KR20060017212A - 코로나바이러스 검출용 프로브 조성물, 프라이머 혼합물및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 코로나바이러스 검출용 프로브 조성물과 프라이머 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, SARS 바이러스의 리더서열과 N 단백질을 코딩하는 염기서열을 검출의 표적으로 이용하여 SARS 바이러스를 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, SARS 바이러스의 리더서열 또는 N 단백질을 코딩하는 염기서열 유래의 프로브 조성물과 프라이머 및 상기 프로브 조성물 또는 상기 프라이머를 이용하여 사스 바이러스를 효과적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 코로나바이러스 검출용 프라이머와 하이힐 프라이머를 조합하여 사용할 경우, SARS 바이러스의 리더서열 또는 N 단백질을 코딩하는 염기서열만을 특이적으로 증폭할 수 있어, SARS 바이러스를 포함한 코로나바이러스를 효과적으로 검출하는 것이 가능하다.
사스, 코로나바이러스, 역전사, 특이적 증폭, 리더서열, N 단백질
Description
도 1은 감염세포에서 코로나바이러스가 복제하는 기작을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 제1구현예에 따른 하이힐(high-heel) 프라이머를 이용한 SARS 바이러스 리더서열(leader sequence)의 특이적 증폭과정을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 제2구현예에 따른 하이힐 프라이머를 이용한 SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 특이적 증폭과정을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 제1구현예에 따른 프라이머 혼합물을 이용하여 RT-PCR을 수행한 후 샘플 RNA의 증폭여부를 전기영동으로 확인한 것이다. 레인 M은 사이즈 마커이고, 레인1은 샘플 RNA 자체를, 레인2는 샘플 RNA의 PCR 증폭물을, 레인3은 CH001-F과 CH001-R의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인4는 CH001-F-high 프라이머, CH001-R-high 프라이머 및 하이힐 프라이머로 구성된 프라이머 혼합물을 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인5는 blank를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 제2구현예에 따른 프라이머 혼합물을 이용하여 RT-PCR을 수행한 후 샘플 RNA의 증폭여부를 전기영동으로 확인한 것이다. 레인 M은 사이즈 마커이고, 레인1은 샘플 RNA 자체를, 레인2는 샘플 RNA의 PCR 증폭물을, 레인3은 CH003-F과 CH003-R의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인4는 CH003-F-high 프라이머, CH003-R-high 프라이머 및 하이힐 프라이머로 구성된 프라이머 혼합물을 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인5는 blank를 나타낸다.
발명의 분야
본 발명은 코로나바이러스 검출용 프로브 조성물과 프라이머 및 이를 이용한 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, SARS 바이러스의 리더서열과 N 단백질을 코딩하는 염기서열을 검출의 표적으로 이용하여 SARS 바이러스를 효과적으로 검출할 수 있도록 고안된, SARS 바이러스의 리더서열 또는 N 단백질을 코딩하는 염기서열 유래의 프로브 조성물과 프라이머 및 상기 프로브 조성물 또는 상기 프라이머를 이용하여 사스 바이러스를 효과적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
중증급성 호흡기 증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)는 2002년 11월부터 중국 광동지역을 중심으로 발생하여 홍콩, 싱가포르, 캐나다 등 전세 계로 확산되고 있는 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등을 보이는 증후군이다. SARS는 변종 사스 코로나바이러스가 원인 병원체로 알려져 있다.
이 바이러스 감염으로 인한 임상적 증상은 일반 감기바이러스 감염에 의한 증상과 유사하나, 조기에 검출되지 않는다면 생명이 위험해 질 수 있을 만큼 치명적인 바이러스이다.
일반적으로 바이러스를 분석하는 데는 다음과 같은 방법이 사용되고 있다.
첫째는 HCV 유전자형에 특이성을 지닌 프라이머를 사용하는 SSP-PCR이다. 이는 코어(core) 부위에서 여러 유전자형에 특이한 프라이머를 조합하여 RT-PCR을 실시하는 것으로, RT-PCR 후에 바로 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나, 프라이머 인식부위에 돌연변이가 발생하거나 새로운 형에 대하여서는 검출이 곤란하는 단점이 있다.
