JP2008529527A - 豚コレラの検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、豚コレラウイルス(CSFV)の簡単かつ迅速な診断を目的とした異種内部対照系(すなわちEGFP−RNA)を伴う多重リアルタイムRT−PCRアッセイに関する。CSFVに特異的なプライマーおよびFAMで標識されたタックマン(TaqMan)プローブは、様々なCSFV株の5’−非翻訳領域のコンセンサス配列を分析することによって選択された。分析感度を測定するため、5’NTRのインビトロ転写産物(T7−PC3Alf)が構築されかつ試験された。さらに、内部対照配列を検出するためのプライマー−プローブ系が確立され、CSF−システム1(CSF−System1)およびICリアルタイムPCRを用いた多重アッセイを、1チューブアッセイとして感度または特異性の低下を伴うことなく実施できた。
Description
1.関連出願の相互参照
該当なし。
該当なし。
2.連邦政府支援の研究または開発に関する陳述
該当なし。
該当なし。
3.コンパクトディスクで提出される資料の参照による援用
該当なし。
該当なし。
4.発明の分野
本発明は、プライマーおよびプローブとして有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、好ましくは単離された生体試料中での豚コレラウイルス核酸の検出を目的としたプライマーおよびプローブを使用する方法ならびにそのための試薬およびキットにも関する。特定の実施形態では、本発明は、豚コレラの簡単かつ迅速な診断を目的とした、内部対照系を有する十分に有効で使用可能な多重リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(「RT−PCR」)アッセイに関する。
本発明は、プライマーおよびプローブとして有用なオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、好ましくは単離された生体試料中での豚コレラウイルス核酸の検出を目的としたプライマーおよびプローブを使用する方法ならびにそのための試薬およびキットにも関する。特定の実施形態では、本発明は、豚コレラの簡単かつ迅速な診断を目的とした、内部対照系を有する十分に有効で使用可能な多重リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(「RT−PCR」)アッセイに関する。
5.発明の背景
豚コレラ(「CSF」)は、ブタおよびイノシシの強い伝染性を示す疾患である。CSFは多数の国々から根絶されているが、世界の異なる地域で絶えず深刻な問題を引き起こしている(モーニング(Moenning)ら、「Clinical Signs And Epidemiology Of Classical Swine Fever:A Review Of New Knowledge.」 Vet J.2003年、165、11−20頁;エドワーズ(Edwards)ら、「Classical Swine Fever:The Global Situation」、Vet.Microbiol.2000年、73、103−19頁)。原因物質であるCSFウイルス(「CSFV」)は、フラビウイルス科(Flaviviridae)の中のぺスティウイルス(Pestivirus)属のメンバーである。ぺスティウイルス属の中の他のメンバーは、ウシウイルス性下痢ウイルス(「BVDV」)およびボーダー疾患ウイルス(border disease virus)(「BDV」)である。BVDVおよびBDVにおける自然宿主はそれぞれウシおよびヒツジであるが、両ウイルスはブタにも自然感染しうる。BVDウイルスおよびBDウイルスに対する抗体は、血清学的アッセイにおいてCSFVと交差反応し、かつ診断的問題を引き起こす可能性がある(テルプストラ,C.(Terpstra,C.)、ヴェンスヴールト,G.(Wensvoort,G.)、「A Congenital Persistent Infection Of Bovine Virus Diarrhoea Virus In Pigs:Clinical,Virological And Immunological Observations.」 Vet.Q.、1997年、19、97−101頁;パトン,D.J.(Paton,D.J.)、ダン,S.H.(Done,S.H.)、「Congenital Infection Of Pigs With Ruminant−Type Pestiviruses」 J.Comp.Pathol.1994年、111、151−63頁;パトン(Paton)ら、「Infection Of Pigs And Cattle With Bovine Viral Diarrhoea Virus On A Farm In England」、Vet.Rec、1992年、131、185−8頁)。CSFVのみが国際獣疫事務局(Office International des Epizooties)(「OIE」)のリストA疾患の中に分類されることから、CSFVとBVDVまたはBDVとを区別することが重要である。
豚コレラ(「CSF」)は、ブタおよびイノシシの強い伝染性を示す疾患である。CSFは多数の国々から根絶されているが、世界の異なる地域で絶えず深刻な問題を引き起こしている(モーニング(Moenning)ら、「Clinical Signs And Epidemiology Of Classical Swine Fever:A Review Of New Knowledge.」 Vet J.2003年、165、11−20頁;エドワーズ(Edwards)ら、「Classical Swine Fever:The Global Situation」、Vet.Microbiol.2000年、73、103−19頁)。原因物質であるCSFウイルス(「CSFV」)は、フラビウイルス科(Flaviviridae)の中のぺスティウイルス(Pestivirus)属のメンバーである。ぺスティウイルス属の中の他のメンバーは、ウシウイルス性下痢ウイルス(「BVDV」)およびボーダー疾患ウイルス(border disease virus)(「BDV」)である。BVDVおよびBDVにおける自然宿主はそれぞれウシおよびヒツジであるが、両ウイルスはブタにも自然感染しうる。BVDウイルスおよびBDウイルスに対する抗体は、血清学的アッセイにおいてCSFVと交差反応し、かつ診断的問題を引き起こす可能性がある(テルプストラ,C.(Terpstra,C.)、ヴェンスヴールト,G.(Wensvoort,G.)、「A Congenital Persistent Infection Of Bovine Virus Diarrhoea Virus In Pigs:Clinical,Virological And Immunological Observations.」 Vet.Q.、1997年、19、97−101頁;パトン,D.J.(Paton,D.J.)、ダン,S.H.(Done,S.H.)、「Congenital Infection Of Pigs With Ruminant−Type Pestiviruses」 J.Comp.Pathol.1994年、111、151−63頁;パトン(Paton)ら、「Infection Of Pigs And Cattle With Bovine Viral Diarrhoea Virus On A Farm In England」、Vet.Rec、1992年、131、185−8頁)。CSFVのみが国際獣疫事務局(Office International des Epizooties)(「OIE」)のリストA疾患の中に分類されることから、CSFVとBVDVまたはBDVとを区別することが重要である。
ぺスティウイルスは、約12.5kbの正のセンス一本鎖RNAを有する小さい被膜ウィルスである。それらのゲノムは高度に保存された5’−および3’−非翻訳領域(「NTR」)によって隣接される大きいオープンリーディングフレームを有する。この10年間では、主に5’NTRは、RT−PCRの使用による種および属の重複ゲノムの増幅における鋳型として機能した(ヴィルチェック(Vilcek)ら、「Pestiviruses Isolated From Pigs,Cattle And Sheep Can Be Allocated Into At Least Three Genogroups Using Polymerase Chain Reaction And Restriction Endonuclease Analysis.」 Arch.Virol.1994年、136、309−23頁;サンドビック(Sandvik)ら、「Detection And Identification Of Ruminant And Porcine Pestiviruses By Nested Amplification Of 5’ Untranslated Cdna Region.」 J.Virol.Methods、1997年、64、43−56頁;ヒンドマン(Hyndman)ら、「A Novel Nested Reverse Transcription PCR Detects Bovine Viral Diarrhoea Virus In Fluids From Aborted Bovine Fetuses.」 J.Virol.Methods、1998年、71、69−76頁;パトン(Paton)ら、「Classical Swine Fever Virus:A Ring Test To Evaluate RT−PCR Detection Methods」、Vet.Microbiol.、2000年、73、159−74頁;パトン(Patton)ら、「Classical Swine Fever Virus:A Second Ring Test To Evaluate RT−PCR Detection Methods」、Vet.Microbiol、2000年、77、71−81頁;バーリック・マガンジャ(Barlic−Maganja)およびグロム(Grom)、「Highly Sensitive One−Tube RT−PCR And Microplate Hybridization Assay For The Detection And For The Discrimination Of Classical Swine Fever Virus From Other Pestiviruses」、J.Virol.Methods、2001年、95、101−10頁)。古典的なRT−PCRは、高感度かつ特異的な診断ツールであることが判明した。しかし、ゲルベースの系によって増幅されたPCR産物の検出では、交差汚染におけるリスクが生じ、鋳型におけるゲノムコピーの正確な定量が可能ではなく、さらなる特異性試験が含まれない。蛍光発生プローブの導入により、PCRチューブを開けることなく配列特異的な鋳型の検出をリアルタイムに行うことが可能になる(ギブソン(Gibson)ら、「A Novel Method For Real Time Quantitative RT−PCR.」 Genome Res.1996年、6、995−1001頁、ハイド(Heid)ら、1996年)。リアルタイムPCRがPCR後の試料処理を必要としないことから、汚染を回避でき、プローブのハイブリダイゼーションにおける特異性が保証される。
ぺスティウイルスの診断において、タックマン(TaqMan)−プローブは実用的かつ強力であることが判明し、数名の著者らによって用いられた(マックゴールドリック(McGoldrick)ら、「A Novel Approach To The Detection Of Classical Swine Fever Virus By RT−PCR With A Fluorogenic Probe(TaqMan).」 J.Virol.Methods、1998年、72、125−35頁;1999年;ビューデヴィ(Bhudevi)およびウェインストック(Weinstock)、「Detection of bovine viral diarrhea virus in formalin fixed paraffin embedded tissue sections by real−time RT−PCR(Taqman).」 J.Virol.Methods、2003年、109、25−30頁;ビューデヴィ(Bhudevi)およびウェインストック(Weinstock)、「Fluorogenic RT−PCR Assay(Taqman) For Detection And Classification Of Bovine Viral Diarrhea Virus.」 Vet.Microbiol.2001年、83、1−10頁;リサッティ(Risatti)ら、「Rapid Detection Of Classical Swine Fever Virus By A Portable Real−time Reverse Transcriptase PCR Assay」、J.Clin.Microbiol.2003年、41、500−5頁)。5’NTRの中のぺスティウイルス配列の増幅された標的の検出を目的とした、ここで記載されるあらゆるリアルタイムRT−PCRアッセイでは、許容される感度および特異性を伴う結果が得られた。しかし、RNAの単離ステップおよびRT−PCRを検証する内部対照はこれまでのところ全く用いられていない。2003年には、CSFVを検出するための多重リアルタイムRT−PCRについて記述され、ここではユニバーサルな陽性対照としてのBVDVの5’NTRを含むキメラCSFウイルスが用いられた(ホフマン(Hofmann)、「Construction Of An Infectious Chimeric Classical Swine Fever Virus Containing The 5’UTR Of Bovine Viral Diarrhea Virus,And Its Application As A Universal Internal Positive Control In Real−Time RT−PCR.」 J.Virol.Methods、2003年、114、77−90頁)。しかし、かかる完全なキメラビリオンは感染性を示しうることから、ルーチンの診断目的に適しないものと思われる。
