JP3752102B2 - 小型球形ウイルスの検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、小型球形ウイルスの検出方法及び遺伝子型同定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
小型球形ウイルス（small round structured virus; ＳＲＳＶ）は非細菌性の下痢症や急性胃腸炎の患者から検出されている(J. Clin. Microbiol. 32: 642-648(1994); J. Clin. Microbiol. 27: 1728-1733 (1989))。このウイルスは約7,500 bpのプラス一本鎖のＲＮＡウイルスであり、その電子顕微鏡像は直径35〜40 nmである(Science 259: 516-519 (1993); Science 250: 158-1583 (1990))。プロトタイプはノーウォークウイルスで、1968年に米国オハイオ州ではじめて分離され、1972年に免疫電顕下でその形態が明らかになった(J. Virol. 10: 1075-1081 (1972))。したがって、形態学的にノーウォークウイルスに似ているが、抗原的に異なるＳＲＳＶはノーウォーク様ウイルスと総称されている。ＳＲＳＶの遺伝子構造については、5'末端から非構造タンパク質、構造タンパク質、機能不明タンパク質をそれぞれコードするＯＲＦ１(5.4 kb)、ＯＲＦ２(1.6 kb)、ＯＲＦ３(0.6 kb)が同定されている(Science 259: 516-519 (1993); Science 250: 158-1583 (1990))。ＳＲＳＶは、ゲノグループＩ（ノーウォーク様(Norwalk-like)）、ゲノグループII（スノーマウンテン様(Snow mountain-like)）、クラシカルヒトカリシウイルス(classical human calicivirus)（サッポロ様(Sapporo-like)）の３種のグループに分類される。
【０００３】
日本において1990年から５年間で908件の非細菌性胃腸炎集団発生事例があり、360件で原因ウイルスが同定され、うち330件がＳＲＳＶ陽性であったことが報告されている。また、1997年1月から11月までに非細菌性胃腸炎集団発生事例で198件の報告があり、不明43件を除く152件が食品媒介とされ、うち71件からＳＲＳＶが検出されている(Infectous Agents Surveillance Report. 19: 1-6 (1998))。
【０００４】
現在、ＳＲＳＶの検出には、主として、発症した患者糞便を試料として酵素抗体法あるいは免疫顕微鏡による検出方法が行われている。酵素抗体法は、ＳＲＳＶの多様な血清型に対応するだけの抗体が必要であり、今後血清型の増加が予測されることから検査としての実用性は低いと考えられる。また、電子顕微鏡による検出は実施できる施設が限られることや大量処理への対応が難しいことがあり、実用性は低いと考えられる。
【０００５】
また、ＳＲＳＶは食品を媒介してヒトに非細菌性の下痢症や胃腸炎を広域に集団で引き起こす危険性があることから、その予防として感染前に原因となり得る食品から微量のウイルスを迅速にかつ高率に検出できる方法を確立する必要性がある。しかしながら、ＳＲＳＶの感染源が食品の場合、そのウイルス量は糞便に比べごく微量であると考えられることから、糞便を試料とする検出方法と同様の方法ではＳＲＳＶが検出されない可能性が考えられる。
【０００６】
最近、試料中のウイルス量が微量でも測定可能な方法として、目的とする遺伝子断片を増幅させて検出するＰＣＲ(polymerase chain reaction)法に基づく検出がＳＲＳＶについても報告されている。その増幅プライマーは主にＯＲＦ１(open reading frame 1)に存在するRdRp(RNA-dependent RNA polymerase)領域の一部を増幅させる設定となっている(J. Clin. Microbiol. 30: 2529-2534 (1992); Arch. Virol. 135: 185-192 (1994); J. Clin. Microbiol. 33: 64-71 (1995); J. Clin. Microbiol. 35: 570-577 (1997); Microbiol. Immunol. 42: 439-446 (1998))。
【０００７】
また、現在、ＳＲＳＶについては培養細胞あるいは実験動物を用いての分離増殖法は全くなく、ヒトからのウイルスの同定方法としては、患者糞便を試料とした酵素抗体法、電子顕微鏡法あるいはウェスタンブロットを用いた方法が主に行われている(J. Med. Virol. 2: 97-108 (1987); J. Med. Virol. 17: 127-133 (1985); J. Clin. Microbiol. 22: 274-278 (1985); J. Clin. Microbiol. 24: 456-459 (1986)); J. Clin. Microbiol. 10: 730-736 (1979))。しかし、抗体を用いる方法は、ＳＲＳＶの多様な血清型に対応するだけの抗体が必要であり、また、電子顕微鏡による方法は実施できる施設が限られ、大量処理への対応が難しいなどの問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、すでに報告されているＳＲＳＶの塩基配列を比較した結果、ＯＲＦ１には塩基配列の変異が多く、ＯＲＦ１の塩基配列に基づく従来のプライマーによるＰＣＲ検出法には、偽陰性を与える可能性が高いなどの改善すべき点があることを見い出した。
【０００９】
従って、本発明は、上記の様な問題点のないＳＲＳＶの検出方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ＳＲＳＶの遺伝子型の迅速かつ簡便な同定法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＯＲＦ１の３’末端を含む領域からＯＲＦ２の５’末端領域までを含む塩基配列中の、ゲノグループＩ及びIIのそれぞれにおいて保存されている領域の塩基配列に基づいて設定したプライマー、特に、ゲノグループ毎に検出するための逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)反応用のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＳＲＳＶを特異的に検出できること、及び、ＯＲＦ２の５’末端領域の塩基配列に基づいて系統分析を行うことにより、ＳＲＳＶの遺伝子型を同定できることを見い出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明は、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の検出方法であって、前記ＰＣＲで用いられるプライマーが、ＳＲＳＶゲノムのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）領域の３’末端約３０ｂｐ及びＳＲＳＶゲノムのオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）の５’末端約２０ｂｐを含む領域において保存されている塩基配列に基づいて設定された第１プライマー、並びに、ＯＲＦ２の５’末端から数えて塩基番号約２９２〜約３１３の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定された第２のプライマーであり、第１のプライマー及び第２のプライマーはその間の塩基配列を増幅できるように設定されていることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法（本発明検出方法）を提供する。
【００１３】
本発明検出方法において、好ましくは、ｃＤＮＡの合成が配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられるか、あるいは、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられる。
【００１４】
本発明は、また、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２領域の、５’末端から数えて塩基番号約１〜約３００の範囲内から選ばれる、分子系統解析によりＳＲＳＶの遺伝子型が同定できる塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことにより、ＳＲＳＶの遺伝子型を同定することを特徴とするＳＲＳＶの遺伝子型の同定方法（本発明同定方法）を提供する。
【００１５】