둘째는 5'UTR 부위를 RT-PCR로 증폭하고 제한효소를 사용하는 PCR-RFLP 법(Park et al., J. Med. Microbiol. 47: 1998)인데, 간단하고 쉽게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있으나, 사용하는 제한효소가 변이 부분을 인식하지 못할 경우, 분석이 곤란하다는 단점이 있다.
셋째는 5'UTR 부위를 RT-PCR로 증폭하여 유전자형에 특이한 올리고뉴클레오티드 프로브가 붙어있는 필터와 교잡반응을 시키는 것이다. 이것은 프로브의 종류에 따라 정확한 결과를 얻을 수 있으나, 필터를 사용함에 따라서 많은 수의 프로브를 찍는데 한계가 있으며, 하나의 필터에서 한명만을 분석해야 하기 때문에 많은 검체를 처리하고 분석하는데 있어 시간과 노동력이 많이 소모가 된다.
SARS 바이러스는 약 29kb 정도의 RNA를 유전물질로 포함하고 있는 호흡기 바이러스로, 코로나바이러스(coronnavirus)의 변종 바이러스인데 코로나바이러스는 세포에 감염되면 약 6-10개의 subgenomic RNA를 만들어낸다 (도 1).
도 1에 나타낸 바와 같이, 코로나바이러스는 세포내에서 복제될 때, 72bp에 해당하는 리더서열(leader sequence)이 각 subgenomic RNA의 5' 말단에 결합하는 리더 조인(leader joining) 현상이 일어난다. 이 리더서열은 세포내에서 가장 복제수가 높으며, N 단백질을 코딩하는 subgenomic RNA의 복제수가 그 다음으로 높다.
따라서 코로나바이러스의 효과적인 검출을 위해서는 리더서열과 N 단백질 유전자를 검출의 표적으로 이용하는 것이 가장 효과적이다. 이들 염기서열은 알려진 모든 SARS 바이러스에 공통적으로 존재하기 때문에 현재까지 알려진 모든 SARS 바이러스를 검출할 수 있다.
이에 본 발명자들은 SARS 바이러스의 리더서열과 N 단백질을 코딩하는 염기서열 유래의 프로브 및 프라이머를 고안하고, 상기 프라이머와 하이힐 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 SARS 바이러스를 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 감염성 바이러스인 SARS 바이러스를 포함하는 코로나바이러스의 검출용 프로브 조성물 및 프라이머를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 조성물 또는 상기 프라이머를 이용하여 사스 바이러스를 포함한 코로나바이러스를 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제1구현예로, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 리더서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래된 10bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는 코로나 바이러스 검출용 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 제1구현예는 또한, 코로나바이러스 감염 의심환자의 임상샘플에서 유래된 핵산을 상기 프로브 조성물과 하이브리다이제이션시키는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 제1구현예는 또한, 상기 프로브 조성물이 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 검출용 DNA 칩 및 상기 DNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 제1구현예는 또한, (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 리더서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호 1의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 제1구현예는 또한, (a) 하이힐 프라이머에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 리더서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머; 및 (b) 하이힐 프라이머에 서열번호 1의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트에 있어서, (a)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 가지고, (b)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 제1구현예는 또한, 상기 프라이머 세트와 하이힐 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 혼합물 및 상기 프라이머 혼합물을 이용하여 코로나바이러스 감염 의심환자 유래의 임상샘플에서 추출된 RNA를 RT-PCR로 증폭하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 제2구현예로, (a) 서열번호 2로 표시되는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래된 10bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는 