本発明は、CSFの簡単かつ迅速なルーチン診断を目的とした、2つの対照を有する強力、使用可能、高感度で、かつCSFVに特異的な多重リアルタイムRT−PCRアッセイを提供する。第1の対照(陽性対照)がプライマーおよびプローブの効率性を証明する一方、第2の対照(内部対照)は各試験試料でのRNA単離およびRT−PCRを検証するように設計される。
6.発明の概要
一実施形態では、本発明はプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを包含する。
一実施形態では、本発明はプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを包含する。
別の実施形態では、本発明は、異種内部対照RNA(すなわちEGFP−RNA)を用いた多重リアルタイムRT−PCR技術を用い、生体試料中で豚コレラウイルス核酸を検出するための方法を包含する。
本発明の別の実施形態は、単離された生体試料中でCSFVウイルス負荷を定量する方法を包含する。
さらに本発明の別の実施形態は、CSFVを検出するためのキットを包含する。
8.発明の詳細な説明
8.1.定義
本明細書中で用いられる「増幅された」または「増幅」という用語は、1個もしくは数個のコピー由来の多数のDNAコピーの生成を示す。
8.1.定義
本明細書中で用いられる「増幅された」または「増幅」という用語は、1個もしくは数個のコピー由来の多数のDNAコピーの生成を示す。
本明細書中で用いられる「生体試料」という用語は、血清、血漿、精液、尿または血液を含むがこれらに限定されない。
本明細書中で用いられる「相補的」という用語は、核酸分子のヌクレオチド単位間のワトソン・クリック型またはフーグスティーン型塩基対を示し、「結合」という用語は2つのポリペプチドもしくは化合物または関連するポリペプチドもしくは化合物またはこれらの組み合わせの間での物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン相互作用、非イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用を含むがこれらに限定されない。物理的相互作用は、直接的または間接的でありうる。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介しうるかまたはそれらに起因しうる。直接結合は、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介してかまたはそれらに起因して生じることがないばかりか他の実質的な化学中間体を伴うことがない相互作用を示す。
本明細書中で用いられる「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換される場合の置換を示す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性の極性側鎖(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β−分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
本明細書中で用いられる「CSFVの断片」または「CSFVの一部」という用語は、天然CSFVまたはその変異体の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%を含むアミノ酸配列を示す。
本明細書中で用いられる「遺伝子」という用語は、生物学的機能を伴う任意のDNAセグメントを示す。したがって、遺伝子は、その発現にとって必要なコーディング配列および/または調節配列を含むがそれらに限定されない。遺伝子は、例えば他のタンパク質に対する認識配列を形成する発現されないDNAセグメントも含みうる。遺伝子は、目的のソースからのクローニングあるいは既知のまたは予測された配列情報からの合成を含む種々のソースから入手可能であり、所望のパラメータを有するように設計される配列を含みうる。さらに、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、CSFVをコード化するオープンリーディングフレームを含む核酸分子も示す。
本明細書中で用いられる「異種ポリヌクレオチド」、「異種核酸」、「異種遺伝子」、「異種配列」または「外来性DNAセグメント」は、外来源(source foreign)から特定の宿主細胞までを由来とするかもしくはもし同じソース由来であればその元の形態から修飾されたポリヌクレオチド、核酸またはDNAセグメントを示す。宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内在性であっても修飾を受けている遺伝子を含む。したがって、それらの用語は、細胞に対して外来もしくは異種であるか、または同因子が通常認められない宿主細胞核酸内の位置を除いて細胞に対して相同であるDNAセグメントを示す。例として、酵母細胞に対して天然であってもヒトCSFV配列に対して付着されるシグナル配列は異種である。
「相同核酸配列」または「相同アミノ酸配列」あるいはそれらの変異体は、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルで相同であることを特徴とする配列を示す。相同ヌクレオチド配列は、ペプチドのアイソフォームをコードする同配列をコード化したものである。アイソフォームは、例えばRNAの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織内で発現されうる。あるいは、アイソフォームは異なる遺伝子によってコード化されうる。本発明では、相同ヌクレオチド配列は、哺乳動物を含むがそれに限定されないヒト以外の種のCSFVに対してコード化するヌクレオチド配列を含むことから、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、および他の生物を含みうる。相同ヌクレオチド配列は、天然対立遺伝子変異体および本明細書にて示されるヌクレオチド配列の変異体も含むがこれらに限定されない。
本明細書中で用いられる「単離された」核酸配列は、本質的に他の核酸配列を含まない、例えば少なくとも約20%、好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは約60%、さらにより好ましくは約80%、最も好ましくは約90%、およびさらに最も好ましくは約95%純粋な核酸配列を示し、それはアガロースゲル電気泳動によって測定される。例えば、単離された核酸配列を遺伝子操作において用いられる標準のクローニング手順によって得ることで、核酸配列がその天然の位置からそれが再生されることになる異なる部位に再配置されうる。クローニング手順は、ポリペプチドをコード化する核酸配列を含む所望の核酸断片の切除および単離、断片のベクター分子への挿入、および核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製されることになる宿主細胞への組換えベクターの取り込みを含みうる。核酸配列は、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起点、またはこれらの任意の組み合わせに関するものでありうる。
本明細書中で用いられる「多重PCR」という用語は、ゲノム全体にわたる複数の位置を標的にすることを意図した2セット以上のPCRプライマーの反応物への添加を含むPCRを示す。すなわち、特に2つの個体における対立遺伝子が同一である確率は試験される多形性遺伝子座の数の増加に伴って減少することから、それはDNAタイピングに有用である。さらに、IC(例えばEGFP−RNA)との多重化により、PCR全体の内部対照がCSFVリアルタイムPCRの感度または特異性への影響がない状態で提供される。
本明細書中で用いられる「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの重合体を示す。特に限定されるない限り、それらの用語は、参照核酸と類似した結合特性を有しかつ天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチド類似体を有する核酸を包含する。他に指定されない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体(例えば縮重コドン置換体)および相補配列ならびに明示的に示された配列も暗黙的には包含する。特に、縮重コドン置換は、1つもしくは複数の選択された(またはすべての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基と置換される場合の配列を生成することによって行われうる(バッツァー(Batzer)ら(1991年) Nucleic Acid Res.19:5081頁;オオツカ(Ohtsuka)ら(1985年) J.Biol.Chem.260:2605−2608頁;カッソル(Cassol)ら(1992年);ロッソリーニ(Rossolini)ら(1994年) Mol.Cell.Probes 8:91−98頁)。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコード化されるmRNAと同義的に用いられる。本明細書中で用いられる「核酸」、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、DNA分子(例えばcDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子(例えばmRNA)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されるDNAまたはRNAの類似体、ならびにそれらの誘導体、断片および相同体を含むように意図される。
本明細書中で用いられる略語「nt」はヌクレオチドを意味する。
本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は一連の連結されたヌクレオチド残基を示し、オリゴヌクレオチドはPCR反応にて用いられるべき極めて多数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムもしくはcDNA配列に基づきまたはそれらから設計可能であり、それを用いると、特定の細胞内または組織内で同一の、類似のもしくは相補的なDNAまたはRNAが増幅され、それらの存在が確認または明示される。オリゴヌクレオチドは、約10nt長、50nt長もしくは100nt長、好ましくは約15nt長〜30nt長を有する核酸配列の一部を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、化学的に合成可能でかつプローブとして使用可能である。
本明細書中で用いられるDNAセグメントは、別のDNAセグメントとの機能的関連性の中に配置される場合、「作動可能に連結された(operably linked)」または「作動可能に連結された(operatively linked)」と称される。一般に、作動可能に連結されたDNA配列は隣接し、シグナル配列または融合タンパク質の場合には隣接しかつリーディング相にある。しかし、エンハンサーは、それにより転写調節されるコーディング配列と隣接する必要がない。これに関連し、好都合な制限部位またはその代わりに挿入されるアダプターもしくはリンカー位置でのライゲーションにより連結が行われる。
本明細書中で用いられる「PCR」は、一般に、熱安定性ポリメラーゼ、および増幅されるべき配列において一方の末端で(+)−鎖に相補的なものと他方の末端で(−)−鎖に相補的なものからなる2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、DNAまたはRNA塩基配列を増幅するための方法を示す。新規に合成されたDNA鎖またはcDNA鎖が結果的に同じプライマー配列における追加的な鋳型として機能しうることから、プライマーのアニーリング、鎖伸長、および解離のラウンドにおける成功が、所望の配列の迅速かつ高度に特異的な増幅をもたらす。