本発明同定方法において、好ましくは、分子系統解析の対象となる塩基配列は、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし、上記塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物の塩基配列を決定することによって得られたものである。さらに、好ましくは、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとを用いられるか、あるいは、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、ＳＲＳＶを高感度且つ特異的に検出することを可能にする方法、すなわち、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、ＳＲＳＶの検出方法であって、前記ＰＣＲで用いられるプライマーが、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ１領域の３’末端約３０ｂｐ及びＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２の５’末端約２０ｂｐを含む領域において保存されている塩基配列に基づいて設定された第１プライマー、並びに、ＯＲＦ２の５’末端から数えて塩基番号約２９２〜約３１３の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定された第２のプライマーであり、第１のプライマー及び第２のプライマーはその間の塩基配列を増幅できるように設定されていることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法である。
【００１７】
試料は、ＳＲＳＶを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、臨床材料、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液、及び、カキなどの食品を挙げることができる。これらの試料からのＲＮＡの調製は、抽出等の公知の方法により行うことができる。また、ＲＮＡからの逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成方法も公知である。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、公知のＰＣＲの方法に従って行うことができる。ｃＤＮＡの合成には、同一の反応系でｃＤＮＡの合成及びその後のＰＣＲによる増幅ができるため、第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちＲＮＡに相補的なものを使用することが好ましい。
【００１８】
第１のプライマー及び第２のプライマーは、その間の塩基配列を増幅できるように、すなわち、センスプライマーとアンチセンスプライマーとなるように設定される。
【００１９】
第１のプライマーは、好ましくは、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ１領域の３’末端約３０ｂｐ及びＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２の５’末端約２０ｂｐを含む領域において保存されている塩基配列に基づいて設定される。第２のプライマーは、好ましくは、ＯＲＦ２の５’末端から数えて塩基番号約２９２〜約３１３の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定される。
【００２０】
上記特定の領域中の保存されている塩基配列の選択およびプライマーの設定は、既知のＳＲＳＶのゲノムの塩基配列を参考にして当業者に公知の方法で行えばよい。保存されている塩基配列の選択及びプライマーの設定は、コンピューター検索に基づいて行うことでより効率的となる。
【００２１】
プライマーは、ＳＲＳＶのゲノグループ毎に特異的に設定してもよい。このようにすると、プライマー中の塩基の変異が少なくなり特異性を高めることができ、また、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解読しなくても、ＰＣＲ増幅産物の検出のみで迅速にゲノグループの判定ができる。
【００２２】
プライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方又は両方について、複数のプライマーを混合したミックスプライマーとして設定してもよい。プライマー設定部分に塩基の変異が存在する場合には、ミックスプライマーを用いることで検出効率を上げることができる。
【００２３】
上記プライマーの好ましい例としては、ゲノグループＩの場合には、配列番号１又は３に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ、ゲノグループIIの場合には、配列番号４又は６に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２４】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、ゲノグループＩの場合には、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。また、ゲノグループIIの場合には、例えば、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００２５】
試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いるＰＣＲは、公知の方法に従って行うことができ、逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)により同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行ってもよい。この場合、ＰＣＲで使用するプライマーのうちＲＮＡに相補的なものを逆転写酵素による反応に用いることが好ましく、例えば上記の２段階ＰＣＲを採用するのであれば、それぞれ、配列番号１に示すプライマー及び配列番号４に示すプライマーが使用される。
【００２６】
増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色などの公知の分析方法で行うことができる。通常には、ＳＲＳＶゲノムの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を検出する。
【００２７】
＜２＞本発明同定方法
本発明同定方法は、ＳＲＳＶの遺伝子型を同定するために、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２領域の、５’末端から数えて塩基番号約１〜約３００の範囲内から選ばれる、分子系統解析によりＳＲＳＶの遺伝子型が同定できる塩基配列（以下ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列ともいう）に基づいて分子系統解析を行うことを特徴とする。
【００２８】
ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を得る方法は特に限定されないが、遺伝子型の未同定のＳＲＳＶを含む試料からＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を得る場合には、以下の方法によることが好ましい。すなわち、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物の塩基配列決定を行う方法である。試料からのＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの調製、及びＰＣＲは、上記本発明検出方法について説明した様にして行うことが可能である。
【００２９】
ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーの好ましい例としては、ゲノグループＩについては、配列番号１又は３に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ、ゲノグループIIについては、配列番号４又は６に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００３０】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、ゲノグループＩの場合には、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。また、ゲノグループIIの場合には、例えば、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００３１】
逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)により同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行う場合には、ＰＣＲで使用するプライマーのうちＲＮＡに相補的なものを逆転写酵素による反応に用いることが好ましく、例えば上記の２段階ＰＣＲを採用するのであれば、それぞれ、配列番号１に示すプライマー及び配列番号４に示すプライマーが使用される。
【００３２】
増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公知の方法で行うことができる。通常には、ＳＲＳＶゲノムの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００３３】
増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法によって行うことができる。決定された塩基配列の内、ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を分子系統解析に用いる。ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列は、分子系統解析において有意な結果が得られる部分であり、分子系統解析の対象とする遺伝子型の範囲などに依存して上記の範囲で変動し得るものであるが、適切な部分を選択することは当業者であれば容易である。例えば、ゲノグループＩの分子系統解析の場合には、GenBankにAccession No. M87761で登録されている塩基配列中、塩基番号5400〜5629の230bpの塩基配列及び塩基番号5441〜5627の187bpの塩基配列が挙げられ、ゲノグループIIの場合には、GenBankにAccession No. X86557で登録されている塩基配列中、塩基番号5127〜5342の216bpの塩基配列及び塩基番号5156〜5342の187bpの塩基配列が挙げられる。
【００３４】
本発明同定方法において、ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列に基づく分子系統解析は、公知の分子系統解析法によって行うことができる。このような方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法及びN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により分子系統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
【００３５】
遺伝子型は、分子系統解析においてそれぞれの遺伝子型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、又は、一定値以上の確率で他の遺伝子型のクラスターと区別されるか否かによって決定できる。一定値とは、分子系統解析により得られた系統樹において各遺伝子型に属する株がそれぞれ単一のクラスターを形成するような値であればよい。例えば、ブーツストラップ法において１００％の確率で交差することなく単一の遺伝子がたのクラスターを形成するような値である。より具体的には８０％という値が挙げられる。
【００３６】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００３７】
【実施例１】
ＳＲＳＶの検出
（１）プライマーの設定
プライマーは、すでにヒトから検出されているＳＲＳＶのゲノムの塩基配列としてGenBank又はEMBLに登録されている塩基配列（DS395: U04469, NV: M87661, KY-89/89/J: L23829, SOV: L07418, BR: X76716, LD: X86557, CW: U46500, TV: U02030, OTH-25/89/J: L23830, MX: U22498, AL: U46039, SMA: L23831, HW: U07611, MS: X81879, MI1/94/Japan: AB005259）を用いて設定した。
【００３８】
すなわち、ゲノグループＩのプライマーについては、DS395、NV、KY-89/89/J及びSOVの塩基配列に基づいて、アンチセンスプライマー(G1/R1)5'CCAACCCARCCATTRTACATTT3'（配列番号１）、第１回ＰＣＲ(1st PCR)反応用にセンスプライマー(G1/F1)5'CTGCCCGAATTYGTAAATGAT3'（配列番号２）、及び、第２回ＰＣＲ(2nd PCR)反応用にG1/F1よりも内側のセンスプライマー(G1/F2)5'AATGATGATGGCGTCTAAGGA3'（配列番号３）を合成した。また、ゲノグループIIのプライマーについては、BR、LD、CW、TV、OTH-25/89/J、MX、AL、SMA、HW、MS、MI1/94/Japanの塩基配列に基づいて、アンチセンスプライマー(G2/R1)5'TGCATAACCATTRTACATTCT3'（配列番号４）、1st PCR反応用にセンスプライマー(G2/F1)5'GTGGGAGGGCGATCGCAATCT3'（配列番号５）、及び、2nd PCR反応用にG2/F1より内側のセンスプライマー(G2/F3)5'TTGTGAATGAAGATGGCGTCGA3'（配列番号６）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。ＳＲＳＶの遺伝子構造とプライマーの位置の関係は図１に示す通りである。
【００３９】
なお、G1/F1、G1/R1及びG1/F2の塩基配列は、GenBankにAccession No. M87661で登録されている塩基配列において、それぞれ、塩基番号5342〜5362、5671〜5650及び5357〜5377の塩基配列に相当する。また、G2/F1、G2/R1及びG2/F3の塩基配列は、GenBankにAccession No. X86557で登録されている塩基配列において、それぞれ、塩基番号5047〜5067、5384〜5364及び5079〜5100の塩基配列に相当する。
【００４０】
これらのプライマーを用いることで、ゲノグループＩ（DS395、NV、KY-89/89/J及びSOV）については、M87661の塩基配列中、塩基番号5242〜5671に相当する塩基配列が増幅されるようにプライマーを設定した。ゲノグループII（BR、LD、CW、TV、OTH-25/89/J、MX、AL、SMA、HW、MS、MI1/94/Japan）については、X86557の塩基配列中、塩基番号5047〜5384に相当する塩基配列が増幅される。
【００４１】
また、G1/F2及びG2/F3はサザンハイブリダイゼーションを行うためのプローブとして使用するため、DIGラベリングを行った。
【００４２】
（２）食品（カキ）からのＳＲＳＶの検出
カキは、日本におけるＳＲＳＶ感染源の一つと考えられているため、試料として選択した。５個のカキ中腸腺を摘出しプールして１検体とした。これと等量のＴＥ（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)、和光純薬）を加え、ストマッカーによりホモジナイジングして50%乳濁液を調製し、これを50 mlチューブに移し、４℃、3500 rpmで35分間遠心した。遠心上清2 mlを50 mlチューブに分注し、8 mlのＴＥを加え、10%乳濁調製液とし、10 mlのHCFC-141b（ダイキン工業）を加え混合し、４℃、3500 rpmで35分間遠心した。Opti Seal（BECKMAN）に500 μlの30%スクロースを分注し、HCFC-141b処理した調製液4 mlを重層して、４℃、40000 rpmで２時間の超遠心を行い、沈殿物に200μlのＴＥを分注して沈殿物を溶解した。溶解液500μlを、スマイテスト-R Kit（住友金属工業）と50μlのCHCl3をネジ式キャップの1.5 mlチューブに分注したRNA抽出液に添加し、キットの使用法に準じてRNAを抽出した。カキのホモジェネートをHCFC-141b処理及び30%ショ糖密度勾配を用いた超遠心に付して精製してから、ＲＮＡ抽出用キット試薬を使用することで、ｃＤＮＡ合成とＰＣＲの阻害物質が除去できる。
【００４３】
抽出し、乾固したRNAに、60μlのRNaseインヒビター（40 U/μl）混合ＴＥを加え溶解後、別々のチューブに溶解液10μlを分注し、100 pmol/μlに調製したG1/R1又はG2/R1を、溶解液10μlを分注したチューブに1μl添加して混合後、100℃で２分間加熱し氷中にて急冷した。これに、10×TaqGold Buffer 2μl、10 mM dNTPs 2μl、200 U/μlのM-MLV由来の逆転写酵素１μl、40 U/μlのRNaseインヒビター１μl及び滅菌蒸留水３μlを加え、37℃で60分間の反応条件でcDNAを合成した。合成したcDNAをゲノグループＩについては10×TaqGold Buffer 4.5μl、10 mM dNTPs 0.5μl、100 pmol G1/F1 0.5μl、100 mM G1/R1 0.25μl、5 U/μl TaqGold 0.25μl、滅菌蒸留水39μlを混合したPCR反応液に5μl添加して1st PCRを行った。PCR反応の条件は95℃で15分間加熱し、次いで94℃１分、55℃２分、72℃３分の反応を40回行い、その後72℃で７分間加熱した。また、ゲノグループIIについてはG1/F1をG2/F1に、G1/R1をG2/R1に代えて、同様に行った。