코로나 바이러스 검출용 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 제2구현예는 또한, 코로나바이러스 감염 의심환자의 임상샘플에서 유래된 핵산을 상기 프로브 조성물과 하이브리다이제이션시키는 것을 특징으로 하 는 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 제2구현예는 또한, 상기 프로브 조성물이 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 검출용 DNA 칩 및 상기 DNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 제2구현예는 또한, (a) 서열번호 2의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호 2의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 제2구현예는 또한, (a) 하이힐 프라이머에 서열번호 2로 표시되는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머; 및 (b) 하이힐 프라이머에 서열번호 2의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트에 있어서, (a)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열을 가지고, (b)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 제2구현예는 또한, 상기 프라이머 세트와 하이힐 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 혼합물 및 상기 프라이머 혼합물을 이용하여 코로나바이러스 감염 의심환자 유래의 임상샘플에서 추출된 RNA를 RT-PCR로 증폭하 는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 제1구현예 및 제2구현예에 있어서, 하이힐 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 것임을 특징으로 할 수 있고, 코로나바이러스는 SARS 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 RT-PCR은 (a) 상기 RNA로부터 역전사를 통하여 cDNA를 합성하는 단계; (b) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 ds-cDNA를 합성하는 단계; 및 (c) 상기 합성된 ds-cDNA를 하이힐 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계를 거치는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 "하이힐 프라이머"라는 용어는 Tm이 약 72℃이고, GC 함량이 70%이상인 올리고뉴클레오티드로 정의한다. 상기 하이힐 프라이머는 65-75℃에서, 바람직하게는 72℃에서 어닐링이 되도록 고안된 프라이머로 RNA의 선형증폭을 효율성을 최대화 하도록 고안된 프라이머이다.
72℃는 또한, DNA 증폭을 위하여 통상적으로 사용되는 Taq 중합효소의 효율이 최대화되는 온도이므로 선형 증폭과정을 최적화시킬 수 있고, 하이힐 프라이머의 어닐링과 합성될 cDNA의 신장(extension)이 동시에 일어날 수 있으므로 시간의 효율성을 높일 수 있어, 비특이적 증폭을 최소화할 수 있다.
본 발명에서, 하이힐 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 것을 사용하였으나, 상기 정의된 바와 같이, Tm이 약 72℃이고, GC 함량이 70%이상인 한, 이에 국한되는 것은 아니다.
서열번호 3: 5'- CGC TGG GCC GAC CGG GCG CGG GAC -3'
제1구현예: SARS 바이러스 리더서열의 특이적 증폭
SARS 바이러스는 RNA 바이러스이므로, 증폭을 위해서는 우선 역전사 방법으로 SARS 바이러스 염기서열에 상보적인 단일가닥 cDNA를 합성한다. 이때 역전사 프라이머는 하이힐 프라이머에 서열번호 4로 표시되는 SARS 리더서열 특이적 프라이머가 조합된 프라이머를 사용한다.
서열번호 4: 5'-gtt cgt tta gag aac aga tct a-3'
상기 합성된 단일가닥(single stranded) cDNA를 SARS 바이러스 리더서열의 효과적인 증폭을 위해서, PCR 반응을 수행한다. 이때 SARS 리더의 전체 크기는 72bp이므로 일반적인 아가로스 겔 전기영동에서는 증폭여부를 확인하기가 어렵다. 또한 SARS 리더서열을 특이적으로 증폭하기 위해서는 증폭반응에서의 주형 어닐링 온도가 높이는 것이 중요하다.
따라서 SARS 리더서열의 특이적 증폭 및 증폭여부의 식별을 용이하게 하기 위하여 PCR 반응에서는 하이힐 프라이머를 포함하는 프라이머 혼합물을 사용한다 (도 2). 도 2는 본 발명에 따른 SARS 리더서열의 특이적 증폭을 나타낸 모식도이다.
본 발명의 제1구현예에 따른 프라이머 혼합물은 다음과 같다.
(1) 하이힐 프라이머: 높은 Tm 값을 갖는 (70℃ 이상) 24bp의 서열번호 3으로 표시되는 것
(2) CH001-R-high 프라이머: 서열번호 3의 하이힐 프라이머에 SARS 바이러스 리더서열의 3' 말단에 해당하는 22bp의 CH001-R 프라이머(서열번호 4)가 연결된 것.
