か
らこれまで、ヒトライノウイルスＡ(Human Rhinovirus
A)、ヒトライノウイルスＢ(Human Rhinovirus B)及びテ
ンタティブ種(tentative species)に分類されている。
上記の分類結果では、これまでにヒトライノウイルスＡ
及びヒトライノウイルスＢに分類されているヒトライノ
ウイルスは、それぞれ、第１群及び第２群へ分類され、
ヒトライノウイルスＡ及びヒトライノウイルスＢの分類
は第１群及び第２群の分類と１００％一致した。従っ
て、第１群がヒトライノウイルスＡ、第２群がヒトライ
ノウイルスＢに相当することが判明した。さらにこれま
でテンタティブ種に分類されている78種類（HRV87を除
く）のヒトライノウイルスは、56種類のヒトライノウイ
ルスＡ及び22種類のヒトライノウイルスＢに分類され
た。系統樹の一例を図１及び２に示す。
らこれまで、ヒトライノウイルスＡ(Human Rhinovirus
A)、ヒトライノウイルスＢ(Human Rhinovirus B)及びテ
ンタティブ種(tentative species)に分類されている。
上記の分類結果では、これまでにヒトライノウイルスＡ
及びヒトライノウイルスＢに分類されているヒトライノ
ウイルスは、それぞれ、第１群及び第２群へ分類され、
ヒトライノウイルスＡ及びヒトライノウイルスＢの分類
は第１群及び第２群の分類と１００％一致した。従っ
て、第１群がヒトライノウイルスＡ、第２群がヒトライ
ノウイルスＢに相当することが判明した。さらにこれま
でテンタティブ種に分類されている78種類（HRV87を除
く）のヒトライノウイルスは、56種類のヒトライノウイ
ルスＡ及び22種類のヒトライノウイルスＢに分類され
た。系統樹の一例を図１及び２に示す。
【００３４】（３）血清型同定
ヒトエンテロウイルスRT-PCR（臨床とウイルス、第27
巻、第４号、P283〜P293）で、ヒトライノウイルスとし
て検出された臨床分離株９株について、上記と同様に塩
基配列決定を行い、標準株の塩基配列とともに系統解析
を行ったところ、標準株と同様に２グループに分類され
た（ヒトライノウイルスＡが７株、ヒトライノウイルス
Ｂが２株）。さらに一部（８株）の臨床分離株は、標準
株とともにブートストラップ値86%以上でクラスターを
形成し、それぞれ、HRV1、HRV3、HRV38、HRV49、HRV53
及びHRV60と血清型が同定された。
巻、第４号、P283〜P293）で、ヒトライノウイルスとし
て検出された臨床分離株９株について、上記と同様に塩
基配列決定を行い、標準株の塩基配列とともに系統解析
を行ったところ、標準株と同様に２グループに分類され
た（ヒトライノウイルスＡが７株、ヒトライノウイルス
Ｂが２株）。さらに一部（８株）の臨床分離株は、標準
株とともにブートストラップ値86%以上でクラスターを
形成し、それぞれ、HRV1、HRV3、HRV38、HRV49、HRV53
及びHRV60と血清型が同定された。
【００３５】
【発明の効果】本発明によって、ヒトライノウイルスの
血清型または遺伝子型を、ウイルスの分離培養を要する
ことなく、塩基配列の遺伝子系統解析により決定するこ
とが可能になる。また、非中和サイトの蛋白質をコード
する遺伝子を利用するため、表現型に影響を受けず、難
中和性ウイルスに関わる問題の解決にも寄与する。
血清型または遺伝子型を、ウイルスの分離培養を要する
ことなく、塩基配列の遺伝子系統解析により決定するこ
とが可能になる。また、非中和サイトの蛋白質をコード
する遺伝子を利用するため、表現型に影響を受けず、難
中和性ウイルスに関わる問題の解決にも寄与する。
【００３６】
【配列表】
<110> 株式会社三菱化学ビーシーエル(Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Labor
atories, Inc.)
<120> ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法
<130> P-9199
<160> 3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<220>
<221> misc_feature
<222> 18
<223> n=a, t, g or c
<400> 1
ggtaayttcc accaccancc 20
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 2
cctccggccc ctgaatgcgg ctaat 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic DNA
<400> 3
ctactttggg tgtccgtgtt 20
【図１】 標準株のＶＰ４領域に基づいて、2-パラメー
ター法を用いたUPGMA法により作成された系統樹。
ター法を用いたUPGMA法により作成された系統樹。
【図２】 図１の続き。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 島田 康司
東京都板橋区志村３丁目30番１号 株式会
社三菱化学ビーシーエル内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 HA12
4B063 QA07 QA14 QA19 QQ10 QQ43
QR08 QR42 QR56 QS25 QS34
QX02
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトライノウイルスのＶＰ４領域の塩基
配列に基づいて遺伝子系統解析を行い、ヒトライノウイ
ルスの血清型または遺伝子型を同定することを特徴とす
るヒトライノウイルスの血清型または遺伝子型の同定
法。 - 【請求項２】 試料からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲ
ＮＡからｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡからＰＣＲに
よってＶＰ４領域を含むウイルス遺伝子を増幅し、前記
ＶＰ４領域の塩基配列を得ることを特徴とする請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 前記ＰＣＲが、配列番号１に示す塩基配
列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有
するプライマーとを用いるものであることを特徴とする
請求項２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001293736A JP5000056B2 (ja) | 2001-09-26 | 2001-09-26 | ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001293736A JP5000056B2 (ja) | 2001-09-26 | 2001-09-26 | ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003093057A true JP2003093057A (ja) | 2003-04-02 |
| JP5000056B2 JP5000056B2 (ja) | 2012-08-15 |
Family
ID=19115466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001293736A Expired - Fee Related JP5000056B2 (ja) | 2001-09-26 | 2001-09-26 | ヒトライノウイルスの系統解析による血清型または遺伝子型の同定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5000056B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009127154A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Biomerieux | A newly identified human rhinovirus of hrv-c and methods and kits for detecting hrv-cs |
| RU2543151C2 (ru) * | 2013-02-25 | 2015-02-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации рнк риновирусов человека |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6147191A (ja) * | 1984-07-20 | 1986-03-07 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | ヒト・ライノウイルスｒｎａおよびたんぱく |
| JPH11346799A (ja) * | 1998-06-04 | 1999-12-21 | Mitsubishi Kagaku Bio Clinical Laboratories Inc | エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法 |
-
2001
- 2001-09-26 JP JP2001293736A patent/JP5000056B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6147191A (ja) * | 1984-07-20 | 1986-03-07 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | ヒト・ライノウイルスｒｎａおよびたんぱく |
| JPH11346799A (ja) * | 1998-06-04 | 1999-12-21 | Mitsubishi Kagaku Bio Clinical Laboratories Inc | エンテロウイルスの系統解析による血清型の迅速同定法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009127154A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Biomerieux | A newly identified human rhinovirus of hrv-c and methods and kits for detecting hrv-cs |
| WO2009127081A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Biomerieux | A newly identified human rhinovirus of hrv-c and methods and kits for detecting hrv-cs |
| US8709779B2 (en) | 2008-04-17 | 2014-04-29 | Biomerieux | Newly identified human rhinovirus of HRV-C and methods and kits for detecting HRV-Cs |
| RU2543151C2 (ru) * | 2013-02-25 | 2015-02-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации рнк риновирусов человека |
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|---|---|
| JP5000056B2 (ja) | 2012-08-15 |
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