本明細書中で用いられる「プローブ」という用語は、使用に依存し、可変長、好ましくは少なくとも約10nt〜約100ntの核酸配列を示す。プローブは、同一の、類似の、または相補的な核酸配列の検出において用いられる。長い方のプローブは、通常天然または組換えソース(recombinant source)から得られ、高度に特異的であり、ハイブリダイズするのがオリゴマーと比べてはるかに遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖であり、PCR、膜ベースのハイブリダイゼーション技術、またはELISA様の技術、好ましくはPCR、より好ましくはRT−PCR、およびさらにより好ましくはリアルタイムRT−PCRにおいて特異性を有するように設計される場合がある。
本明細書中で用いられる「プライマー」という用語は、増幅されるべきゲノム断片の始まりおよび末端と正確にマッチする、通常では50bp以下、好ましくは18〜25bpヌクレオチド(DNAが通常は二本鎖であることからその長さは塩基対単位で測定され、一本鎖DNAの長さは塩基もしくはヌクレオチド単位で測定される)の短い人工のオリゴヌクレオチド鎖を示す。プライマーは、DNA鋳型に開始点および終結点でアニール(付着)し、そこではDNAポリメラーゼが結合し、新しいDNA鎖の合成を開始する。プライマーの長さおよびそれらの融解温度(Tm)の選択は数多くの検討に依存する。プライマーの融解温度は、PCRプロセスの第1のステップにおけるDNAの融解温度と混同されるべきではなく、それ未満ではプライマーがDNA鋳型にアニールし、それを超えるとプライマーがDNA鋳型から解離(分離)することになる温度と定義される。融解温度は、プライマーの長さとともに高くなる。プライマーが短すぎると長いDNA鋳型上の数か所の位置でアニールされ、非特異的なコピーが生じることになろう。他方、プライマーの長さはそれを融解させるのに要する温度によって制限を受ける。融解温度が高すぎると(すなわち80℃超)DNAポリメラーゼの活性が低下することから、かかる温度も問題を引き起こしうる。最適な融解温度は60℃〜75℃である。フォワード配列決定プライマーはリバースプライマーに対して5’でアニールし、リバース配列決定プライマーはフォワードプライマーに対して3’でアニールする。プライマーと参照配列の間の関連性は、用いられる座標系に依存する。座標系ではフォワードプライマーがリバースプライマーに対して論理的に左になることから、フォワードプライマーのアニーリング位置は通常、リバースプライマーのアニーリング位置よりも小さいことになる。
本明細書中で用いられる「プロモーター」という用語は、転写を開始するためのRNAポリメラーゼへの結合に関与するDNAの領域を示す。
本明細書中で用いられる「組換え」という用語は、遺伝子またはDNAの新たな組み合わせを有する、形質転換を受けている細胞、組織または生物を示す。
本明細書中で用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリダイズするが他の配列とは全くハイブリダイズしないという条件を示す。ストリンジェントな条件は、配列に依存しかつ異なる環境下で異なることになる。長い方の配列は、短い方の配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびpHで特異的配列に対して熱融解点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列に対して相補的なプローブの50%が平衡時に標的配列にハイブリダイズする(所定のイオン強度、pHおよび核酸濃度の下での)温度である。標的配列は一般にTmで過剰に存在することから、50%のプローブは平衡時に占有される。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的にはpH7.0〜8.3で約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン(または他の塩)であり、かつ温度は、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、10nt〜50nt)において少なくとも約30℃、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドにおいて少なくとも約60℃である場合の条件ということになる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によっても実現されうる。ストリンジェントな条件は、当業者にとって既知であり、アウスベル(Ausubel)ら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー&サンズ(John Wiley&Sons)(ニューヨーク)(1989年)、6.3.1−6.3.6の中に見出されうる。好ましくは、同条件は、互いに少なくとも約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%または99%の相同性を示す配列が典型的には互いにハイブリダイズされた状態であるようなものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の限定されない例として、6×SSC、50mM トリス−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02%フィコル(Ficoll)、0.02% BSA、および500mg/mlの変性されたサケ精子DNAを65℃で含有する高塩緩衝液中でのハイブリダイゼーションと、それに続く50℃、0.2×SSC、0.01% BSA中での1回または複数回の洗浄が挙げられる。
本明細書中で用いられる「被験者」という用語は、ヒトあるいは動物、好ましくはブタ、ウシ、ヒツジまたはイノシシでありうる。
本明細書中で用いられる「タックマン(TaqMan)」という用語は、一般にタック(Taq)DNAポリメラーゼの5’−>3’エキソヌクレアーゼ活性を用いることにより、PCR産物内の特異的配列を検出するのに使用されるプローブを示す。タックマン(TaqMan)プローブ(約20〜30bp)は、3’末端側での伸長から使用不可であり、蛍光レポーター色素および蛍光クエンチャー色素で標識された部位特異的配列からなる。PCRの間、タックマン(TaqMan)プローブは、PCR標的内のそれに相補的な一本鎖DNA配列にハイブリダイズする。増幅が生じる場合、タックマン(TaqMan)プローブはタック(Taq)DNAポリメラーゼの5’−>3’のエキソヌクレアーゼ活性が原因で劣化し、それにより伸長する間にクエンチャーをレポーターから分離する。レポーター上での消光効果の放出に起因し、レポーター色素の蛍光強度は増加する。増幅プロセス全体にわたり、この光放射は指数関数的に増加し、最終レベルはPCRの終了後に分光測光によって測定される。レポーター色素の蛍光強度の増加がプローブのハイブリダイゼーションおよび標的配列の増幅が生じている場合に限ってなされることから、タックマン(TaqMan)アッセイは、特異的配列の存在または非存在を測定するための高感度な方法を提供する。したがって、この技術は、試料における好ましい特徴の存在または取り込みについてのスクリーニングおよび病原体および疾患の検出などの診断用途において特に有用である。検出にはゲル電気泳動を全く必要としないことから、タックマン(TaqMan)アッセイは試料の高スループットを可能にする。タックマン(TaqMan)プローブは、PCRにおいて用いられるDNAポリメラーゼの5’−ヌクレアーゼ活性に依存し、標的のアンプリコンにハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを加水分解する。特に、タックマン(TaqMan)プローブは、5’末端側に付着される蛍光レポーター色素および3’末端側に共役されるクエンチャー部分を有するオリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、PCR産物の内部領域にハイブリダイズするように設計される。ハイブリダイズされていない状態では、蛍光レポーター分子と消光分子が接近することにより、プローブからの蛍光シグナルの検出が阻止される。PCRの間、ポリメラーゼがタックマン(TaqMan)プローブが結合した鋳型を複製する場合、ポリメラーゼの5’−ヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。これにより蛍光および消光色素が分離され、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)がもはや生じない。したがって、各サイクルにて蛍光は増大し、それはプローブの切断量に比例する。
本明細書中で用いられる「熱安定性ポリメラーゼ酵素」という用語は、熱に対して安定で耐熱性を示し、ヌクレオチドの組み合わせを適切な様式で触媒する(容易にする)ことで各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成する酵素を示す。一般に、合成は、プライマーの3’末端側で開始されかつ合成が終了するまで鋳型鎖に沿って5’方向に進行することで異なる長さの分子が生成されることになる。しかし、上記と同じプロセスを用いて5’末端側で合成を開始しかつもう一方の方向に進行する熱安定酵素が存在しうる。本明細書における好ましい熱安定酵素は、好熱菌(Thermus aquaticus)から単離されるDNAポリメラーゼである。その様々な株は、米国菌株保存機関(American Type Culture Collection)(メリーランド州ロックビル(Rockville))から入手可能であり、T.D.ブロック(T.D.Brock)、J.Bact.(1969年)98:289−297頁およびT.オシマ(T.Oshima)、Arch.Mircobiol.(1978年)117:189−196頁の中に記載されている。これらの好ましい株の1種はYT−1株である。
本明細書中で用いられる「形質転換」という用語は、核酸(すなわちヌクレオチドポリマー)の細胞への移行を示す。本明細書中で用いられる「遺伝的形質転換」という用語は、DNA、特に組換えDNAの細胞への移行および取り込みを示す。
「変異体」は、参照核酸または参照ポリペプチドと異なるがそれらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたは核酸を示す。一般に、変異体は、参照核酸または参照ポリペプチドと全体的に酷似し、かつ多数の領域内で同一である。
本明細書中で用いられる「ベクター」という用語は、広義には外来核酸をコード化する任意のプラスミド、ファージミドまたはウイルスを示す。同用語は、核酸の例えばポリリシン化合物などのビリオンまたは細胞への移行を促進する非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物を含むようにも解釈される。ベクターは核酸またはその変異体の細胞への送達のための送達媒体として適するウイルスベクターであるか、あるいはベクターは同じ目的に適する非ウイルスベクターでありうる。DNAの細胞および組織への送達を目的としたウイルスおよび非ウイルスベクターの例は、当該技術分野で周知であり、例えばマ(Ma)ら(1997年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12744−12746頁)の中に記載されている。ウイルスベクターの例として、組換え種痘ウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換え鶏痘ウイルスなどが挙げられるがこれらに限定されない(クラナージュ(Cranage)ら、1986年、EMBO J.5:3057−3063頁;1994年8月18日に公表された国際公開第94/17810号パンフレット;1994年10月27日に公表された国際公開第94/23744号パンフレット)。非ウイルスベクターの例として、リポソーム、DNAのポリアミン誘導体などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書中で用いられる「野生型」という用語は、天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を示す。
8.2.発明の実施形態の説明
8.2.1.本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、プライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを包含する。プローブとして使用される場合、オリゴヌクレオチドが標識を含むことは好ましい。例示的実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、または配列番号9のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして有用である。本発明の特定の実施形態は、配列番号2、配列番号4、配列番号5、および配列番号7のオリゴヌクレオチドのプライマーセットを包含することが好ましい。本発明の別の特定の実施形態は、配列番号3、配列番号6、配列番号8、または配列番号9のオリゴヌクレオチドのプローブセットを包含する。別の実施形態では、本発明のプローブは標識をさらに含む。特定の実施形態では、標識は蛍光基、ジゴキシゲニンまたはビオチンである。