(3) CH001-F-high 프라이머: 서열번호 3의 하이힐 프라이머에 SARS 바이러스 리더서열의 5' 말단에 해당하는 22bp의 CH001-F 프라이머(서열번호 5)가 연결된 것
서열번호 5: 5'-ata tta ggt ttt tac cta ccc a-3'
제2구현예: SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 특이적 증폭
SARS 바이러스는 RNA 바이러스이므로, 증폭을 위해서는 우선 역전사 방법으로 SARS 바이러스 염기서열에 상보적인 단일가닥 cDNA를 합성한다. 이때 역전사 프라이머는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열에 특이적인 프라이머(서열번호 6: CH003-R)와 하이힐 프라이머가 조합된 프라이머(CH003-R-high)를 사용한다.
서열번호 6: 5'-CTC TGC GTA GAA GCC TTT TGG-3'
상기 합성된 단일가닥 cDNA를 SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 효과적인 증폭을 위해서, PCR 반응을 수행한다. 이때 SARS N 단백질의 전체 크기 약 1.7kb 중에 약 188bp 정도에 해당하는 부분을 증폭하도록 프라이머를 제작하였다. 또한 SARS N 단백질을 코딩하는 염기서열을 특이적으로 증폭하기 위해서는 증폭반응에서의 주형과 프라이머 간의 어닐링 온도가 높을수록 유리하다.
따라서 SARS의 특이적 증폭 및 증폭여부의 식별을 용이하게 하기 위하여 PCR 반응에서는 하이힐 프라이머를 포함하는 프라이머 혼합물을 사용한다 (도 3). 도 3 은 본 발명에 따른 하이힐 프라이머를 이용한 SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 특이적 증폭을 나타낸 모식도이다.
본 발명의 제2구현예에 따른 프라이머 혼합물은 다음과 같다.
(1) 하이힐 프라이머: 높은 Tm 값을 갖는 (70℃ 이상) 24bp의 서열번호 3으로 표시되는 것
(2) CH003-R-high 프라이머: 서열번호 3의 하이힐 프라이머에 SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 3'에 해당하는 21bp의 CH003-R 프라이머(서열번호 6)가 연결된 것
(3) CH003-F-high 프라이머: 서열번호 3의 하이힐 프라이머에 SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 5'에 해당하는 21bp의 CH003-F 프라이머(서열번호 7)가 연결된 것
서열번호 7: 5'-ACCTAGGAACT GGCCCAGAAG-3'
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 SARS 바이러스의 리더서열 및 N 단백질을 코딩하는 염기서열에서 유래된 프라이머와 하이힐 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해 코로나바이러스를 검출하는 방법만을 예시하였으나, 리더서열 및 N 단백질을 코딩하는 염기서열을 이용하여 프로브 조성물을 디자인하고, 임상샘플에서 유래된 핵산을 상기 프로브 조성물과 하이브리다이제이션하여 코로나바이러스를 검출하는 것은 당업자게 자명하다 할 것이다. 또한, 상기 프로브 조성물을 기질상에 집적하여 DNA 칩을 제작하고, 이를 이용하여 코로나바이러스를 검출하는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1: SARS 바이러스 리더서열의 특이적 증폭
(1) 역전사에 의한 단일가닥 cDNA의 합성
SARS 바이러스 감염 의심환자의 임상샘플에서 전체 RNA를 추출하였다(인비트로겐(Invitrogen), 트리졸(Trizol) 방법). 추출된 샘플 RNA 1-5㎕에 1㎕의 CH001-R-high 프라이머(2㎍/㎕)를 65℃에서 10분간 인큐베이션하여 어닐링하였다. 어닐링시 반응부피는 15.4㎕이었다. 상기 어닐링한 반응용액에 5X 일차가닥(fisrt strand) 버퍼(Invitrogen) 6㎕, 0.1mM DTT(Invitrogen) 3㎕, 25mM dNTP (Amersham) 0.6㎕, 역전사효소(SuperscriptII, 200U, Invitrogen) 1㎕를 첨가하여 최종 반응용액이 25㎕가 되도록 한 다음, 42℃에 2시간 동안 인큐베이션하였다.
