KR100625019B1 - 십자화과 작물에 발생하는 순무모자이크바이러스,립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스 진단용프라이머 조합 - Google Patents

십자화과 작물에 발생하는 순무모자이크바이러스,립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스 진단용프라이머 조합 Download PDF

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Abstract

본 발명은 십자화과 작물에 발생하는 순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스를 단독 또는 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합에 관한 것이다.
순수모자이크 바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스는 십자화과 작물에 단독 또는 복합감염되어 식물병을 일으킨다. 본 발명은 상기 3종의 바이러스를 단독 또는 동시에 신속하게 진단할 수 있도록 3종의 바이러스 각각에 대하여 종특이적이고, 상기 3종의 바이러스 각각에 대하여 유연관계가 있는 다른 바이러스에 대하여는 비특이적인 반응을 보이지 않기 때문에, 상기 3종의 바이러스 단독 또는 이들이 조합되어 복합감염된 경우라도 RT-PCR법에 의하여 용이하게 검출할 수 있는 프라이머 조합에 관한 것이다.
순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스, 오이모자이크바이러스

Description

십자화과 작물에 발생하는 순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스 진단용 프라이머 조합{DETECTING PRIMER SETS FOR TuMV, RMV AND CMV INFECTING CRUCIFERAE}
도1은 설계한 TuMV 프라이머의 위치를 나타낸 그림이다.
도2는 TuMV와 조합한 12 프라이머쌍의 RT-PCR 결과를 나타낸 그림이다.
도3은 설계한 RMV 프라이머의 위치를 나타낸 그림이다.
도4는 RMV와 조합한 17 프라이머쌍의 RT-PCR 결과를 나타낸 그림이다.
도5는 설계한 CMV 프라이머의 위치를 나타낸 그림이다.
도6은 CMV와 조합한 34 프라이머쌍의 RT-PCR 결과를 나타낸 그림이다.
도7은 28가지 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 결과를 나타낸 그림이다.
도8은 동시진단용 프라이머 조합의 RT-PCR결과를 나타낸 그림이다.
본 발명은 십자화과 작물에 단독 또는 복합감염되어 식물병을 일으키는 순무모자이크 바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스를 신속하게 진단할 수 있는 프라이머 조합으로서, 상기 3종의 바이러스 각각에 대하여 종특 이적이고, 상기 3종의 바이러스 각각에 대하여 유연관계가 있는 다른 바이러스에 대하여 특이적인 반응을 보이지 않기 때문에, 상기 3종의 바이러스 단독 또는 이들이 조합되어 복합감염된 경우라도 RT-PCR법에 의하여 용이하게 검출할 수 있는 프라이머 조합에 관한 것이다.
식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타난 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 그 결과 나타난 경제적 가치의 감소를 포함하기도 한다. 이러한 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus)가 있다.
바이러스에 의하여 발생하는 식물병에 직접 작용하는 약제방제법은 현재까지 개발되어 있지 않은 실정이기 때문에, 바이러스에 의한 식물병을 관리하기 위해서는 먼저 식물체에 바이러스가 발생하였는지 여부와, 어떠한 바이러스가 발생하였는지 여부를 정밀하고 신속하게 진단하여야 한다. 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 이에 따라 바이러스를 진단하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다.
지금까지 바이러스를 진단하기 위하여 ELISA와 같은 혈청학적 진단법이 많이 사용되어왔다. 그러나 혈청학적 진단법은 많은 시료를 일반적인 정밀도에서 진단하는데 사용하는 경우에는 큰 무리가 없었으나, 진단대상 바이러스와 혈청학적 유연 관계가 있는 바이러스가 존재할 경우에는 식물체에 발생한 바이러스를 잘못 동정하게 된다거나, 바이러스에 감염된 식물체의 종류에 따라 기주유래 물질이 달라지면서, 이 물질과 비특이적 반응으로 인하여 바이러스를 잘못 진단하게되는 문제가 발생하였다. 또한 2종 이상의 바이러스가 복합 감염된 경우에 이를 진단하기 위해서는 다른 종류의 항체를 사용해서 여러 번 진단해야 한다는 문제점이 있었다.