【００４４】
ゲノグループＩの2nd PCRでは、10×TaqGold Buffer 4.5μl、10 mM dNTPs １μl、100 pmol/μl G1/F2 0.5μl、100 pmol/μl G1/R1 0.5μl、5 U/μl TaqGold 0.25μl、滅菌蒸留水39μlを混合した反応液に1st PCR産物5μlを添加した。ゲノグループIIについてはG1/F2をG2/F3で、G1/R1をG2/R1に代えて同様に行った。2nd PCRの条件は1st PCRの反応条件であった。
【００４５】
検体にＳＲＳＶが存在した場合、ゲノグループＩの1st PCRでは333 bp、2nd PCRでは318 bpのPCR産物が得られ、ゲノグループIIの1st PCRでは338 bp、2nd PCRでは300 bpのPCR産物が得られる。
【００４６】
PCR反応液はゲノグループごとに3%アガロースゲルで電気泳動を行いエチジウムブロマイドで核酸染色し、紫外線によりPCR増幅産物を検出した。
【００４７】
本実施例で用いた５個のカキ中腸腺をプールしてこれを１検体としたカキ８５検体において全体の35.3%が陽性であった。陽性検体の内訳は、ゲノグループＩのみ陽性のものが５検体（5.9%）、ゲノグループIIのみ陽性のものが14検体（16.5%）、ゲノグループＩ及びIIの両方が陽性のものが11検体（12.9%）であった。
【００４８】
2nd PCR産物に陽性を認めたものについて、確認のため、サザンハイブリダイゼーションを行った。すなわち、1st PCR産物を泳動したゲルからPCR産物をメンブランに転写した。55℃でプレハイブリダイゼーションを行い、37℃でハイブリダイゼーションを行った。PCR反応でゲノグループＩにはDIGラベルしたG1/F2、ゲノグループIIにはDIGラベルしたG2/F3のプローブを使用した。ハイブリダイゼーション後、37℃の洗浄液（0.1×SSC, 1%SDS）で２回洗浄を行い、その後DIGラベリングキットの説明書に準じて反応を行った。標識プローブとのハイブリダイゼーションを認めた検体をＳＲＳＶ陽性（G1、G2又はG1G2混合）とした。この結果、陽性検体の全てがサザンハイブリダイゼーションにより確認された。
【００４９】
PCR産物の電気泳動によるバンドの確認では、非特異的なバンドはほとんど認められず、目的とするバンドのみ検出された。1st PCR反応後の泳動において、目的バンドが肉眼で確認されない検体でも、2nd PCR反応で目的バンドを確認できるものは全て1st PCR産物のハイブリダイゼーションが陽性であった。
【００５０】
従って、ＳＲＳＶゲノムの特定の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定されたプライマーを用いるＰＣＲにより塩基配列を増幅し、増幅産物の有無を調べることによってＳＲＳＶを検出できることが確認された。
【００５１】
【実施例２】
分子系統解析によるゲノグループ及び遺伝子型の同定
実施例１において、サザンハイブリダイゼーションで陽性を認めた2nd PCR産物は、QIAquick PCRピュリフィケーションキット（QIAGEN）を用いてPCR反応後の未反応のプライマー及びdNTPsを除去し、DNA濃度を5 ng/μlとなるように滅菌蒸留水で調整した。塩基配列の解析は、ゲノグループＩについては、センス側にG1/F2、アンチセンス側にG1/R1のPCRプライマーを用い、ゲノグループIIについては、センス側にG2/F3、アンチセンス側にG2/R1のPCRプライマーを用いて、ダイデオキシターミネーターサイクルシークエンスキット(PERKIN ELMER)により、373A DNAオートシーケンサー(PERKIN ELMER)で塩基配列を決定した。
【００５２】
ＳＲＳＶ塩基配列については１検体、１つの遺伝子型につき、ゲノグループＩはG1/F2の3'末端から23 bpとG1/R1の3'末端から20 bpを除いた230 bpの塩基配列、ゲノグループIIはG2/F3の3'末端から27 bpとG2/R1の3'末端から23 bpを除いた216 bpの塩基配列を決定し、決定領域中に決定不能な塩基や欠損のない塩基配列を分子系統解析に使用した。これらの塩基配列は、ゲノグループＩについては、GenBankにAccession No. M87661で登録されている塩基配列中、塩基番号5400〜5629に相当し、ゲノグループIIについては、GenBankにAccession No. X86557で登録されている塩基配列中、塩基番号5127〜5342に相当する。この解析した塩基配列について、すでにヒトから検出されたＳＲＳＶの、GenBank又はEMBLに登録されている塩基配列の相当する領域の塩基配列とともに、分子系統解析を行い、ゲノグループ及び遺伝子型の同定を行った。
【００５３】
系統樹は、2-パラメーター法を用いたUPGMA法、N-J法(SINCA, FUJITSU)のソフトを用いて作成し、作成された系統樹の確かさについてはBootstrap法(SINCA)を用いて系統的評価を行った。
【００５４】
塩基配列の決定の結果、ゲノグループＩでは16検体のうち１検体、ゲノグループIIでは25検体のうち６検体のそれぞれが塩基配列の決定が完全にはできなかった。これらは、解析した塩基配列チャートにおいて二つ以上の塩基の同程度のピークが同じ部位で重なっていた。
【００５５】
実施例１で得られた陽性検体から得られた塩基配列と、上記ヒト由来のＳＲＳＶの塩基配列とを用いて系統樹を作成した（図２）。図２中、検体由来のものには下線が付してある。この結果、ゲノグループのＩとIIは１００％の確率で分類された。そして、ブーツストラップ法で分類される確率を８０％とした場合、実施例１においてゲノグループＩで陽性であった16検体は、ノーウォーク型１検体、サウスアンプトン型４検体、チバ型10検体、及び、型が未定のHjgl１検体に分類された。同様に、ゲノグループIIで陽性であった25検体のうち、解析に用いた19検体は、メキシコ型15検体、47型２検体及びハワイ型２検体に分類された。
【００５６】
従って、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２領域中の５’末端側の特定の領域の塩基配列に基づいて分子系統分析を行うことによってＳＲＳＶの遺伝子型が同定できることが確認された。また、ゲノグループに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うＳＲＳＶの検出方法により、ゲノグループ分類も可能であることが確認された。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によって、食品中のウイルスなどの微量のウイルスも検出可能である、迅速で高率にＳＲＳＶを検出する方法が提供される。また、迅速で簡便なＳＲＳＶの遺伝子型の同定方法が提供される。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＲＳＶの遺伝子構造とプライマーの位置の関係を示す。
【図２】 分子系統解析の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、小型球形ウイルスの検出方法及び遺伝子型同定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
小型球形ウイルス（small round structured virus; ＳＲＳＶ）は非細菌性の下痢症や急性胃腸炎の患者から検出されている(J. Clin. Microbiol. 32: 642-648(1994); J. Clin. Microbiol. 27: 1728-1733 (1989))。このウイルスは約7,500 bpのプラス一本鎖のＲＮＡウイルスであり、その電子顕微鏡像は直径35〜40 nmである(Science 259: 516-519 (1993); Science 250: 158-1583 (1990))。プロトタイプはノーウォークウイルスで、1968年に米国オハイオ州ではじめて分離され、1972年に免疫電顕下でその形態が明らかになった(J. Virol. 10: 1075-1081 (1972))。したがって、形態学的にノーウォークウイルスに似ているが、抗原的に異なるＳＲＳＶはノーウォーク様ウイルスと総称されている。ＳＲＳＶの遺伝子構造については、5'末端から非構造タンパク質、構造タンパク質、機能不明タンパク質をそれぞれコードするＯＲＦ１(5.4 kb)、ＯＲＦ２(1.6 kb)、ＯＲＦ３(0.6 kb)が同定されている(Science 259: 516-519 (1993); Science 250: 158-1583 (1990))。ＳＲＳＶは、ゲノグループＩ（ノーウォーク様(Norwalk-like)）、ゲノグループII（スノーマウンテン様(Snow mountain-like)）、クラシカルヒトカリシウイルス(classical human calicivirus)（サッポロ様(Sapporo-like)）の３種のグループに分類される。