(2) SARS 리더서열의 증폭
SARS 리더서열의 PCR 증폭반응은 하나의 튜브안에서 이루어지도록 디자인하였다. 상기 서열번호 3의 하이힐 프라이머와, CH001-R-high 프라이머 및 CH001-F-high 프라이머를 동시에 넣어주고, 역전사에 의해서 만들어진 단일가닥 리더서열 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 즉, 상기 (1)에서 준비된 역전사 혼합물 2.5㎕에 10X PCR 버퍼(Solgent, Korea) 2.5㎕, Taq 폴리머라제 (5U/㎕, Solgent, Korea) 1㎕, dNTP(2.5mM, Solgent, Korea) 1㎕, CH001-F-high 프라이머(10pmole/㎕) 1㎕, CH001-R-high 프라이머(10pmole/㎕) 1㎕ 및 서열번호 3의 하이힐 프라이머(100pmole/㎕) 1㎕를 첨가하여 최종 반응부피가 25㎕가 되도록 한 다음 PCR[(94℃에서 10분, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 30초) 1 내지 4 싸이클]을 수행하였다. 상기 PCR시 CH001-R-high와 CH001-F-high 프라이머에 의해 2차적인 PCR에 필요한 주형이 만들어진다.
그 후 서열번호 3의 하이힐 프라이머를 이용하여 증폭반응[(94℃에서 1분, 72℃에서 45초) 35 내지 40 싸이클 수행 및 72℃에서 최종신장(final extension) 10분]을 수행하였다. 상기 증폭반응에서, SARS 리더서열(72bp)를 포함하는 약 120bp의 증폭산물이 특이적으로 만들어진다. 상기 증폭산물이 특이적으로 만들어지는 것을 확인하기 위하여 전기영동을 수행하였다 (도 4).
도 4는 총 25㎕의 반응용액 중 5㎕를 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동한 사진이다. 레인 M은 사이즈 마커이고, 레인1은 샘플 RNA 자체를, 레인2는 샘플 RNA의 PCR 증폭물을, 레인3은 CH001-F과 CH001-R의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인4는 CH001-F-high 프라이머, CH001-R-high 프라이머 및 하이힐 프라이머로 구성된 프라이머 혼합물을 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인5는 blank를 나타낸다.
도 4에 나타난 바와 같이, RNA 자체(레인 1) 또는 RNA 자체를 PCR한 경우(레인 2)에는 PCR 산물이 만들어지지 않으나, CH001-F와 CH001-R의 프라이머 세트를 사용하거나, CH001-R-high 프라이머, CH001-F-high 프라이머 및 하이힐 프라이머로 구성된 프라이머 혼합물을 사용해서 RT-PCR을 수행한 경우에는, 각각 약 72bp 및 약 120bp의 SARS 리더서열이 특이적으로 증폭되었고, 특히 하이힐 프라이머를 첨가한 경우에 증폭효율이 더 좋았다.
결국, 본 실시예에서는 증폭시 주형과 프라이머의 어닐링 온도를 높여줌으로써, 비특이적 증폭을 최소화할 수 있고, SARS 리더서열을 특이적으로 증폭하는 것이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: SARS 바이러스 N 단백질을 코딩하는 염기서열의 특이적 증폭
(1) 역전사에 의한 단일가닥 cDNA의 합성
SARS 바이러스 감염 의심환자의 임상샘플에 추출된 샘플 RNA 1-5㎕에 1㎕의 CH003-R-high 프라이머(2㎍/㎕)를 65℃에서 10분간 인큐베이션하여 어닐링하였다. 어닐링시 반응부피는 15.4㎕이었다. 상기 어닐링한 반응용액에 5X 일차가닥(fisrt strand) 버퍼(Invitrogen) 6㎕, 0.1mM DTT(Invitrogen) 3㎕, 25mM dNTP(Amersham) 0.6㎕, 역전사효소(SuperscriptII, 200U, Invitrogen) 1㎕를 첨가하여 최종 반응용액이 25㎕가 되도록 한 다음, 42℃에 2시간 동안 인큐베이션하였다.