최근에는 식물체에 발생하는 바이러스를 정밀진단하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법이 사용되고 있다. RT-PCR법에서는 사용하는 프라이머가 진단의 특이성과 정밀도를 결정짓는데, RT-PCR법에서 사용하는 프라이머는 일반적으로 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되기 때문에 종특이적이지 못하다는 문제가 있었다. 또한 식물체 또는 다른 바이러스에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합한 경우가 많았다. 또한 같은 시료에서 여러 종의 바이러스를 진단하기 위해서는 여러 종류의 프라이머를 사용하여 각각 역전사-중합효소연쇄반응을 행해야 하기 때문에 많은 진단비용과 노동력이 소요된다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스 3종에 종특이적인 프라이머로서, 상기 3종 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없기 때문에, 상기 3종 바이러스에 대해서는 민감도가 우수하여 3종 바이러스의 단독감염 및 어떠한 조합의 복합감염에도 모두 반응하고 검출감도가 뛰어난 진단용 프라이머 조합을 제공하는 것 을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 3종 바이러스 각각의 단독감염 및 어떠한 조합의 복합감염에 대하여도 한번에 진단할 수 있는 동시진단법에 사용할 수 있는 프라이머 조합을 제공하므로써, 진단에 따른 비용 및 노동력을 3분의 1로 줄일 수 있고, 아울러 십자화과 작물에서 새로운 바이러스병을 신속하게 검출할 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 배추, 무 등의 십자화과 작물에 발생하는 순무모자이크바이러스(Turnip mosaic virus, TuMV), 립그라스모자이크바이러스(Ribgrass mosaic virus, RMV) 및 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV)를 단독으로 종특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 조합 및 이들 3종 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 조합으로 구성된다.
본 발명의 발명자는 바이러스 종 내에는 약간씩 다른 염기서열을 가지고 있는 계통 또는 분리주들이 존재하기 때문에, 분리주 특이적인 프라이머를 진단에 사용할 경우에는 바이러스의 진단에 실패할 위험이 많다는 점에 착안하여 본 발명을 하게 되었다.
본 발명의 제1관점은 순무모자이크바이러스(TuMV)와 종특이적으로 반응하는 진단용 프라이머로서, TuM-C10/TuM-N60, TuM-C20/TuM-N60 및 TuM-C30/TuM-N60으로 표현되는 프라이머 중에서 적어도 하나를 포함하는 조합프라이머인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 조합 프라이머는, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.
상기에서 "변형서열"은 실질적으로 바이러스의 게놈과 혼성화능을 유지하는 범위내에서 일부 염기의 결실, 삽입, 부가 및 치환된 서열을 의미하는 것으로, 개별 변형서열은 다른 바이러스 게놈과 혼성화가 가능하지 않은 정도의 변형인 것이 바람직하다. 여기에서, 변이의 위치는 혼성화를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 중합효소연쇄반응의 단계 중 신장단계에 영향을 미치는 3'말단 부위는 배제되거나, 최소한도의 변이만 허용되는 것이 바람직하다.
상기에서 "조합 프라이머"란 개별 염기서열인 다운스트림 프라이머와 업스트림 프라이머로 구성된 개별 프라이머의 조합을 의미한다. 또한, "프라이머 조합"에서 프라이머란 특별한 한정이 없는 한 상기 조합 프라이머를 의미한다.