8.2.1.本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、プライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを包含する。プローブとして使用される場合、オリゴヌクレオチドが標識を含むことは好ましい。例示的実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、または配列番号9のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはプローブとして有用である。本発明の特定の実施形態は、配列番号2、配列番号4、配列番号5、および配列番号7のオリゴヌクレオチドのプライマーセットを包含することが好ましい。本発明の別の特定の実施形態は、配列番号3、配列番号6、配列番号8、または配列番号9のオリゴヌクレオチドのプローブセットを包含する。別の実施形態では、本発明のプローブは標識をさらに含む。特定の実施形態では、標識は蛍光基、ジゴキシゲニンまたはビオチンである。
本発明の具体的なオリゴヌクレオチドは以下のヌクレオチド配列を有する。
配列番号2:5’−ATGCCCAYAGTAGGACTAGCA−3’
配列番号3:5’−TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT−3’
配列番号4:5’−CTACTGACGACTGTCCTGTAC−3’
配列番号5:5’−GACCACTACCAGCAGAACAC−3’
配列番号6:5’−AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA−3’
配列番号7:5’−GAACTCCAGGACCATG−3’
配列番号8:5’−FAM−TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT−TAMRA−3’
配列番号9:5’−HEX−AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA−BHQ1−3’
配列番号2:5’−ATGCCCAYAGTAGGACTAGCA−3’
配列番号3:5’−TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT−3’
配列番号4:5’−CTACTGACGACTGTCCTGTAC−3’
配列番号5:5’−GACCACTACCAGCAGAACAC−3’
配列番号6:5’−AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA−3’
配列番号7:5’−GAACTCCAGGACCATG−3’
配列番号8:5’−FAM−TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT−TAMRA−3’
配列番号9:5’−HEX−AGCACCCAGTCCGCCCTGAGCA−BHQ1−3’
8.2.1.1.オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成はルーチン化している。核酸合成の詳細な説明として、ゲイト,M.J.(Gait,M.J.)、「Oligonucleotide Synthesis:a Practical Approach.」IRLプレス(IRL Press)(オックスフォード(Oxford)、英国)を参照のこと。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、既知の固相合成における支持体上で合成される。あるいは、それらは溶液中で合成される。当業者は、標識、未標識および/または修飾オリゴヌクレオチド(DNA、RNAおよびそれらの合成類似体)のいずれもが容易に入手できることを理解するであろう。それらを市販の器具および試薬を使用して合成するかまたはカスタム製オリゴヌクレオチドの商用ベンダーから購入してもよい。核酸の合成および標識のための様々な組成物、支持体および方法論について考察している特許には、米国特許第5,476,925号明細書、米国特許第5,453,496号明細書、米国特許第5,446,137号明細書、米国特許第5,419,966号明細書、米国特許第5,391,723号明細書、米国特許第5,391,667号明細書、米国特許第5,380,833号明細書、米国特許第5,348,868号明細書、米国特許第5,281,701号明細書、米国特許第5,278,302号明細書、米国特許第5,262,530号明細書、米国特許第5,243,038号明細書、米国特許第5,218,103号明細書、米国特許第5,204,456号明細書、米国特許第5,204,455号明細書、米国特許第5,198,527号明細書、米国特許第5,175,209号明細書、米国特許第5,164,491号明細書、米国特許第5,112,962号明細書、米国特許第5,071,974号明細書、米国特許第5,047,524号明細書、米国特許第4,980,460号明細書、米国特許第4,923,901号明細書、米国特許第4,786,724号明細書、米国特許第4,725,677号明細書、米国特許第4,659,774号明細書、米国特許第4,500,707号明細書、米国特許第4,458,066号明細書および米国特許第4,415,732号明細書が含まれ、これらの各々は参照により援用される。
オリゴヌクレオチド合成はルーチン化している。核酸合成の詳細な説明として、ゲイト,M.J.(Gait,M.J.)、「Oligonucleotide Synthesis:a Practical Approach.」IRLプレス(IRL Press)(オックスフォード(Oxford)、英国)を参照のこと。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、既知の固相合成における支持体上で合成される。あるいは、それらは溶液中で合成される。当業者は、標識、未標識および/または修飾オリゴヌクレオチド(DNA、RNAおよびそれらの合成類似体)のいずれもが容易に入手できることを理解するであろう。それらを市販の器具および試薬を使用して合成するかまたはカスタム製オリゴヌクレオチドの商用ベンダーから購入してもよい。核酸の合成および標識のための様々な組成物、支持体および方法論について考察している特許には、米国特許第5,476,925号明細書、米国特許第5,453,496号明細書、米国特許第5,446,137号明細書、米国特許第5,419,966号明細書、米国特許第5,391,723号明細書、米国特許第5,391,667号明細書、米国特許第5,380,833号明細書、米国特許第5,348,868号明細書、米国特許第5,281,701号明細書、米国特許第5,278,302号明細書、米国特許第5,262,530号明細書、米国特許第5,243,038号明細書、米国特許第5,218,103号明細書、米国特許第5,204,456号明細書、米国特許第5,204,455号明細書、米国特許第5,198,527号明細書、米国特許第5,175,209号明細書、米国特許第5,164,491号明細書、米国特許第5,112,962号明細書、米国特許第5,071,974号明細書、米国特許第5,047,524号明細書、米国特許第4,980,460号明細書、米国特許第4,923,901号明細書、米国特許第4,786,724号明細書、米国特許第4,725,677号明細書、米国特許第4,659,774号明細書、米国特許第4,500,707号明細書、米国特許第4,458,066号明細書および米国特許第4,415,732号明細書が含まれ、これらの各々は参照により援用される。
8.2.2.本発明の方法
本発明は、1つもしくは複数のCSFV遺伝子をコード化するRNAを逆転写して相補的CSFV(「CSFV cDNA」)を得るステップと、PCR産物を生成する条件下で、2種以上のプライマーを使用して該CSFV cDNAを増幅するステップであって、少なくとも1種のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖の第1の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズしかつ少なくとも1種のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖の第2の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、該PCR産物を核酸プローブと、該プローブがPCR産物またはその相補鎖にハイブリダイズしてハイブリダイズされたプローブをもたらすように接触させるステップと、ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、を含む、被験者の単離された生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法も包含する。
本発明は、1つもしくは複数のCSFV遺伝子をコード化するRNAを逆転写して相補的CSFV(「CSFV cDNA」)を得るステップと、PCR産物を生成する条件下で、2種以上のプライマーを使用して該CSFV cDNAを増幅するステップであって、少なくとも1種のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖の第1の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズしかつ少なくとも1種のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖の第2の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、該PCR産物を核酸プローブと、該プローブがPCR産物またはその相補鎖にハイブリダイズしてハイブリダイズされたプローブをもたらすように接触させるステップと、ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、を含む、被験者の単離された生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法も包含する。
例示的実施形態では、本発明は、生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法であって、
(i)該核酸を逆転写してCSFV cDNAを得るステップと、
(ii)該CSFV cDNAを2種以上のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、該プライマーがcDNAにハイブリダイズするような条件下で少なくとも1種のフォワードプライマーおよび少なくとも1種のリバースプライマーを含み、少なくとも1種のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド75〜150、好ましくはヌクレオチド90〜130、および最も好ましくはヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド155〜205、好ましくはヌクレオチド165〜195、および最も好ましくはヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)PCR産物を第1の核酸プローブと、該プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド130〜175、好ましくはヌクレオチド135〜170、および最も好ましくはヌクレオチド141〜166に対応する標的部位でPCR産物にハイブリダイズしてハイブリダイズされたプローブをもたらすように接触させるステップと、
(iv)該ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法を包含する。
(i)該核酸を逆転写してCSFV cDNAを得るステップと、
(ii)該CSFV cDNAを2種以上のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、該プライマーがcDNAにハイブリダイズするような条件下で少なくとも1種のフォワードプライマーおよび少なくとも1種のリバースプライマーを含み、少なくとも1種のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド75〜150、好ましくはヌクレオチド90〜130、および最も好ましくはヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド155〜205、好ましくはヌクレオチド165〜195、および最も好ましくはヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)PCR産物を第1の核酸プローブと、該プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド130〜175、好ましくはヌクレオチド135〜170、および最も好ましくはヌクレオチド141〜166に対応する標的部位でPCR産物にハイブリダイズしてハイブリダイズされたプローブをもたらすように接触させるステップと、