(2) SARS N 단백질을 코딩하는 염기서열의 증폭
실시예 1의 SARS 리더서열의 PCR 증폭방법과 유사한 방법으로 N 단백질을 코 딩하는 염기서열을 특이적으로 증폭하였는데, 증폭반응은 하나의 튜브 안에서 이루어지도록 디자인하였다. 상기 서열번호 3의 하이힐 프라이머와 CH003-R-high 프라이머 및 CH003-F-high 프라이머를 동시에 넣어주고, 역전사에 의해서 만들어진 단일가닥 리더서열 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 즉, 상기 (1)에서 준비된 역전사 혼합물 2.5㎕에 10X PCR 버퍼(Solgent, Korea) 2.5㎕, Taq 폴리머라제(5U/㎕, Solgent, Korea) 1㎕, dNTP(2.5mM, Solgent, Korea) 1㎕, CH003-F-high 프라이머(10pmole/㎕) 1㎕, CH003-R-high 프라이머(10pmole/㎕) 1㎕ 및 서열번호 3의 하이힐 프라이머(100pmole/㎕) 1㎕를 첨가하여 최종 반응부피가 25㎕가 되도록 한 다음, PCR[(94℃에서 10분, 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 30초) 1 내지 4 싸이클]을 수행하였다. 상기 PCR시 CH003-R-high과 CH003-F-high 프라이머에 의해 2차적인 PCR에 필요한 주형이 만들어진다.
그 후 서열번호 3의 하이힐 프라이머를 이용하여 증폭반응[(94℃에서 1분, 72℃에서 45초) 35 내지 40 싸이클 수행 및 최종신장(final extension) 72℃에서 10분]을 수행하였다. 상기 증폭반응에서, SARS N 단백질을 코딩하는 염기서열(약188bp)을 포함하는 약 236bp의 증폭산물이 특이적으로 만들어진다. 상기 증폭산물이 특이적으로 만들어지는 것을 확인하기 위하여, 전기영동을 수행하였다 (도 5).
도 5는 총 25㎕의 반응용액 중 5㎕를 1.5% 아가로스겔 상에서 전기영동한 사진이다. 도 5에서 레인 M은 사이즈 마커이고, 레인1은 샘플 RNA 자체를, 레인2는 샘플 RNA의 PCR 증폭물을, 레인3은 CH003-F과 CH003-R의 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인4는 CH003-F-high 프라이머, CH003-R-high 프라이머 및 하이 힐 프라이머로 구성된 프라이머 혼합물 이용한 RT-PCR 증폭물을, 레인5는 blank를 나타낸다.
도 5에 나타난 바와 같이, RNA 자체(레인 1) 또는 RNA 자체를 PCR한 경우(레인 2)에는 PCR 산물이 만들어지지 않으나, CH003-F과 CH003-R의 프라이머 세트를 사용하거나, CH003-R-high 프라이머, CH003-F-high 프라이머 및 하이힐 프라이머로 구성된 프라이머 혼합물을 사용해서 RT-PCR을 수행한 경우에는, 각각 약 188bp 및 약 236bp의 SARS N 단백질을 코딩하는 염기서열이 특이적으로 증폭되었고, 특히 하이힐 프라이머를 첨가한 경우에 증폭효율이 더 좋았다.
결국, 본 실시예에서는 증폭시 주형과 프라이머의 어닐링 온도를 높여줌으로써, 비특이적 증폭을 최소화할 수 있고, SARS N 단백질을 코딩하는 염기서열을 특이적으로 증폭하는 것이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
본 발명에 따른 SARS 바이러스 검출용 프라이머 혼합물을 이용한 RT-PCR 시스템은 SARS 바이러스의 리더서열 또는 N 단백질을 코딩하는 염기서열만을 특이적으로 증폭할 수 있어, SARS 바이러스를 포함하는 코로나바이러스를 효과적인 검 출에 유용하다.