본 발명의 제2관점은 립그라스모자이크바이러스(RMV)와 종특이적으로 반응하는 진단용 프라이머로서, RM-C10/RM-N30 및 RM-C20/RM-N40으로 표현되는 프라이머 중에서 적어도 하나를 포함하는 조합프라이머인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 조합 프라이머는, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제3관점은 오이모자이크바이러스(CMV)와 종특이적으로 반응하는 진단용 프라이머로서, CMR3-C30/CMR3-N40, CMR3-C20/CMR3-N60, CMR3-C50/CMR3-N21, CMR3-C40/CMR3-N21, CMR3-C40/CMR3-N30, CMR3-C30/CMR3-N50 및 CMR3-C10/CMR3-N60으로 표현되는 프라이머 중에서 적어도 하나를 포함하는 조합프라이머인 것을 특징 으로 한다. 또한 상기 조합 프라이머는, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제4관점은 TuMV, RMV 및 CMV를 동시에 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, TuM-C20/TuM-N60, RM-C20/RM-N40 및 CMR3-C10/CMR3-N60으로 표현되는 조합프라이머인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 조합 프라이머는, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제5관점은 TuMV, RMV 및 CMV를 동시에 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, TuM-C30/TuM-N60, RM-C20/RM-N40 및 CMR3-C10/CMR3-N60으로 표현되는 조합프라이머인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 조합 프라이머는, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 제6관점은 TuMV, RMV 및 CMV를 동시에 진단하기 위한 프라이머 조합으로서 TuM-C10/TuM-N60, RM-C20/RM-N40 및 CMR3-C40/CMR3-N30으로 표현되는 조합프라이머인 것을 특징으로 한다. 또한 상기 조합 프라이머는, 바람직하게는 이를 구성하는 개별 염기서열의 상보적인 염기서열 또는 이들 염기서열에 의거한 변이가 실시된 변형서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 프라이머 조합은 임의의 바이러스 게놈에 부가하여 PCR 법에 의하여 얻어진 산물로부터 TuMV, RMV 및 CMV를 단독 및 동시진단하는 방법에 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1:TuMV 진단용 프라이머의 설계와 선발
[단계1:순무모자이크바이러스의 분리]
본 발명의 프라이머 선발에 사용한 순무모자이크바이러스(Turnip mosaic virus, TuMV)는 자연감염된 무에서 분리하였으며, 명아주(Chenopodium amaranticolor)에서 단병반분리법을 이용하여 순수분리하였다. 순수분리된 바이러스는 무에서 증식하였으며, 접종 3주후 모자이크 병징을 보이는 잎을 채취하여 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR 주형(template)으로 사용하였다.
[단계2:전체 RNA 분리]
전체 RNA는 페놀을 이용하여 바이러스 감염된 잎 조직 50㎎에서 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 최종적으로 75% 에탄올로 3회 세척한 후 건조한 다음 증류수 50㎕에 녹인 다음 RT-PCR 분석에 사용하였다.
[단계3:역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)]
역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5㎕, 12.5pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250mM Tris-HCl, 150mM KCl, 40mM MgCl2, 5mM DTT, pH 8.5) 1㎕, 10mM dNTP 0.5㎕, 10U RNase 억제제, 그리고 2U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5㎕를 42℃에서 30분간 항온 처리하여 실시한 다음 95℃에서 5분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5㎕에 12.5pmole 업스트림 프라이머(upstream primer), 1.25U Taq DNA중합효소, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, pH 8.3) 2㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25㎕로 만들었다. 이 반응액을 94℃ 45초, 55℃ 60초, 72℃ 80초로 40회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 10분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5×TBE 완충액과 1.5% 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.
[단계4:TuMV 공통염기서열 탐색]
TuMV의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위하여 현재까지 알려진 TuMV 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 TuMV 분리주들을 하기 표1에 나타내었다. 공통염기서열을 탐색하기 위하여 표1에 기재된 지금까지 알려진 7가지 TuMV 분리주의 염기서열을 다중 비교하였다.
[표1:공통염기서열 분석에 사용한 TuMV 분리주 염기서열]
Figure 112005023944089-pat00001
[단계5:종특이적인 염기서열의 탐색]
상기 단계4를 통하여 선발된 공통염기서열을 TuMV와 분류학적으로 유사한 포티비리데(Potyviridae) 24종의 바이러스 염기서열(표 2)과 비교하여 종특이적인 서열을 탐색하였다.