(iv)該ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法を包含する。
別の実施形態では、本発明は、プラスミドベクターpEGFP−1のEGFP−配列の内部対照(すなわち配列番号10)を添加するステップをさらに包含する。
別の実施形態では、本発明は、少なくとも1種の第2のフォワードプライマーおよび少なくとも1種の第2のリバースプライマーを加え、該添加プライマーにハイブリダイズさせるステップをさらに含む。
別の例示的実施形態では、第2のフォワードプライマーは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド625〜675、好ましくはヌクレオチド630〜665、および最も好ましくはヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第2のリバースプライマーは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド740〜780、好ましくはヌクレオチド745〜775、および最も好ましくはヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズする。
本発明の別の例示的実施形態は、第2の核酸プローブを添加するステップを包含し、ここで該プローブは配列番号10またはその相補鎖にハイブリダイズする。
別の例示的実施形態では、第2の核酸プローブは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド690〜735、好ましくはヌクレオチド695〜730、および最も好ましくはヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズする。
本発明の別の例示的実施形態は、生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法であって、
(i)該核酸を逆転写して相補的CSFV複合体(すなわちCSFV cDNA)を得るステップと、
(ii)該CSFV cDNAを、2種以上の第1のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)該PCR産物を第1の核酸プローブと、該プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
(iv)内部対照および少なくとも2種以上の第2のプライマーを、少なくとも1種の第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種の第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
(v)少なくとも1種の第2の核酸プローブを、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
(vi)該ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法を包含する。
(i)該核酸を逆転写して相補的CSFV複合体(すなわちCSFV cDNA)を得るステップと、
(ii)該CSFV cDNAを、2種以上の第1のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)該PCR産物を第1の核酸プローブと、該プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
(iv)内部対照および少なくとも2種以上の第2のプライマーを、少なくとも1種の第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種の第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
(v)少なくとも1種の第2の核酸プローブを、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
(vi)該ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法を包含する。
本発明の方法における別の特定の実施形態では、プローブをリアルタイムにまたはアッセイの終点にて閉じたチューブ型で独立に検出してもよい。本発明の方法におけるさらに別の特定の実施形態では、少なくとも2種以上の独立に検出可能なPCR産物は、同じ試料および同じアッセイにて目的の2種以上の標的分子(例えばCSFV核酸)を同時に検出、同定または定量化するのに用いられる単一の多重アッセイにおいて存在する。
別の実施形態では、本発明は、CSFV遺伝子をコード化するRNAを逆転写してCSFV cDNAを得るステップと、少なくとも1種のフォワードプライマー(すなわち第1のフォワードプライマー)および少なくとも1種のリバースプライマー(すなわち第1のリバースプライマー)を用いて、該プライマーが該cDNAにハイブリダイズしてPCR産物を形成するような条件下で、該CSFV cDNAを増幅するステップであって、少なくとも1種のフォワードプライマーが配列番号1の第1の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種のリバースプライマーが配列番号1の第2の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、該PCR産物を、PCR産物またはその相補鎖とハイブリダイズしてハイブリダイゼーションプローブを形成する第1の核酸プローブと接触させるステップと、該ハイブリダイゼーションプローブの存在を検出するステップとを含む、生体試料中でのCSFV核酸の多重リアルタイムRT−PCR検出のための方法を包含する。本発明は、配列番号10の内部対照ならびに2種以上のさらなるフォワードプライマー(すなわち第2のフォワードプライマー)および2種以上のさらなるリバースプライマー(すなわち第2のリバースプライマー)の存在をさらに含み、ここで、少なくとも1種のさらなるフォワードプライマーは配列番号10またはその相補鎖の第1の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズしかつ少なくとも1種のさらなるリバースプライマーは配列番号10またはその相補鎖の第2の群のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、ならびに配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド群に対応する標的部位にハイブリダイズする第2の核酸プローブの添加をさらに含む。
例示的実施形態では、第1のフォワードプライマーは、配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド75〜150、好ましくはヌクレオチド90〜130、および最も好ましくはヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第1のリバースプライマーは、配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド155〜205、好ましくはヌクレオチド165〜195、および最も好ましくはヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第1のプローブは、配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド130〜175、好ましくはヌクレオチド135〜170、および最も好ましくはヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズする。
別の例示的実施形態では、第2のフォワードプライマーは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド625〜675、好ましくはヌクレオチド630〜665、および最も好ましくはヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第2のリバースプライマーは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド740〜780、好ましくはヌクレオチド745〜775、および最も好ましくはヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の例示的実施形態では、第2のプローブは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド690〜735、好ましくはヌクレオチド695〜730、および最も好ましくはヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズする。
特定の実施形態では、本発明は、1チューブプロトコルにおける異種内部対照(「IC」)を含む、CSFVゲノムの検出を目的とした、標準化された高感度のCSFVに特異的な多重リアルタイムRT−PCRを包含する。本発明の実施形態によると、100%マッチングするオリゴヌクレオチドを示す78種の異なるCSFV株の5’−NTRコンセンサス配列を用い、両方のプライマー(例えば、フォワードおよびリバースプライマー)ならびにタックマン(TaqMan)−プローブが選択され、少数のCSFV単離物が公表されたCSFV配列と比べて最大で1個のヌクレオチド交換を含むプライマー結合部位を有しただけだった。CSF−システム1(CSF−System1)のCSFVプライマーおよびタックマン(TaqMan)−プローブでは、プローブ領域内で2つまでのミスマッチを含むゲノム配列の検出が可能であった。「CSF−システム1(CSF−System1)」は、プライマー対のCSF100−F/CSF192−RとFAMで標識されたプローブのCSF−プローブ1(CSF−Probe1)とからなり(図1、表1)、CSFV(アルフォート(Alfort)187株[登録番号X87939];図1)の5’−NTRにおける100〜192ntの93bpの断片を増幅する。すべての異なるCSFV株および単離物の検出が考えられ、異なる遺伝子型の大量のCSFVを伴うすべての試験で、CSF−システム1(CSF−System1)におけるすべてのCSFV株および単離物に対する検出能が示された。CSF−システム1(CSF−System1)の種特異性を証明するため、大量の異なるBDV、BVDV1、BVDV2および非定型ぺスティウイルスについて試験し、100%のCSF特異性が得られた。
ICは、RNA分解または阻害作用に起因する偽陰性の結果を回避するのに用いられる(ホフマン(Hofmann)、「Construction Of An Infectious Chimeric Classical Swine Fever Virus Containing The 5’UTR Of Bovine Viral Diarrhea Virus,And Its Application As A Universal Internal Positive Control In Real−Time RT−PCR」 J.Virol.Methods、2003年、114、77−90頁)。インビトロで転写されたEGFP RNAは、独立したプライマー/プローブ系を用いて検出されたものであり、内部対照として使用されうる。このICをさらに他の病原体を対象とする多重PCRアッセイにおいて用いてもよい。あるいは、ハウスキーピング遺伝子または標的のCSFV配列を模倣する内部対照を用いてもよい(ゴルゼルニック(Gorzelnik)ら、「Validation Of Endogenous Controls For Gene Expression Studies In Human Adipocytes And Preadipocytes.」 Horm.Metab.Res.、2001年、33、625−627頁;コリムボーカス(Korimbocus)ら、「Improved Detection Of Sugarcane Yellow Leaf Virus Using A Real−Time Fluorescent(Taqman)RT−PCR Assay.」 J.Virol.Methods、2002年、103、109−120頁)。しかし、ハウスキーピング遺伝子は、それらの濃度が特に血漿または血清のような細胞を含有しない試料中では未知であるという欠点を有する。最近公表されたCSFV多重PCR(例えばホフマン(Hofmann)、2003年)と異なり、感染性の遺伝子操作されたCSFVの使用が回避されることから、本発明のIC系は標準のバイオセーフティーレベル2の研究所でなくても使用されうる。異種のインビトロで転写されたRNAのICとしての使用は、パッケージングされたRNアーゼから保護されたウイルスRNAからのRNA抽出を完全にシミュレートすることはない(ドロステン(Drosten)ら、2001年、「Taqman 5’ Nuclease Human Immunodeficiency Virus Type 1 PCR Assay With Phage−Packaged Competitive Internal Control For High−Throughput Blood Donor Screening.」 J.Clin.Microbiol、2001年、39、4302−4308頁)。CSFV RNAの抽出において重要なのは、抽出ステップの間でのIC RNAの分解でもRNAのビリオンからの放出でもない。したがって、本発明は、ユニバーサルな非感染性のIC RNAを提供し、それは40回の凍結/解凍サイクル後であっても安定であることが示された。