【０００３】
日本において1990年から５年間で908件の非細菌性胃腸炎集団発生事例があり、360件で原因ウイルスが同定され、うち330件がＳＲＳＶ陽性であったことが報告されている。また、1997年1月から11月までに非細菌性胃腸炎集団発生事例で198件の報告があり、不明43件を除く152件が食品媒介とされ、うち71件からＳＲＳＶが検出されている(Infectous Agents Surveillance Report. 19: 1-6 (1998))。
【０００４】
現在、ＳＲＳＶの検出には、主として、発症した患者糞便を試料として酵素抗体法あるいは免疫顕微鏡による検出方法が行われている。酵素抗体法は、ＳＲＳＶの多様な血清型に対応するだけの抗体が必要であり、今後血清型の増加が予測されることから検査としての実用性は低いと考えられる。また、電子顕微鏡による検出は実施できる施設が限られることや大量処理への対応が難しいことがあり、実用性は低いと考えられる。
【０００５】
また、ＳＲＳＶは食品を媒介してヒトに非細菌性の下痢症や胃腸炎を広域に集団で引き起こす危険性があることから、その予防として感染前に原因となり得る食品から微量のウイルスを迅速にかつ高率に検出できる方法を確立する必要性がある。しかしながら、ＳＲＳＶの感染源が食品の場合、そのウイルス量は糞便に比べごく微量であると考えられることから、糞便を試料とする検出方法と同様の方法ではＳＲＳＶが検出されない可能性が考えられる。
【０００６】
最近、試料中のウイルス量が微量でも測定可能な方法として、目的とする遺伝子断片を増幅させて検出するＰＣＲ(polymerase chain reaction)法に基づく検出がＳＲＳＶについても報告されている。その増幅プライマーは主にＯＲＦ１(open reading frame 1)に存在するRdRp(RNA-dependent RNA polymerase)領域の一部を増幅させる設定となっている(J. Clin. Microbiol. 30: 2529-2534 (1992); Arch. Virol. 135: 185-192 (1994); J. Clin. Microbiol. 33: 64-71 (1995); J. Clin. Microbiol. 35: 570-577 (1997); Microbiol. Immunol. 42: 439-446 (1998))。
【０００７】
また、現在、ＳＲＳＶについては培養細胞あるいは実験動物を用いての分離増殖法は全くなく、ヒトからのウイルスの同定方法としては、患者糞便を試料とした酵素抗体法、電子顕微鏡法あるいはウェスタンブロットを用いた方法が主に行われている(J. Med. Virol. 2: 97-108 (1987); J. Med. Virol. 17: 127-133 (1985); J. Clin. Microbiol. 22: 274-278 (1985); J. Clin. Microbiol. 24: 456-459 (1986)); J. Clin. Microbiol. 10: 730-736 (1979))。しかし、抗体を用いる方法は、ＳＲＳＶの多様な血清型に対応するだけの抗体が必要であり、また、電子顕微鏡による方法は実施できる施設が限られ、大量処理への対応が難しいなどの問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、すでに報告されているＳＲＳＶの塩基配列を比較した結果、ＯＲＦ１には塩基配列の変異が多く、ＯＲＦ１の塩基配列に基づく従来のプライマーによるＰＣＲ検出法には、偽陰性を与える可能性が高いなどの改善すべき点があることを見い出した。
【０００９】
従って、本発明は、上記の様な問題点のないＳＲＳＶの検出方法を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ＳＲＳＶの遺伝子型の迅速かつ簡便な同定法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＯＲＦ１の３’末端を含む領域からＯＲＦ２の５’末端領域までを含む塩基配列中の、ゲノグループＩ及びIIのそれぞれにおいて保存されている領域の塩基配列に基づいて設定したプライマー、特に、ゲノグループ毎に検出するための逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)反応用のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＳＲＳＶを特異的に検出できること、及び、ＯＲＦ２の５’末端領域の塩基配列に基づいて系統分析を行うことにより、ＳＲＳＶの遺伝子型を同定できることを見い出し、本発明を完成した。
【００１２】
従って、本発明は、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の検出方法であって、前記ＰＣＲで用いられるプライマーが、ＳＲＳＶゲノムのオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）領域の３’末端約３０ｂｐ及びＳＲＳＶゲノムのオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）の５’末端約２０ｂｐを含む領域において保存されている塩基配列に基づいて設定された第１プライマー、並びに、ＯＲＦ２の５’末端から数えて塩基番号約２９２〜約３１３の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定された第２のプライマーであり、第１のプライマー及び第２のプライマーはその間の塩基配列を増幅できるように設定されていることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法（本発明検出方法）を提供する。
【００１３】
本発明検出方法において、好ましくは、ｃＤＮＡの合成が配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられるか、あるいは、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられる。
【００１４】
本発明は、また、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２領域の、５’末端から数えて塩基番号約１〜約３００の範囲内から選ばれる、分子系統解析によりＳＲＳＶの遺伝子型が同定できる塩基配列に基づいて分子系統解析を行うことにより、ＳＲＳＶの遺伝子型を同定することを特徴とするＳＲＳＶの遺伝子型の同定方法（本発明同定方法）を提供する。
【００１５】
本発明同定方法において、好ましくは、分子系統解析の対象となる塩基配列は、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし、上記塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物の塩基配列を決定することによって得られたものである。さらに、好ましくは、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとを用いられるか、あるいは、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられ、第２段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーとが用いられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明検出方法
本発明検出方法は、ＳＲＳＶを高感度且つ特異的に検出することを可能にする方法、すなわち、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、ＳＲＳＶの検出方法であって、前記ＰＣＲで用いられるプライマーが、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ１領域の３’末端約３０ｂｐ及びＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２の５’末端約２０ｂｐを含む領域において保存されている塩基配列に基づいて設定された第１プライマー、並びに、ＯＲＦ２の５’末端から数えて塩基番号約２９２〜約３１３の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定された第２のプライマーであり、第１のプライマー及び第２のプライマーはその間の塩基配列を増幅できるように設定されていることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法である。