[표2:종특이적 염기서열 탐색에 사용된 포티비리데 바이러스 유전자 24종]
Figure 112005023944089-pat00002
[단계6:순무모자이크바이러스 진단용 프라이머의 설계]
상기 단계5를 통하여 탐색된 종특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 서열을 탐색하여 6개의 업스트림 프라이머와 6개의 다운스트림 프라이머를 하기 표3과 같이 합성하였다.
[표3:설계한 TuMV 진단용 프라이머]
Figure 112005023944089-pat00003
상기 표3에 있어서, TuM-N10은 서열번호1, TuM-N20은 서열번호2, TuM-N30은 서열번호3, TuM-N40은 서열번호4, TuM-N50은 서열번호5, TuM-N60은 서열번호6, TuM-C10은 서열번호7, TuM-C20은 서열번호8, TuM-C30은 서열번호9, TuM-C40은 서열번호10, TuM-C50은 서열번호11, 및 TuM-C60은 서열번호12이다.
상기 설계한 프라이머의 위치는 도1에 나타내었다.
[단계7:TuMV 진단용 프라이머의 선발]
상기 단계6을 통하여 설계한 TuMV 프라이머들을 하기 표4에 기재된 바와 같이 12가지로 조합한 다음 TuMV 및 십자화과 작물에 발생하는 RMV 및 CMV와 RT-PCR을 수행하여, 그 결과를 도2에 나타내었다. 도2에 나타낸 결과를 통하여 진단용 프라이머 TuM-C10(서열번호7)/TuM-N60(서열번호6), TuM-C20(서열번호8)/TuM-N60(서열번호6) 및 TuM-C30(서열번호9)/TuM-N60(서열번호6)으로 표현되는 표5의 선발된 TuMV 종특이적 조합프라이머가 비특이적 반응을 일으키지 않는 것을 확인할 수 있다.
[표4:TuMV 프라이머 조합과 RT-PCR 산물]
Figure 112005023944089-pat00004
[표5:선발된 TuMV 종특이적 프라이머 조합]
Figure 112005023944089-pat00005
실시예 2:RMV 진단용 프라이머의 설계와 선발
[단계1:RMV의 분리]
본 발명의 프라이머 선발에 사용한 립그라스모자이크바이러스(Ribgrass mosaic virus, RMV)는 자연감염된 배추에서 분리하였으며, 명아주(Chenopodium amaranticolor)에서 단병반분리법을 이용하여 순수분리하였다. 순수분리된 바이러스는 배추에서 증식하였으며, 접종 3주후 모자이크 병징을 보이는 잎을 채취하여 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR 주형(template)으로 사용하였다.
[단계2:전체 RNA 분리]
전체 RNA는 페놀을 이용하여 바이러스 감염된 잎 조직 50㎎에서 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 최종적으로 75% 에탄올로 3회 세척한 후 건조한 다음 증류수 50 ㎕에 녹인 다음 RT-PCR 분석에 사용하였다.
[단계3:역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)]
역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5㎕, 12.5pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250mM Tris-HCl, 150mM KCl, 40mM MgCl2, 5mM DTT, pH 8.5) 1㎕, 10mM dNTP 0.5㎕, 10U RNase 억제제, 그리고 2U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5㎕를 42℃에서 30분간 항온 처리하여 실시한 다음 95℃에서 5분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5㎕에 12.5pmole 업스트림 프라이머(upstream primer), 1.25U Taq DNA중합효소, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, pH 8.3) 2㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25㎕로 만들었다. 이 반응액을 94℃ 45초, 55℃ 60초, 72℃ 80초로 40회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 10분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5×TBE 완충액과 1.5% 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.
[단계4:RMV 공통염기서열 탐색]
RMV의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위하여 현재까지 알려진 RMV 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 RMV 분리주들을 하기 표6에 나타내었다. 공통염기서열을 탐색하기 위하여 표6에 기재된 지금까지 알려진 5가지 RMV 분리주의 염기서열을 다중 비교하였다.