本発明は、極めて低い濃度のIC、極めてわずかな量のICプライマー、およびICアンプリコンの使用を可能にし、ICアンプリコンはCSFVに特異的なアンプリコンよりも有意に長いように選択されることで、一方ではCSF−システム1(CSF−System1)の高感度が実現され、もう一方では多重アッセイにおけるICの相対的に一定の増幅が可能になる。その結果、単一および多重CSFアッセイにおいて同一の分析感度を実現できる。インビトロで転写された陽性RNAのlog2−希釈を用い、単一および多重系においてRT−PCR反応当たり8コピーの平均検出限界が9回のlog10ステップの広範なダイナミックレンジと組み合わせて得られる。それにもかかわらず、膨大な量の標的RNAを用いると、IC増幅の阻害が観察される可能性があった。ICは大量のCSFV標的RNAの場合に不適切な偽陰性の結果を除外するために用いられることから、IC増幅におけるこの部分的または完全な阻害は許容される(ホフマン(Hofmann)、2003年、上記参照)。さらに、CSF−システム1(CSF−System1)多重RT−PCRの感度は、CSF診断における「ゴールドスタンダード(gold standard)」と見なされるウイルス単離の感度に匹敵する。さらに、「ゴールドスタンダード」として用いられる細胞培養系の感度が計算にとって重要であることから、CSFVアルフォート(Alfort)187のような細胞培養に適する株における結果がCSFVフィールド単離物の場合と比べて異なる可能性がある。
多重バージョンのCSF−システム1(CSF−System1)を用いた様々な遺伝子型の36種のCSFV単離物の分析によると、すべてのCSFVにおいて類似の検出特性が示された。遺伝子型3.4 CSFV「カナガワ(Kanagawa)」株の場合であっても、蛍光シグナルおよび閾値サイクルに関する差異が全く観察されなかった。発明者らのCSF−システム1(CSF−System1)と異なり、公表されたCSFVに特異的なリアルタイムRT−PCRアッセイは、5’NTR内の下流の方に位置する配列をベースとするものであり、「カナガワ(Kanagawa)」株の場合に浅い蛍光曲線のみが生成された(マックゴールドリック(McGoldrick)ら、1998年)。
CSFVプライマーおよびタックマン(TaqMan)−プローブの効率的な調節のため、プラスミドをベースとする非感染性の陽性対照が構築される。CSFV陽性の試料中に含有されるウイルスRNAを定量するための標準として、インビトロで転写された陽性対照RNAの段階希釈物が用いられる。したがって、本発明の多重CSF−システム1(CSF−System1)における両対照(ICおよびPC)は、インビトロで転写された非感染性のRNAである。
本発明は、(a)「1チューブ」RT−PCR反応、(b)有効かつ高効率なRT−PCRキットの使用、(c)安定で非感染性のICの統合、(d)定量可能な非感染性のPCの使用、および(e)高感度かつCSFVに特異的な2色の多重RT−PCR反応としての完全系の検証を包含する2色の多重リアルタイムRT−PCRシステムをさらに包含する。
特に、本発明のリアルタイムRT−PCR法は、ブタの一時的な感染を可能にし、この場合、CSFVの臨床的徴候が細胞培養物の単離方法の場合よりも早期に、高頻度に、かつ長期間にわたって検出されることは全くない。標準化されたPCRシステムを、撲滅キャンペーンまたは緊急の場合でのCSFVの高感度かつ特異的な検出における強力なツールとして用いてもよい。
8.2.2.1.多重分析
本発明の好ましい実施形態では、多重ハイブリダイゼーションアッセイが行われる。多重分析は、アッセイの間またはアッセイ後での試料成分またはそれらに関連するデータを分類する能力に依存している。本発明の好ましい実施形態では、明確な独立に検出可能な部分を用いて、2つ以上の異なる複合体の成分が標識される。明確に(独立に)標識された各複合体と標的配列とのハイブリダイゼーションに相関するデータが、試料中で検出されるべき検索対象である各々の標的配列または標的分子の存在、非存在または量と相関する可能性があることから、独立に検出可能な各部分間で識別しかつ/または各部分を定量する能力により、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化するための手段がもたらされる。
本発明の好ましい実施形態では、多重ハイブリダイゼーションアッセイが行われる。多重分析は、アッセイの間またはアッセイ後での試料成分またはそれらに関連するデータを分類する能力に依存している。本発明の好ましい実施形態では、明確な独立に検出可能な部分を用いて、2つ以上の異なる複合体の成分が標識される。明確に(独立に)標識された各複合体と標的配列とのハイブリダイゼーションに相関するデータが、試料中で検出されるべき検索対象である各々の標的配列または標的分子の存在、非存在または量と相関する可能性があることから、独立に検出可能な各部分間で識別しかつ/または各部分を定量する能力により、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化するための手段がもたらされる。
それ故、同じ試料および同じアッセイにおいて2つ以上の標的配列または標的分子の存在、非存在または量を同時検出するのに本発明の多重アッセイの利用が可能である。複合体が自動的(self−indicating)であり、かつ独立に検出可能であるように設計されうることから、本発明の多重アッセイを閉じたチューブ型にて行い、同じアッセイにおいて目的の2種以上の標的配列または標的分子に対する試料の同時リアルタイムおよび終点分析についてのデータを得てもよい。加えて、アッセイを単分子プローブの取り込みによってさらに多重化し、それによってアッセイ性能を確認するか、またはアッセイを用いて目的の標的配列または標的分子に特異的な特徴を同定してもよい。
8.2.2.2.多重用途
以下の実施例によって説明されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む用途に対して特に有用であり、この場合、各オリゴヌクレオチドは少なくとも1種の独立に検出可能な部分を含む。好ましくは、独立に検出可能な部分は独立に検出可能なフルオロフォアである。例えば、1つもしくは複数の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を用い、4つの異なる標的配列の各々の検出が可能であり、この場合、1つもしくは複数のオリゴヌクレオチドは1つもしくは複数の独立に検出可能なフルオロフォアを含む。この例においては、混合物が目的試料とともにインキュベートされた後、異なる独立に検出可能な各フルオロフォアの検出および/または定量により、異なる標的配列の存在、非存在または量の検出がなされうる。既に考察したように、アッセイにおいてオリゴヌクレオチドも使用可能であり、この場合、独立に検出可能な部分を用い、同じアッセイにおいて生じる同じまたは異なるプロセスの作用が区別される。かかる多重アッセイは、オリゴヌクレオチドがプローブまたはプライマーのいずれとして使用されるかについて対応可能である。
以下の実施例によって説明されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドセットを含む用途に対して特に有用であり、この場合、各オリゴヌクレオチドは少なくとも1種の独立に検出可能な部分を含む。好ましくは、独立に検出可能な部分は独立に検出可能なフルオロフォアである。例えば、1つもしくは複数の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を用い、4つの異なる標的配列の各々の検出が可能であり、この場合、1つもしくは複数のオリゴヌクレオチドは1つもしくは複数の独立に検出可能なフルオロフォアを含む。この例においては、混合物が目的試料とともにインキュベートされた後、異なる独立に検出可能な各フルオロフォアの検出および/または定量により、異なる標的配列の存在、非存在または量の検出がなされうる。既に考察したように、アッセイにおいてオリゴヌクレオチドも使用可能であり、この場合、独立に検出可能な部分を用い、同じアッセイにおいて生じる同じまたは異なるプロセスの作用が区別される。かかる多重アッセイは、オリゴヌクレオチドがプローブまたはプライマーのいずれとして使用されるかについて対応可能である。
8.2.3.本発明のプローブ
本発明の別の実施形態は、配列番号1またはその相補鎖の標的領域にハイブリダイズする第1のプローブを包含しかつ検出可能なシグナルを提供する。本発明のさらに別の実施形態は、配列番号10またはその相補鎖の標的領域にハイブリダイズする第2のプローブを包含しかつ検出可能なシグナルを提供する。
本発明の別の実施形態は、配列番号1またはその相補鎖の標的領域にハイブリダイズする第1のプローブを包含しかつ検出可能なシグナルを提供する。本発明のさらに別の実施形態は、配列番号10またはその相補鎖の標的領域にハイブリダイズする第2のプローブを包含しかつ検出可能なシグナルを提供する。
より特定の実施形態では、第1のプローブは、配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド130〜175に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の特定の実施形態では、第1のプローブは、配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド135〜170に対応する標的部位にハイブリダイズする。さらに別の特定の実施形態では、第1のプローブは、配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズする。
別の特定の実施形態では、第2のプローブは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド690〜735に対応する標的部位にハイブリダイズする。別の特定の実施形態では、第2のプローブは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド695〜730に対応する標的部位にハイブリダイズする。さらに別の特定の実施形態では、第2のプローブは、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズする。
本発明の別の特定の実施形態では、本発明のプローブはオリゴヌクレオチドプローブである。より特定の実施形態では、プローブは50個までのヌクレオチドを含み、好ましくはプローブは約10〜30ヌクレオチド長であり、かつより好ましくはオリゴヌクレオチドプローブは約15〜25ヌクレオチド長である。さらにより特定の実施形態では、プローブの配列は配列番号3または配列番号6である。別の特定の実施形態では、プローブは蛍光標識される。
8.2.3.1.標識
本発明のプローブに付着される標識は、少なくとも1つのドナーおよび少なくとも1つのアクセプター部分を含む、1セットのエネルギーまたは電子移動部分を含む。標識は、標識を識別する任意のタイプ(例えば、CSFに特異性を示さない核酸配列)、検出可能な分子(例えば、フルオレセインイソチオシアネートを例として用いる既知の方法によって挿入可能な蛍光基)、またはジゴキシゲニン、あるいは(例えばオリゴヌクレオチドがストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合されうるという手段による)ビオチンなどの固定化可能な分子でありうる。
本発明のプローブに付着される標識は、少なくとも1つのドナーおよび少なくとも1つのアクセプター部分を含む、1セットのエネルギーまたは電子移動部分を含む。標識は、標識を識別する任意のタイプ(例えば、CSFに特異性を示さない核酸配列)、検出可能な分子(例えば、フルオレセインイソチオシアネートを例として用いる既知の方法によって挿入可能な蛍光基)、またはジゴキシゲニン、あるいは(例えばオリゴヌクレオチドがストレプトアビジンでコーティングされた表面に結合されうるという手段による)ビオチンなどの固定化可能な分子でありうる。