또한 일반적으로 임상시료 내에는 바이러스의 타이터(titer)가 매우 낮기 때문에, 종래기술에서는 2번 이상의 네스티드(nested) PCR을 수행해야 하는데 비해, 본 발명에서는 최종 증폭반응에서 하이힐 프라이머를 사용함으로써 네스티드 PCR의 효과를 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
<110> GenomicTree
<120> Probe Composition and Primer Mixture for Detection of Corona
Virus and Method for Detecting Corona Virus Using the Same
<130> P04-304
<160> 7
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> SARS virus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(72)
<223> leader sequence
<400> 1
atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60
ctctaaacga ac 72
<210> 2
<211> 1670
<212> DNA
<213> SARS virus
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1670)
<223> Nucleocapsid protein gene
<400> 2
gatattaggt ttttacctac ccaggaaaag ccaaccaacc tcgatctctt gtagatctgt 60
tctctaaacg aacaaattaa aatgtctgat aatggacccc aatcaaacca acgtagtgcc 120
ccccgcatta catttggtgg acccacagat tcaactgaca ataaccagaa tggaggacgc 180
aatggggcaa ggccaaaaca gcgccgaccc caaggtttac ccaataatac tgcgtcttgg 240
ttcacagctc tcactcagca tggcaaggag gaacttagat tccctcgagg ccagggcgtt 300
ccaatcaaca ccaatagtgg tccagatgac caaattggct actaccgaag agctacccga 360
cgagttcgtg gtggtgacgg caaaatgaaa gagctcagcc ccagatggta cttctattac 420
ctaggaactg gcccagaagc ttcacttccc tacggcgcta acaaagaagg catcgtatgg 480
gttgcaactg agggagcctt gaatacaccc aaagaccaca ttggcacccg caatcctaat 540
aacaatgctg ccaccgtgct acaacttcct caaggaacaa cattgccaaa aggcttctac 600
gcagagggaa gcagaggcgg cagtcaagcc tcttctcgct cctcatcacg tagtcgcggt 660
aattcaagaa attcaactcc tggcagcagt aggggaaatt ctcctgctcg aatggctagc 720
ggaggtggtg aaactgccct cgcgctattg ctgctagaca gattgaacca gcttgagagc 780
aaagtttctg gtaaaggcca acaacaacaa ggccaaactg tcactaagaa atctgctgct 840
gaggcatcta aaaagcctcg ccaaaaacgt actgccacaa aacagtacaa cgtcactcaa 900
gcatttggga gacgtggtcc agaacaaacc caaggaaatt tcggggacca agacctaatc 960
agacaaggaa ctgattacaa acattggccg caaattgcac aatttgctcc aagtgcctct 1020
gcattctttg gaatgtcacg cattggcatg gaagtcacac cttcgggaac atggctgact 1080
tatcatggag ccattaaatt ggatgacaaa gatccacaat tcaaagacaa cgtcatactg 1140
ctgaacaagc acattgacgc atacaaaaca ttcccaccaa cagagcctaa aaaggacaaa 1200
aagaaaaaga ctgatgaagc tcagcctttg ccgcagagac aaaagaagca gcccactgtg 1260
actcctcttc ctgcggctga catggatgat ttctccagac aacttcaaaa ttccatgagt 1320
ggagcttctg ctgattcaac tcaggcataa acactcatga tgaccacaca aggcagatgg 1380
gctatgtaaa cgttttcgca attccgttta cgatacatag tctactcttg tgcagaatga 1440
gttctcgtaa ctaaacagca caagtaggtt tagttaactt taatctcaca tagcaatctt 1500
taatcaatgt gtaacattag ggaggacttg aaagagccac cacattttca tcgtggccac 1560
gcggagtacg atcgagggta cagtgaataa tgctagggag agctgcctat atggaagagc 1620
cctaatgtgt aaaattaatt ttaatagcat ccccatgtga ttttaatagc 1670
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High Heel Primer
<400> 3
cgctgggccg accgggcgcg ggac 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS leader sequence specific primer
<400> 4
gttcgtttag agaacagatc ta 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS leader sequence specific primer
<400> 5
atattaggtt tttacctacc ca 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS virus N protein sequence specific primer
<400> 6
ctctgcgtag aagccttttg g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS virus N protein sequence specific primer
<400> 7
acctaggaac tggcccagaa g 21
Claims (26)
- (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 리더서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래된 10bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는 코로나 바이러스 검출용 프로브 조성물.