【００１７】
試料は、ＳＲＳＶを含むか又は含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例としては、臨床材料、これらの臨床材料より分離されたウイルス培養液、及び、カキなどの食品を挙げることができる。これらの試料からのＲＮＡの調製は、抽出等の公知の方法により行うことができる。また、ＲＮＡからの逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成方法も公知である。ＰＣＲは、このｃＤＮＡを鋳型とし、公知のＰＣＲの方法に従って行うことができる。ｃＤＮＡの合成には、同一の反応系でｃＤＮＡの合成及びその後のＰＣＲによる増幅ができるため、第１のプライマーおよび第２のプライマーのうちＲＮＡに相補的なものを使用することが好ましい。
【００１８】
第１のプライマー及び第２のプライマーは、その間の塩基配列を増幅できるように、すなわち、センスプライマーとアンチセンスプライマーとなるように設定される。
【００１９】
第１のプライマーは、好ましくは、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ１領域の３’末端約３０ｂｐ及びＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２の５’末端約２０ｂｐを含む領域において保存されている塩基配列に基づいて設定される。第２のプライマーは、好ましくは、ＯＲＦ２の５’末端から数えて塩基番号約２９２〜約３１３の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定される。
【００２０】
上記特定の領域中の保存されている塩基配列の選択およびプライマーの設定は、既知のＳＲＳＶのゲノムの塩基配列を参考にして当業者に公知の方法で行えばよい。保存されている塩基配列の選択及びプライマーの設定は、コンピューター検索に基づいて行うことでより効率的となる。
【００２１】
プライマーは、ＳＲＳＶのゲノグループ毎に特異的に設定してもよい。このようにすると、プライマー中の塩基の変異が少なくなり特異性を高めることができ、また、ＰＣＲ増幅産物の塩基配列を解読しなくても、ＰＣＲ増幅産物の検出のみで迅速にゲノグループの判定ができる。
【００２２】
プライマーは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの一方又は両方について、複数のプライマーを混合したミックスプライマーとして設定してもよい。プライマー設定部分に塩基の変異が存在する場合には、ミックスプライマーを用いることで検出効率を上げることができる。
【００２３】
上記プライマーの好ましい例としては、ゲノグループＩの場合には、配列番号１又は３に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ、ゲノグループIIの場合には、配列番号４又は６に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００２４】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、ゲノグループＩの場合には、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。また、ゲノグループIIの場合には、例えば、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００２５】
試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし、上記プライマーを用いるＰＣＲは、公知の方法に従って行うことができ、逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)により同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行ってもよい。この場合、ＰＣＲで使用するプライマーのうちＲＮＡに相補的なものを逆転写酵素による反応に用いることが好ましく、例えば上記の２段階ＰＣＲを採用するのであれば、それぞれ、配列番号１に示すプライマー及び配列番号４に示すプライマーが使用される。
【００２６】
増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド染色などの公知の分析方法で行うことができる。通常には、ＳＲＳＶゲノムの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を検出する。
【００２７】
＜２＞本発明同定方法
本発明同定方法は、ＳＲＳＶの遺伝子型を同定するために、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２領域の、５’末端から数えて塩基番号約１〜約３００の範囲内から選ばれる、分子系統解析によりＳＲＳＶの遺伝子型が同定できる塩基配列（以下ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列ともいう）に基づいて分子系統解析を行うことを特徴とする。
【００２８】
ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を得る方法は特に限定されないが、遺伝子型の未同定のＳＲＳＶを含む試料からＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を得る場合には、以下の方法によることが好ましい。すなわち、試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物の塩基配列決定を行う方法である。試料からのＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの調製、及びＰＣＲは、上記本発明検出方法について説明した様にして行うことが可能である。
【００２９】
ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を含む塩基配列を増幅できるように設定されたプライマーの好ましい例としては、ゲノグループＩについては、配列番号１又は３に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられ、ゲノグループIIについては、配列番号４又は６に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーが挙げられる。
【００３０】
ＰＣＲによる増幅は２段階で行ってもよく、ゲノグループＩの場合には、例えば、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。また、ゲノグループIIの場合には、例えば、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第１回目のＰＣＲを行った後、配列番号４に示す塩基配列を有するプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーを用いて第２回目のＰＣＲを行ってもよい。２段階の増幅を行うことによって、一層特異的に目的の塩基配列を増幅することが可能になる。
【００３１】
逆転写ＰＣＲ(RT-PCR)により同一反応系でｃＤＮＡの取得及びＤＮＡの増幅を行う場合には、ＰＣＲで使用するプライマーのうちＲＮＡに相補的なものを逆転写酵素による反応に用いることが好ましく、例えば上記の２段階ＰＣＲを採用するのであれば、それぞれ、配列番号１に示すプライマー及び配列番号４に示すプライマーが使用される。
【００３２】
増幅産物の取得は、アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルから切り出して抽出精製するなどの公知の方法で行うことができる。通常には、ＳＲＳＶゲノムの既知の塩基配列と、用いたプライマーの塩基配列とから予測できる長さの増幅産物を取得する。
【００３３】
増幅産物の塩基配列の決定は公知の方法によって行うことができる。決定された塩基配列の内、ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列を分子系統解析に用いる。ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列は、分子系統解析において有意な結果が得られる部分であり、分子系統解析の対象とする遺伝子型の範囲などに依存して上記の範囲で変動し得るものであるが、適切な部分を選択することは当業者であれば容易である。例えば、ゲノグループＩの分子系統解析の場合には、GenBankにAccession No. M87761で登録されている塩基配列中、塩基番号5400〜5629の230bpの塩基配列及び塩基番号5441〜5627の187bpの塩基配列が挙げられ、ゲノグループIIの場合には、GenBankにAccession No. X86557で登録されている塩基配列中、塩基番号5127〜5342の216bpの塩基配列及び塩基番号5156〜5342の187bpの塩基配列が挙げられる。