典型的には、標識は単一のドナー部分および単一のアクセプター部分を含むであろう。それにもかかわらず、標識は2つ以上のドナー部分および/または2つ以上のアクセプター部分を含みうる。例えば、1セットは3つの部分が含みうると思われる。部分1は、ドナーフルオロフォアである可能性があり、放出されて部分2と極めて近い位置にある場合、次いで標識の部分2へのエネルギー移動を起こしうる。その後、部分2は、励起されて部分3と極めて近い位置にある場合、標識の部分3へのエネルギー移動を起こしうる。その結果、3つすべての部分間でエネルギー移動が起こる。このセットでは、部分2は部分1からのエネルギーのアクセプターでありかつ部分3へのエネルギーのドナーでもある。
ドナーおよびアクセプター部分は、1つもしくは複数のアクセプター部分が1つもしくは複数のドナー部分からのエネルギー移動を受けるかそれ以外では1つもしくは複数のドナー部分からのシグナルをクエンチするように作用する。標識の密接に関連した部分間の衝突(非FRET)または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などの非放射プロセスを介してエネルギー移動が発生しうる。FRETの発生におけるドナーおよびアクセプター部分間のエネルギー移動では、部分間が空間的に近くかつドナーの放射スペクトルがアクセプターの吸収スペクトルとの実質的な重複部を有することが必要とされる(ヤロン(Yaron)ら、Analytical Biochemistry、95、228−235頁(1979年)の特に232頁、col.1〜234頁、col.1を参照)。あるいは、極めて密接に関連したドナーおよびアクセプター部分間では、ドナー部分の放射スペクトルがアクセプターの吸収スペクトルとの実質的な重複部を有するか否かに無関係に非FRETエネルギー移動が発生しうる(ヤロン(Yaron)ら、Analytical Biochemistry、95、228−235頁(1979年)の特に229頁、col.1〜232頁、col.1を参照)。ドナーおよびアクセプター部分の直接接触によってクエンチングが引き起こされると考えられていることから、このプロセスは分子内衝突(intramolecular collision)と称される。
好ましいドナーおよびアクセプター部分は、それぞれフルオロフォアおよびクエンチャーの組み合わせである。極めて多くのアミン反応性標識試薬は市販されている(例えば、モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)(オレゴン州ユージン(Eugene)))。好ましい標識試薬は、カルボン酸またはカルボン酸のN−ヒドロキシスクシニジルエステルとして供給されるであろう。好ましい蛍光色素(フルオロフォア)としては、5(6)−カルボキシフルオレセイン(Flu)、6−((7−アミノ−4−メチルクマリン−3−アセチル)アミノ)ヘキサン酸(Cou)、5(および6)−カルボキシ−X−ローダミン(Rox)、シアニン2(Cy2)色素、シアニン3(Cy3)色素、シアニン3.5(Cy3.5)色素、シアニン5(Cy5)色素、シアニン5.5(Cy5.5)色素、シアニン7(Cy7)色素、シアニン9(Cy9)色素(シアニン2、3、3.5、5および5.5はアマシャム(Amersham)(イリノイ州アーリントンハイツ(Arlington Heights))からのNHSエステルとして入手できる)またはアレキサ(Alexa)色素シリーズ(モレキュラー・プローブス(Molecular Probes)(オレゴン州ユージン(Eugene)))が挙げられる。最も好ましいフルオロフォアは、フルオレセインの誘導体であり、特に5および6−カルボキシフルオレセインである。アクセプター部分は第2のフルオロフォアでありうるが、好ましくはアクセプター部分はクエンチャー部分である。クエンチャー部分は、フルオロフォアなどのドナー部分からの検出可能なシグナルをクエンチしうる部分である。最も好ましくは、クエンチャー部分は、1つもしくは複数のアゾ基またはニトロ基と置換される芳香族または複素芳香族部分である。最も好ましいクエンチャー部分は、4−((−4−(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸(ダブシル)である。
8.2.4.本発明のキット
本発明は、本発明に従うプライマーを含むCSFVを検出するためのキットおよびPCRを行うための別々にパッケージ化された試薬も包含する。かかるキットは、好ましくは少なくとも1種の、プライマーによって増幅される領域内でCSFVを検出する標識オリゴヌクレオチドを含む。キットのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号7でありうる。キットの標識オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号3、配列番号6、配列番号8または配列番号9でありうる。ここで配列番号3および配列番号6は、必要に応じて標識されるものである。
本発明は、本発明に従うプライマーを含むCSFVを検出するためのキットおよびPCRを行うための別々にパッケージ化された試薬も包含する。かかるキットは、好ましくは少なくとも1種の、プライマーによって増幅される領域内でCSFVを検出する標識オリゴヌクレオチドを含む。キットのオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号2、配列番号4、配列番号6および配列番号7でありうる。キットの標識オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号3、配列番号6、配列番号8または配列番号9でありうる。ここで配列番号3および配列番号6は、必要に応じて標識されるものである。
本発明の好ましいキットは、PCR反応を行うためのすべての試薬を含み、ここでキットの各標識プローブは、試料におけるCSFVの存在、非存在または量について監視するのに使用される。好ましい実施形態では、キットの1つもしくは複数のオリゴヌクレオチドは、PCR反応におけるプライマーとして機能する。
典型的なキットは、少なくとも2種のプライマー、少なくとも1種のプローブ、三リン酸ヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素(好ましくは熱安定性ポリメラーゼ)および(イオン強度の調節、マグネシウム含量の調節およびpH調節因子を伴う)緩衝溶液を含むことになる。
9.実施例
A.実施例1:ウイルスおよび細胞
この試験で使用するウイルス(9×BDV、22×BVDV 1、19×BVDV 2、36×CSFV、非定型ぺスティウイルスジラフ(Giraffe)(アヴァロス(Avalos)ら、2001年)、非定型ぺスティウイルスD32/00「HoBi」[スキルマイアー(Schirrmeier)ら、2004年])は、フリードリッヒ・レフラー・インスティテュート(Friedrich−Loeffler−Institut)(インゼルリームス(Insel Riems)、ドイツ)に位置するCSFを対象とするナショナル・リファレンス・ラボラトリー(National Reference Laboratory)のウイルスバンクの中に挙げられる。単離物の一部をCSFを対象とするコミュニティ・リファレンス・ラボラトリー(Community Reference Laboratory)(ハノーバー獣医科大学(TiHo Hannover)(ドイツ))から入手した。ブタ腎細胞(PK−15)を用いてすべてのCSFV株を培養する一方、ウシ腎細胞(MDBK)またはヒツジ胸腺細胞(SFT−R)を用いてBDVおよびBVDVを増殖させた。細胞系は、コレクション・オブ・セル・ラインズ・イン・ベテリナリー・メディスン(Collection of Cell Lines in Veterinary medicine)(CCLV)(インゼルリームス(Insel Riems)(ドイツ))により供与を受けた。
A.実施例1:ウイルスおよび細胞
この試験で使用するウイルス(9×BDV、22×BVDV 1、19×BVDV 2、36×CSFV、非定型ぺスティウイルスジラフ(Giraffe)(アヴァロス(Avalos)ら、2001年)、非定型ぺスティウイルスD32/00「HoBi」[スキルマイアー(Schirrmeier)ら、2004年])は、フリードリッヒ・レフラー・インスティテュート(Friedrich−Loeffler−Institut)(インゼルリームス(Insel Riems)、ドイツ)に位置するCSFを対象とするナショナル・リファレンス・ラボラトリー(National Reference Laboratory)のウイルスバンクの中に挙げられる。単離物の一部をCSFを対象とするコミュニティ・リファレンス・ラボラトリー(Community Reference Laboratory)(ハノーバー獣医科大学(TiHo Hannover)(ドイツ))から入手した。ブタ腎細胞(PK−15)を用いてすべてのCSFV株を培養する一方、ウシ腎細胞(MDBK)またはヒツジ胸腺細胞(SFT−R)を用いてBDVおよびBVDVを増殖させた。細胞系は、コレクション・オブ・セル・ラインズ・イン・ベテリナリー・メディスン(Collection of Cell Lines in Veterinary medicine)(CCLV)(インゼルリームス(Insel Riems)(ドイツ))により供与を受けた。
B.実施例2:細胞培養を用いたウイルス単離
細胞培養物にウイルス株の異なる希釈物を接種し、37℃でインキュベートした。4日後、細胞の単層を熱固定し、ぺスティウイルスに特異的なモノクローナル抗体C16で染色した(ピーターズ(Peters)ら、1986年)。すべてのウイルス単離を2通りに行った。CSFVの力価をlog10希釈ステップを用いて4通りに測定した。ウイルス力価を1ml当たりの50%組織培養感染量(TCID50)として計算した。
細胞培養物にウイルス株の異なる希釈物を接種し、37℃でインキュベートした。4日後、細胞の単層を熱固定し、ぺスティウイルスに特異的なモノクローナル抗体C16で染色した(ピーターズ(Peters)ら、1986年)。すべてのウイルス単離を2通りに行った。CSFVの力価をlog10希釈ステップを用いて4通りに測定した。ウイルス力価を1ml当たりの50%組織培養感染量(TCID50)として計算した。
C.実施例3:RNAの単離および内部対照の添加
QIAアンプ(QIAamp)ウイルスRNAキット(キアゲン(Qiagen))を製造業者の使用説明書に従って使用し、ウイルスRNAを細胞培養物から抽出し、内部対照(IC)RNAの添加により修飾した。つまり、細胞培養上清140μlを溶解緩衝液560μlに添加し、ボルテックスし、室温で5分間インキュベートした。次いで、5μlのインビトロで転写したIC RNA(2×105コピー/μl)を添加した。5分後、エタノール560μlを添加し、溶液をQIAアンプ(QIAamp)スピンカラムにより遠心した。カラムを適切な緩衝液で2回洗浄後、RNAを溶出緩衝液50μlを用いて溶出し、−20℃で保存した。
QIAアンプ(QIAamp)ウイルスRNAキット(キアゲン(Qiagen))を製造業者の使用説明書に従って使用し、ウイルスRNAを細胞培養物から抽出し、内部対照(IC)RNAの添加により修飾した。つまり、細胞培養上清140μlを溶解緩衝液560μlに添加し、ボルテックスし、室温で5分間インキュベートした。次いで、5μlのインビトロで転写したIC RNA(2×105コピー/μl)を添加した。5分後、エタノール560μlを添加し、溶液をQIAアンプ(QIAamp)スピンカラムにより遠心した。カラムを適切な緩衝液で2回洗浄後、RNAを溶出緩衝液50μlを用いて溶出し、−20℃で保存した。
D.実施例4;プライマー、プローブおよびタックマン(TaqMan)(登録商標)リアルタイムRT−PCR
ジェネティックス・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group)ソフトウェアパッケージ(GCGウィスコンシン(GCG Wisconsin))を用い、異なるCSFV配列の整列を行った。整列に基づくプライマーおよびプローブの選択をソフトウェアパッケージビーコン・デザイナー(Beacon Designer)2.06(プレミア・バイオソフト(PremierBiosoft))で対応した。すべてのオリゴヌクレオチドをMWGバイオテックAG(MWG Biotech AG)(エバースバーグ(Ebersberg)、ドイツ)によって合成し、使用するまで−20℃で保存した。表1は、本報のリアルタイムRT−PCRアッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを示す。
ジェネティックス・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group)ソフトウェアパッケージ(GCGウィスコンシン(GCG Wisconsin))を用い、異なるCSFV配列の整列を行った。整列に基づくプライマーおよびプローブの選択をソフトウェアパッケージビーコン・デザイナー(Beacon Designer)2.06(プレミア・バイオソフト(PremierBiosoft))で対応した。すべてのオリゴヌクレオチドをMWGバイオテックAG(MWG Biotech AG)(エバースバーグ(Ebersberg)、ドイツ)によって合成し、使用するまで−20℃で保存した。表1は、本報のリアルタイムRT−PCRアッセイにおいて用いられるプライマーおよびプローブを示す。