- 코로나바이러스 감염 의심환자의 임상샘플에서 유래된 핵산을 제1항 프로브 조성물과 하이브리다이제이션시키는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법.
- 제1항의 프로브 조성물이 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 검출용 DNA 칩.
- 제3항의 DNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스의 검출방법.
- (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 리더서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호 1의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- (a) 하이힐 프라이머에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 SARS 바이러스의 리더서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머; 및 (b) 하이힐 프라이머에 서열번호 1의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- 제6항에 있어서, 상기 (a)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 5의 염기서열을 가지고, 상기 (b)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- 제6항에 있어서, 하이힐 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 것임을 특징으 로 하는 프라이머 세트.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 하이힐 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 혼합물.
- 제9항에 있어서, 하이힐 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 프라이머 혼합물.
- 코로나바이러스 감염 의심환자 유래의 임상샘플에서 추출된 RNA를 제9항의 프라이머 혼합물을 이용하여 RT-PCR로 증폭하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법.
- 제11항에 있어서, 상기 RT-PCR은 다음 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법:(a) 상기 RNA로부터 역전사를 통하여 cDNA를 합성하는 단계;(b) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 ds-cDNA를 합성하는 단계; 및(c) 상기 합성된 ds-cDNA를 하이힐 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계.
- 제11항에 있어서, 코로나바이러스는 SARS 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
- (a) 서열번호 2로 표시되는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열; (b) 상기 (a)에 상보적인 염기서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 염기서열에서 유래된 10bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는 코로나 바이러스 검출용 프로브 조성물.
- 코로나바이러스 감염 의심환자의 임상샘플에서 유래된 핵산을 제14항의 프로브 조성물과 하이브리다이제이션시키는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법.
- 제14항의 프로브 조성물이 기질 상에 집적되어 있는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스 검출용 DNA 칩.
- 제16항의 DNA 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 코로나 바이러스의 검출방법.
- (a) 서열번호 2로 표시되는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드; 및 (b) 서열번호 2의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- (a) 하이힐 프라이머에 서열번호 2로 표시되는 SARS 바이러스의 N 단백질을 코딩하는 염기서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머; 및 (b) 하이힐 프라이머에 서열번호 2의 염기서열에 상보적인 서열에서 유래된 8bp 이상의 연속적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드가 조합된 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- 제19항에 있어서, 상기 (a)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 7의 염기서열 을 가지고, 상기 (b)의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 6의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- 제19항에 있어서, 하이힐 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 프라이머 세트와 하이힐 프라이머를 함유하는 코로나바이러스 검출용 프라이머 혼합물.
- 제22항에 있어서, 하이힐 프라이머는 서열번호 3으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 프라이머 혼합물.
- 코로나바이러스 감염 의심환자 유래의 임상샘플에서 추출된 RNA를 제22항의 프라이머 혼합물을 이용하여 RT-PCR로 증폭하는 것을 특징으로 하는 코로나바이러스의 검출방법.
- 제24항에 있어서, 상기 RT-PCR은 다음 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법:(a) 상기 RNA로부터 역전사를 통하여 cDNA를 합성하는 단계;(b) 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하여 ds-cDNA를 합성하는 단계; 및(c) 상기 합성된 ds-cDNA를 하이힐 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계.
- 제24항에 있어서, 코로나바이러스는 SARS 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
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