[표6:공통염기서열 분석에 사용한 RMV 분리주 염기서열]
Figure 112005023944089-pat00006
[단계5:종특이적인 염기서열의 탐색]
상기 단계4를 통하여 선발된 공통염기서열을 종특이적인 서열을 탐색하기 위하여 RMV와 분류학적으로 유사한 토바모바이러스(tobamovirus)(표7)와 비교하였다.
[표7:종특이적 염기서열 탐색에 사용된 토바모바이러스 유전자]
Figure 112005023944089-pat00007
[단계6:RMV 진단용 프라이머의 설계]
상기 단계5를 통하여 탐색된 종특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 서열을 탐색하여 6개의 업스트림 프라이머와 5개의 다운스트림 프라이머를 하기 표8과 같이 합성하였다.
[표8:설계한 RMV 진단용 프라이머]
Figure 112005023944089-pat00008
상기 표8에 있어서, RM-N10은 서열번호13, RM-N20은 서열번호14, RM-N30은 서열번호15, RM-N40은 서열번호16, RM-N50은 서열번호17, RM-N60은 서열번호18, RM-C10은 서열번호19, RM-C20은 서열번호20, RM-C30은 서열번호 21, RM-C40은 서열번호22 및 RM-C50은 서열번호23이다.
상기 설계한 프라이머의 위치는 도3에 나타내었다.
[단계7:RMV 진단용 프라이머의 선발]
상기 단계6을 통하여 설계한 RMV 프라이머들을 하기 표9에 기재된 바와 같이 17가지로 조합한 다음 RMV 및 십자화과 작물에 발생하는 TuMV 및 CMV와 RT-PCR을 수행하여, 그 결과를 도4에 나타내었다. 도4에 나타낸 결과를 통하여 진단용 프라이머 RM-C10(서열번호19)/RM-N30(서열번호15) 및 RM-C20(서열번호20)/RM-N40(서열번호16)으로 표현되는 표10의 선발된 RMV 종특이적 조합프라이머가 비특이적 반응을 일으키지 않는 것을 확인할 수 있다.
[표9:RMV 프라이머 조합과 RT-PCR 산물]
Figure 112005023944089-pat00009
[표10:선발된 RMV 종특이적 프라이머 조합]
Figure 112005023944089-pat00010
실시예 3:CMV 진단용 프라이머의 설계와 선발
[단계1:CMV의 분리]
본 발명의 프라이머 선발에 사용한 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV)는 자연감염된 배추에서 분리하였으며, 명아주(Chenopodium amaranticolor)에서 단병반분리법을 이용하여 순수분리하였다. 순수분리된 바이러스는 배추에서 증식하였으며, 접종 3주후 모자이크 병징을 보이는 잎을 채취하여 전체 RNA를 분리하여 RT-PCR 주형(template)으로 사용하였다.
[단계2:전체 RNA 분리]
전체 RNA는 페놀을 이용하여 바이러스 감염된 잎 조직 50㎎에서 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 최종적으로 75% 에탄올로 3회 세척한 후 건조한 다음 증류수 50㎕에 녹인 다음 RT-PCR 분석에 사용하였다.
[단계3:역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)]
역전사(Reverse transcription) 반응은 분리한 전체 RNA 0.5㎕, 12.5pmole 다운스트림 프라이머(downstream primer), 5배 역전사 완충액(250mM Tris-HCl, 150mM KCl, 40mM MgCl2, 5mM DTT, pH 8.5) 1㎕, 10mM dNTP 0.5㎕, 10U RNase 억제제, 그리고 2U AMV 역전사효소를 첨가한 반응액 5㎕를 42℃에서 30 분간 항온 처리하여 실시한 다음 95℃에서 5분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사반응액 5㎕에 12.5pmole 업스트림 프라이머(upstream primer), 1.25U Taq DNA중합효소, 10배 중합효소연쇄반응 완충액(100mM Tris-HCl, 500mM KCl, 15mM MgCl2, pH 8.3) 2㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25㎕로 만들었다. 이 반응액을 94℃ 45초, 55℃ 60초, 72℃ 80초로 40회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 10분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 0.5×TBE 완충액과 1.5% 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.