【００３４】
本発明同定方法において、ＯＲＦ２Ｎ末領域の塩基配列に基づく分子系統解析は、公知の分子系統解析法によって行うことができる。このような方法としては、Higgins法、ならびに、２−パラメーター法を用いたUPGMA法及びN-J法などが挙げられ、また、これらの方法により分子系統解析を行うためのソフトウェアが市販されている（DNASIS(日立ソフトウェアエンジニアリング)、SINCA(富士通)など）。
【００３５】
遺伝子型は、分子系統解析においてそれぞれの遺伝子型の標準株と一定値以上のホモロジーを示す、又は、一定値以上の確率で他の遺伝子型のクラスターと区別されるか否かによって決定できる。一定値とは、分子系統解析により得られた系統樹において各遺伝子型に属する株がそれぞれ単一のクラスターを形成するような値であればよい。例えば、ブーツストラップ法において１００％の確率で交差することなく単一の遺伝子がたのクラスターを形成するような値である。より具体的には８０％という値が挙げられる。
【００３６】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、下記実施例は本発明について具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明の範囲が何ら限定されるものではない。
【００３７】
【実施例１】
ＳＲＳＶの検出
（１）プライマーの設定
プライマーは、すでにヒトから検出されているＳＲＳＶのゲノムの塩基配列としてGenBank又はEMBLに登録されている塩基配列（DS395: U04469, NV: M87661, KY-89/89/J: L23829, SOV: L07418, BR: X76716, LD: X86557, CW: U46500, TV: U02030, OTH-25/89/J: L23830, MX: U22498, AL: U46039, SMA: L23831, HW: U07611, MS: X81879, MI1/94/Japan: AB005259）を用いて設定した。
【００３８】
すなわち、ゲノグループＩのプライマーについては、DS395、NV、KY-89/89/J及びSOVの塩基配列に基づいて、アンチセンスプライマー(G1/R1)5'CCAACCCARCCATTRTACATTT3'（配列番号１）、第１回ＰＣＲ(1st PCR)反応用にセンスプライマー(G1/F1)5'CTGCCCGAATTYGTAAATGAT3'（配列番号２）、及び、第２回ＰＣＲ(2nd PCR)反応用にG1/F1よりも内側のセンスプライマー(G1/F2)5'AATGATGATGGCGTCTAAGGA3'（配列番号３）を合成した。また、ゲノグループIIのプライマーについては、BR、LD、CW、TV、OTH-25/89/J、MX、AL、SMA、HW、MS、MI1/94/Japanの塩基配列に基づいて、アンチセンスプライマー(G2/R1)5'TGCATAACCATTRTACATTCT3'（配列番号４）、1st PCR反応用にセンスプライマー(G2/F1)5'GTGGGAGGGCGATCGCAATCT3'（配列番号５）、及び、2nd PCR反応用にG2/F1より内側のセンスプライマー(G2/F3)5'TTGTGAATGAAGATGGCGTCGA3'（配列番号６）の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。ＳＲＳＶの遺伝子構造とプライマーの位置の関係は図１に示す通りである。
【００３９】
なお、G1/F1、G1/R1及びG1/F2の塩基配列は、GenBankにAccession No. M87661で登録されている塩基配列において、それぞれ、塩基番号5342〜5362、5671〜5650及び5357〜5377の塩基配列に相当する。また、G2/F1、G2/R1及びG2/F3の塩基配列は、GenBankにAccession No. X86557で登録されている塩基配列において、それぞれ、塩基番号5047〜5067、5384〜5364及び5079〜5100の塩基配列に相当する。
【００４０】
これらのプライマーを用いることで、ゲノグループＩ（DS395、NV、KY-89/89/J及びSOV）については、M87661の塩基配列中、塩基番号5242〜5671に相当する塩基配列が増幅されるようにプライマーを設定した。ゲノグループII（BR、LD、CW、TV、OTH-25/89/J、MX、AL、SMA、HW、MS、MI1/94/Japan）については、X86557の塩基配列中、塩基番号5047〜5384に相当する塩基配列が増幅される。
【００４１】
また、G1/F2及びG2/F3はサザンハイブリダイゼーションを行うためのプローブとして使用するため、DIGラベリングを行った。
【００４２】
（２）食品（カキ）からのＳＲＳＶの検出
カキは、日本におけるＳＲＳＶ感染源の一つと考えられているため、試料として選択した。５個のカキ中腸腺を摘出しプールして１検体とした。これと等量のＴＥ（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)、和光純薬）を加え、ストマッカーによりホモジナイジングして50%乳濁液を調製し、これを50 mlチューブに移し、４℃、3500 rpmで35分間遠心した。遠心上清2 mlを50 mlチューブに分注し、8 mlのＴＥを加え、10%乳濁調製液とし、10 mlのHCFC-141b（ダイキン工業）を加え混合し、４℃、3500 rpmで35分間遠心した。Opti Seal（BECKMAN）に500 μlの30%スクロースを分注し、HCFC-141b処理した調製液4 mlを重層して、４℃、40000 rpmで２時間の超遠心を行い、沈殿物に200μlのＴＥを分注して沈殿物を溶解した。溶解液500μlを、スマイテスト-R Kit（住友金属工業）と50μlのCHCl3をネジ式キャップの1.5 mlチューブに分注したRNA抽出液に添加し、キットの使用法に準じてRNAを抽出した。カキのホモジェネートをHCFC-141b処理及び30%ショ糖密度勾配を用いた超遠心に付して精製してから、ＲＮＡ抽出用キット試薬を使用することで、ｃＤＮＡ合成とＰＣＲの阻害物質が除去できる。
【００４３】
抽出し、乾固したRNAに、60μlのRNaseインヒビター（40 U/μl）混合ＴＥを加え溶解後、別々のチューブに溶解液10μlを分注し、100 pmol/μlに調製したG1/R1又はG2/R1を、溶解液10μlを分注したチューブに1μl添加して混合後、100℃で２分間加熱し氷中にて急冷した。これに、10×TaqGold Buffer 2μl、10 mM dNTPs 2μl、200 U/μlのM-MLV由来の逆転写酵素１μl、40 U/μlのRNaseインヒビター１μl及び滅菌蒸留水３μlを加え、37℃で60分間の反応条件でcDNAを合成した。合成したcDNAをゲノグループＩについては10×TaqGold Buffer 4.5μl、10 mM dNTPs 0.5μl、100 pmol G1/F1 0.5μl、100 mM G1/R1 0.25μl、5 U/μl TaqGold 0.25μl、滅菌蒸留水39μlを混合したPCR反応液に5μl添加して1st PCRを行った。PCR反応の条件は95℃で15分間加熱し、次いで94℃１分、55℃２分、72℃３分の反応を40回行い、その後72℃で７分間加熱した。また、ゲノグループIIについてはG1/F1をG2/F1に、G1/R1をG2/R1に代えて、同様に行った。
【００４４】
ゲノグループＩの2nd PCRでは、10×TaqGold Buffer 4.5μl、10 mM dNTPs １μl、100 pmol/μl G1/F2 0.5μl、100 pmol/μl G1/R1 0.5μl、5 U/μl TaqGold 0.25μl、滅菌蒸留水39μlを混合した反応液に1st PCR産物5μlを添加した。ゲノグループIIについてはG1/F2をG2/F3で、G1/R1をG2/R1に代えて同様に行った。2nd PCRの条件は1st PCRの反応条件であった。
【００４５】
検体にＳＲＳＶが存在した場合、ゲノグループＩの1st PCRでは333 bp、2nd PCRでは318 bpのPCR産物が得られ、ゲノグループIIの1st PCRでは338 bp、2nd PCRでは300 bpのPCR産物が得られる。
【００４６】
PCR反応液はゲノグループごとに3%アガロースゲルで電気泳動を行いエチジウムブロマイドで核酸染色し、紫外線によりPCR増幅産物を検出した。
【００４７】
本実施例で用いた５個のカキ中腸腺をプールしてこれを１検体としたカキ８５検体において全体の35.3%が陽性であった。陽性検体の内訳は、ゲノグループＩのみ陽性のものが５検体（5.9%）、ゲノグループIIのみ陽性のものが14検体（16.5%）、ゲノグループＩ及びIIの両方が陽性のものが11検体（12.9%）であった。
【００４８】