[단계4:CMV 공통염기서열 탐색]
CMV의 모든 계통에 사용할 수 있는 진단용 프라이머를 개발하기 위하여 현재까지 알려진 CMV 분리주들의 유전정보를 분석하였다. 염기서열 분석에 사용한 CMV 분리주들을 하기 표11에 나타내었다. 공통염기서열을 탐색하기 위하여 표11에 기재된 지금까지 알려진 13가지 CMV 분리주의 염기서열을 다중 비교하였다.
[표11:공통염기서열 분석에 사용한 CMV 분리주 염기서열]
Figure 112005023944089-pat00011
[단계5:종특이적인 염기서열의 탐색]
상기 단계4를 통하여 선발된 공통염기서열dmf 종특이적인 서열을 탐색하기 위하여 CMV와 분류학적으로 유사한 브로모비리데(bromoviridae) 5종 바이러스(표12)와 비교하였다.
[표12:종특이적 염기서열 탐색에 사용된 브로모비리데 5종 바이러스 유전자]
Figure 112005023944089-pat00012
[단계6:CMV 진단용 프라이머의 설계]
상기 단계5를 통하여 탐색된 종특이적 염기서열들 중에서 프라이머 조건을 충족시키는 서열을 탐색하여 7개의 업스트림 프라이머와 6개의 다운스트림 프라이머를 하기 표13과 같이 합성하였다.
[표13:설계한 CMV 진단용 프라이머]
Figure 112005023944089-pat00013
상기 표13에 있어서, CMR3-N10은 서열번호24, CMR3-N20은 서열번호25, CMR3-N21은 서열번호26, CMR3-N30은 서열번호27, CMR3-N40은 서열번호28, CMR3-N50은 서열번호29, CMR3-N60은 서열번호30, CMR3-C10은 서열번호31, CMR3-C20은 서열번호32, CMR3-C21은 서열번호33, CMR3-C30은 서열번호 34, CMR3-C40은 서열번호35 및 CMR3-C50은 서열번호36이다.
상기 설계한 프라이머의 위치는 도5에 나타내었다.
[단계7:CMV 진단용 프라이머의 선발]
상기 단계6을 통하여 설계한 CMV 프라이머들을 하기 표14에 기재된 바와 같이 34가지로 조합한 다음 CMV 및 십자화과 작물에 발생하는 TuMV 및 RMV와 RT-PCR을 수행하여, 그 결과를 도6에 나타내었다. 도6에 나타낸 결과를 통하여 진단용 프라이머 CMR3-C30(서열번호34)/CMR3-N40(서열번호28), CMR3-C20(서열번호32)/CMR3- N60(서열번호30), CMR3-C50(서열번호36)/CMR3-N21(서열번호26), CMR3-C40(서열번호35)/CMR3-N21(서열번호26), CMR3-C40(서열번호35)/CMR3-N30(서열번호27), CMR3-C30(서열번호34)/CMR3-N50(서열번호29) 및 CMR3-C10(서열번호31)/CMR3-N60(서열번호30)으로 표현되는 표15의 선발된 CMV 종특이적 조합프라이머가 비특이적 반응을 일으키지 않는 것을 확인할 수 있다.
[표14:CMV 프라이머 조합과 RT-PCR 산물]
Figure 112005023944089-pat00014
[표15:선발된 CMV 종특이적 프라이머 조합]
Figure 112005023944089-pat00015
실시예 4:십자화과 작물 발생 3종 바이러스 동시진단법 개발
십자화과 작물에 발생하는 TuMV, RMV 및 CMV에 대하여 실시예 1, 2 및 3에서와 동일한 방법으로 표5, 10 및 15에 기재되어 있는 TuMV 진단용 프라이머 3쌍, RMV 프라이머 2쌍, CMV 프라이머 7쌍을 선발하여 조합하였다. 프라이머의 조합은 RT-PCR 산물의 크기로 바이러스를 쉽게 구별할 수 있도록 이루어졌다. 이 결과 표 16과 같이 28가지 동시진단용 프라이머 조합을 설계하였다.