2nd PCR産物に陽性を認めたものについて、確認のため、サザンハイブリダイゼーションを行った。すなわち、1st PCR産物を泳動したゲルからPCR産物をメンブランに転写した。55℃でプレハイブリダイゼーションを行い、37℃でハイブリダイゼーションを行った。PCR反応でゲノグループＩにはDIGラベルしたG1/F2、ゲノグループIIにはDIGラベルしたG2/F3のプローブを使用した。ハイブリダイゼーション後、37℃の洗浄液（0.1×SSC, 1%SDS）で２回洗浄を行い、その後DIGラベリングキットの説明書に準じて反応を行った。標識プローブとのハイブリダイゼーションを認めた検体をＳＲＳＶ陽性（G1、G2又はG1G2混合）とした。この結果、陽性検体の全てがサザンハイブリダイゼーションにより確認された。
【００４９】
PCR産物の電気泳動によるバンドの確認では、非特異的なバンドはほとんど認められず、目的とするバンドのみ検出された。1st PCR反応後の泳動において、目的バンドが肉眼で確認されない検体でも、2nd PCR反応で目的バンドを確認できるものは全て1st PCR産物のハイブリダイゼーションが陽性であった。
【００５０】
従って、ＳＲＳＶゲノムの特定の領域に保存されている塩基配列に基づいて設定されたプライマーを用いるＰＣＲにより塩基配列を増幅し、増幅産物の有無を調べることによってＳＲＳＶを検出できることが確認された。
【００５１】
【実施例２】
分子系統解析によるゲノグループ及び遺伝子型の同定
実施例１において、サザンハイブリダイゼーションで陽性を認めた2nd PCR産物は、QIAquick PCRピュリフィケーションキット（QIAGEN）を用いてPCR反応後の未反応のプライマー及びdNTPsを除去し、DNA濃度を5 ng/μlとなるように滅菌蒸留水で調整した。塩基配列の解析は、ゲノグループＩについては、センス側にG1/F2、アンチセンス側にG1/R1のPCRプライマーを用い、ゲノグループIIについては、センス側にG2/F3、アンチセンス側にG2/R1のPCRプライマーを用いて、ダイデオキシターミネーターサイクルシークエンスキット(PERKIN ELMER)により、373A DNAオートシーケンサー(PERKIN ELMER)で塩基配列を決定した。
【００５２】
ＳＲＳＶ塩基配列については１検体、１つの遺伝子型につき、ゲノグループＩはG1/F2の3'末端から23 bpとG1/R1の3'末端から20 bpを除いた230 bpの塩基配列、ゲノグループIIはG2/F3の3'末端から27 bpとG2/R1の3'末端から23 bpを除いた216 bpの塩基配列を決定し、決定領域中に決定不能な塩基や欠損のない塩基配列を分子系統解析に使用した。これらの塩基配列は、ゲノグループＩについては、GenBankにAccession No. M87661で登録されている塩基配列中、塩基番号5400〜5629に相当し、ゲノグループIIについては、GenBankにAccession No. X86557で登録されている塩基配列中、塩基番号5127〜5342に相当する。この解析した塩基配列について、すでにヒトから検出されたＳＲＳＶの、GenBank又はEMBLに登録されている塩基配列の相当する領域の塩基配列とともに、分子系統解析を行い、ゲノグループ及び遺伝子型の同定を行った。
【００５３】
系統樹は、2-パラメーター法を用いたUPGMA法、N-J法(SINCA, FUJITSU)のソフトを用いて作成し、作成された系統樹の確かさについてはBootstrap法(SINCA)を用いて系統的評価を行った。
【００５４】
塩基配列の決定の結果、ゲノグループＩでは16検体のうち１検体、ゲノグループIIでは25検体のうち６検体のそれぞれが塩基配列の決定が完全にはできなかった。これらは、解析した塩基配列チャートにおいて二つ以上の塩基の同程度のピークが同じ部位で重なっていた。
【００５５】
実施例１で得られた陽性検体から得られた塩基配列と、上記ヒト由来のＳＲＳＶの塩基配列とを用いて系統樹を作成した（図２）。図２中、検体由来のものには下線が付してある。この結果、ゲノグループのＩとIIは１００％の確率で分類された。そして、ブーツストラップ法で分類される確率を８０％とした場合、実施例１においてゲノグループＩで陽性であった16検体は、ノーウォーク型１検体、サウスアンプトン型４検体、チバ型10検体、及び、型が未定のHjgl１検体に分類された。同様に、ゲノグループIIで陽性であった25検体のうち、解析に用いた19検体は、メキシコ型15検体、47型２検体及びハワイ型２検体に分類された。
【００５６】
従って、ＳＲＳＶゲノムのＯＲＦ２領域中の５’末端側の特定の領域の塩基配列に基づいて分子系統分析を行うことによってＳＲＳＶの遺伝子型が同定できることが確認された。また、ゲノグループに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うＳＲＳＶの検出方法により、ゲノグループ分類も可能であることが確認された。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によって、食品中のウイルスなどの微量のウイルスも検出可能である、迅速で高率にＳＲＳＶを検出する方法が提供される。また、迅速で簡便なＳＲＳＶの遺伝子型の同定方法が提供される。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＲＳＶの遺伝子構造とプライマーの位置の関係を示す。
【図２】 分子系統解析の結果を示す。
Claims (4)
- 試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、ゲノグループＩの小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の検出方法であって、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、前記ＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２又は３に示す塩基配列を有するプライマーとを用いることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法。
- 試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、ゲノグループＩの小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の検出方法であって、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、前記ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示す塩基配列を有するプライマーとを用い、第２段階のＰＣＲに配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号３に示す塩基配列を有するプライマーとを用いることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法。
- 試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、ゲノグループIIの小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の検出方法であって、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、前記ＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号５又は６に示す塩基配列を有するプライマーとを用いることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法。
- 試料から得られるＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、これを鋳型として用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲによって生成する増幅産物を検出することを含む、ゲノグループIIの小型球形ウイルス（ＳＲＳＶ）の検出方法であって、前記ｃＤＮＡの合成が配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーを用いて行われ、かつ、前記ＰＣＲが２段階で行われ、第１段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示す塩基配列を有するプライマーとを用い、第２段階のＰＣＲに配列番号４に示す塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示す塩基配列を有するプライマーとを用いることを特徴とするＳＲＳＶの検出方法。
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