[표16:십자화과 작물에 발생하는 3종 바이러스 동시진단용 프라이머 조합 설계]
Figure 112005023944089-pat00016
상기 28가지 조합에 대하여 3종 바이러스 단독감염 및 모든 복합감염의 경우에 대해 실시예 1에서와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행한 다음, 그 결과를 도7 및 도8에 나타내었다. 상기 도7 및 도8로부터, 28가지 프라이머 조합 중에서 십자화과 작물에 발생하는 TuMV, RMV 및 CMV에 효과적으로 반응하는 조합은 표17에 기재된 바와 같이 TuM-C20(서열번호8)/TuM-N60(서열번호6), RM-C20(서열번호20)/RM-N40(서열번호16) 및 CMR3-C10(서열번호31)/CMR3-N60(서열번호30); TuM-C30(서열번호9)/TuM-N60(서열번호6), RM-C20(서열번호20)/RM-N40(서열번호16) 및 CMR3-C10(서열번호31)/CMR3-N60(서열번호30); 또는 TuM-C10(서열번호7)/TuM-N60(서열번호6), RM-C20(서열번호20)/RM-N40(서열번호16) 및 CMR3-C40(서열번호35)/CMR3-N30(서열번호27)으로 표현되는 조합프라이머인 것을 확인할 수 있다.
[표17:최종선발된 십자화과 작물 발생 3종 바이러스 동시 진단용 프라이머 조합]
Figure 112005023944089-pat00017
본 발명의 진단용 조합프라이머를 이용하여 십자화과 작물에 발생하는 TuMV, RMV, CMV에 대한 RT-PCR 진단을 행하면 기존의 항혈청을 이용한 진단법보다 검출한계가 현저히 높아지고, 지금까지 알려진 종 내의 모든 바이러스 계통들과의 비특이적 반응이 없기 때문에 훨씬 정밀한 진단이 가능하다. 또한 한번의 진단으로 3종 바이러스를 진단할 수 있기 때문에, 진단에 따른 비용 및 노동력을 3분의 1로 줄일 수 있고, 아울러 십자화과 작물에서 새로운 바이러스병의 신속한 검출도 용이하다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 십자화과 작물에 발생하는 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 순무모자이크바이러스와 종특이적으로 반응하는 서열번호7/서열번호6, 서열번호8/서열번호6 및 서열번호9/서열번호6 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합프라이머.
  2. 십자화과 작물에 발생하는 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합으로서,립그라스모자이크바이러스와 종특이적으로 반응하는 서열번호19/서열번호15 및 서열번호20/서열번호16 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합프라이머.
  3. 십자화과 작물에 발생하는 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 오이모자이크바이러스와 종특이적으로 반응하는 진단용 프라이머 서열번호34/서열번호28, 서열번호32/서열번호30, 서열번호36/서열번호26, 서열번호35/서열번호26, 서열번호35/서열번호27, 서열번호34/서열번호29 및 서열번호31/서열번호30 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조합프라이머.
  4. 십자화과 작물에 발생하는 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호8/서열번호6, 서열번호20/서열번호16 및 서열번호31/서열번호30으로 구성 되는, 순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스의 동시진단용 프라이머 조합.
  5. 십자화과 작물에 발생하는 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호9/서열번호6, 서열번호20/서열번호16 및 서열번호31/서열번호30으로 구성되는, 순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스의 동시진단용 프라이머 조합.
  6. 십자화과 작물에 발생하는 바이러스를 진단하기 위한 프라이머 조합으로서, 서열번호7/서열번호6, 서열번호20/서열번호16 및 서열번호35/서열번호27로 구성되는, 순무모자이크바이러스, 립그라스모자이크바이러스 및 오이모자이크바이러스의 동시진단용 프라이머 조합.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR101771964B1 (ko) * 2015-06-25 2017-08-29 대한민국 배추 감염성 4종 바이러스 복합진단 pcr 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법
KR20190053733A (ko) 2017-11-10 2019-05-20 대한민국(농촌진흥청장) 지황 감염 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법

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