交差汚染のリスクを最小限にするため、市販のクアンチテクト(QuantiTect)(商標)プローブ(Probe)RT−PCRキット(キアゲン(Qiagen))を使用し、1ステップRT−PCRプロトコルを選択した。全容量25μlを用い、リアルタイムRT−PCRアッセイを最適化した。つまり、単一のウェルにおいて、3.25μlのRNアーゼを含有しない水、12.5μlの2×クアンチテクト・プローブRT−PCRマスター・ミックス(2× QuantiTect Probe RT−PCR Master Mix)、0.25μlのクアンチテクト・プローブRTミックス(QuantiTect Probe RT Mix)、2μlのCSFに特異的なプライマー−プローブの混合物(0.6μMのCSFに特異的なプライマー+0.1μMのCSFに特異的なプローブ)および2μlのICに特異的なプライマー−プローブの混合物(0.2μM EGFPに特異的なプライマー+0.1μMのEGFPl−HEXプローブ)をマスター混合物として貯蔵し、最後に5μlのRNA鋳型を添加した。
リアルタイムRT−PCRを、iサイクラー(iCycler)IQ(商標)リアルタイム・ディテクション・システム(Real−Time Detection System)(バイオ・ラッド(BioRad))において、50℃で30分(逆転写)、95℃で15分(逆転写酵素の不活化/タック(Taq)ポリメラーゼの活性化)、次いで94℃で15秒の42サイクル(変性)、57℃で30秒(アニーリング)および68℃で30秒(伸長)という温度プロフィールに従って行った。リアルタイムRT−PCRの全試験において同一の温度プロフィールを用い、アニーリングステップの間に蛍光値を収集した。
E.実施例5:プラスミドDNAのインビトロ転写
リボプローブ(Riboprobe)(登録商標)システム(System)−SP6/T7(プロメガ(Promega))を製造業者の使用説明書に従って使用し、線形化およびゲル精製されたプラスミドDNAのインビトロ転写を行った。T7で転写された陽性対照およびSP6で転写された内部対照を、供給したDNアーゼで消化し、RNイージー(RNeasy)キット(キアゲン(Qiagen))を使用して精製した。転写されたRNAの正確な長さをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によって確認し、濃度を分光測光によって測定した。式(Xg/μl RNA/[転写産物のヌクレオチド長×340])×6.022×1023=Y分子/μlを用い、正確なRNA分子数を計算した。
リボプローブ(Riboprobe)(登録商標)システム(System)−SP6/T7(プロメガ(Promega))を製造業者の使用説明書に従って使用し、線形化およびゲル精製されたプラスミドDNAのインビトロ転写を行った。T7で転写された陽性対照およびSP6で転写された内部対照を、供給したDNアーゼで消化し、RNイージー(RNeasy)キット(キアゲン(Qiagen))を使用して精製した。転写されたRNAの正確な長さをホルムアルデヒドアガロースゲル電気泳動によって確認し、濃度を分光測光によって測定した。式(Xg/μl RNA/[転写産物のヌクレオチド長×340])×6.022×1023=Y分子/μlを用い、正確なRNA分子数を計算した。
数千回のRT−PCRにとって十分な50μlでのインビトロ転写手順において、通常、1012〜1013個のRNA分子を得た。インビトロで転写されたRNAのストック溶液を−70℃で保存し、希釈使用溶液を−20℃で保存した。
F.実施例6:CSFに特異的なリアルタイムRT−PCRの設計
第1のステップでは、異なるCSFV株の5’NTRの78種の配列を整列し、コンセンサス配列を計算した(図1)。比較されたCSFV株の4種以上において相違した関連するゆらぎヌクレオチド(図1での下線部)のみをプライマーおよびプローブの選択において検討した。相違するヌクレオチドがいずれも単一のCSFV株の5’NTRの一部でない場合、コンセンサス配列内の2つの関連するゆらぎヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドのみを用いた。第2のステップでは、CSFVに特異的なリアルタイムRT−PCRシステムを設計し、「CSF−システム1(CSF−System1)」と名づけた。「CSF−システム1(CSF−System1)」は、プライマー対CSF100−F/CSF192−RとFAMで標識されたプローブのCSF−プローブ1(CSF−Probe1)とからなり(図1、表1)、CSFV(アルフォート(Alfort)187株[登録番号X87939];図1)の5’−NTRにおける100〜192ntの93bpの断片を増幅する。
第1のステップでは、異なるCSFV株の5’NTRの78種の配列を整列し、コンセンサス配列を計算した(図1)。比較されたCSFV株の4種以上において相違した関連するゆらぎヌクレオチド(図1での下線部)のみをプライマーおよびプローブの選択において検討した。相違するヌクレオチドがいずれも単一のCSFV株の5’NTRの一部でない場合、コンセンサス配列内の2つの関連するゆらぎヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドのみを用いた。第2のステップでは、CSFVに特異的なリアルタイムRT−PCRシステムを設計し、「CSF−システム1(CSF−System1)」と名づけた。「CSF−システム1(CSF−System1)」は、プライマー対CSF100−F/CSF192−RとFAMで標識されたプローブのCSF−プローブ1(CSF−Probe1)とからなり(図1、表1)、CSFV(アルフォート(Alfort)187株[登録番号X87939];図1)の5’−NTRにおける100〜192ntの93bpの断片を増幅する。
チェッカーボード(chequerboard)アッセイにて「CSF−システム1(CSF−System1)」の両プライマーおよびプローブを滴定することで最大蛍光値と定義される最適な濃度が同定され、それは最初の閾値サイクルと組み合わされた。「CSF−システム1(CSF−System1)」において、プライマーの0.6μM/反応およびプローブの0.lμM/反応がCSFVゲノムの検出における最適値として同定された。
G.実施例7:陽性および内部対照プラスミドの構築
プライマーCSFl00−FおよびCSF383−R(表1)を使用し、CSFVアルフォート(Alfort)/187(登録番号X87939)の5’−NTRの284bp断片をRT−PCRによって増幅し、精製し、標準のクローニングベクターpGEM−Tイージー(Teasy)(プロメガ(Promega))に挿入した。得られたプラスミドpGEM−PC3alf(図2)を陽性対照(PC)RNAのインビトロ転写において使用した。内部対照(IC)プラスミドを同様に構築した。プライマーEGFPl−FおよびEGFP2−R(表1)を使用し、pEGFP−1標準ベクター(BDバイオサイエンス・クロンテック(BD Bioscience Clontech))の132bp断片をPCRによって増幅し、pGEM−Tイージー(Teasy)クローニングベクターにクローニングした(図2)。得られたICプラスミドをpGEM−EGFP1と名づけた。両方のプラスミドをM13標準プライマーを用いた配列決定によって調節した。pGEM−PCalf内のCSFVの5’−NTR断片をフォワード方向にライゲートし、それによってEGFP断片がpGEM−EGFP1にリバース方向に挿入されたことになる。
プライマーCSFl00−FおよびCSF383−R(表1)を使用し、CSFVアルフォート(Alfort)/187(登録番号X87939)の5’−NTRの284bp断片をRT−PCRによって増幅し、精製し、標準のクローニングベクターpGEM−Tイージー(Teasy)(プロメガ(Promega))に挿入した。得られたプラスミドpGEM−PC3alf(図2)を陽性対照(PC)RNAのインビトロ転写において使用した。内部対照(IC)プラスミドを同様に構築した。プライマーEGFPl−FおよびEGFP2−R(表1)を使用し、pEGFP−1標準ベクター(BDバイオサイエンス・クロンテック(BD Bioscience Clontech))の132bp断片をPCRによって増幅し、pGEM−Tイージー(Teasy)クローニングベクターにクローニングした(図2)。得られたICプラスミドをpGEM−EGFP1と名づけた。両方のプラスミドをM13標準プライマーを用いた配列決定によって調節した。pGEM−PCalf内のCSFVの5’−NTR断片をフォワード方向にライゲートし、それによってEGFP断片がpGEM−EGFP1にリバース方向に挿入されたことになる。
H.実施例8:「CSF−システム1(CSF−System1)」の分析感度
「CSF−システム1(CSF−System1)」の分析感度をインビトロで転写されたPC−RNAの段階希釈によって測定した。インビトロで転写されたPC−RNAの最初の10倍ずつの段階希釈では、「CSF−システム1(CSF−System1)」によりPCが99.8%のPCR効率で101コピー/ウェルから109コピー/ウェルまで線形的に増幅されることが確認された(図3aおよびb)。より詳細な分析では、PC−RNAの2倍ずつの段階希釈を用い、アッセイに特異的な分析感度限界を測定した。最終的に、単一の「CSF−システム1(CSF−System1)」アッセイにおいて約8コピー/ウェルの検出限界が検出された(表2)。
「CSF−システム1(CSF−System1)」の分析感度をインビトロで転写されたPC−RNAの段階希釈によって測定した。インビトロで転写されたPC−RNAの最初の10倍ずつの段階希釈では、「CSF−システム1(CSF−System1)」によりPCが99.8%のPCR効率で101コピー/ウェルから109コピー/ウェルまで線形的に増幅されることが確認された(図3aおよびb)。より詳細な分析では、PC−RNAの2倍ずつの段階希釈を用い、アッセイに特異的な分析感度限界を測定した。最終的に、単一の「CSF−システム1(CSF−System1)」アッセイにおいて約8コピー/ウェルの検出限界が検出された(表2)。
I.実施例9:内部対照の増幅および検出のためのEGFPに特異的なリアルタイムRT−PCRの設計
RNAの単離とRT−PCRの双方に関連する各々の試料または試料プールの内部対照に対し、異種IC−RNAのリアルタイムRT−PCRアッセイを設計した。インビトロで転写されたICを、RNAの単離前またはRT−PCR前に各試料に添加することができ、EGFPに特異的なリアルタイムRT−PCRシステムを用いて増幅し、「IC−システム1(IC−System1)」と名づけた。プライマー対EGFP1−F/EGFP2−Rの132bpのアンプリコンをHEXで標識されたプローブEGFP1−HEX(表1)を使用して検出した。チェッカーボードアッセイでは、プライマーとプローブの双方における濃度を滴定し、「IC−システム1(IC−System1)」の分析感度をインビトロで転写されたIC−RNAの段階希釈を用いて分析した。最終的に、ICアッセイの感度限界として10〜100コピー/ウェルが測定された(データは示さず)。
RNAの単離とRT−PCRの双方に関連する各々の試料または試料プールの内部対照に対し、異種IC−RNAのリアルタイムRT−PCRアッセイを設計した。インビトロで転写されたICを、RNAの単離前またはRT−PCR前に各試料に添加することができ、EGFPに特異的なリアルタイムRT−PCRシステムを用いて増幅し、「IC−システム1(IC−System1)」と名づけた。プライマー対EGFP1−F/EGFP2−Rの132bpのアンプリコンをHEXで標識されたプローブEGFP1−HEX(表1)を使用して検出した。チェッカーボードアッセイでは、プライマーとプローブの双方における濃度を滴定し、「IC−システム1(IC−System1)」の分析感度をインビトロで転写されたIC−RNAの段階希釈を用いて分析した。最終的に、ICアッセイの感度限界として10〜100コピー/ウェルが測定された(データは示さず)。
CSFVに特異的なリアルタイムRT−PCRシステムの最大感度を得るため、「IC−システム1(IC−System1)」のプライマーを限定する必要があった。閾値サイクルの有意な増大を伴うことなくEGFP断片を増幅するプライマーの最小濃度を、多重リアルタイムRT−PCRアッセイの微調整を意図して測定した。最終的に、EGFPフォワードおよびリバースプライマーとして0.2μM/反応ならびにプローブとして0.1μM/反応を、多重アッセイにおけるICの検出のために使用した。
J.実施例10:多重リアルタイムRT−PCRアッセイにおける「CSF−システム1(CSF−System1)」と「IC−システム1(IC−System1)」の併用
最適な単一のCSFに特異的なリアルタイムRT−PCRアッセイにおいてプライマーおよびプローブ濃度を測定しかつICに特異的なプライマーにおける限界濃度を同定した後、最適化されたCSFに特異的な多重リアルタイムRT−PCRプロトコルを確立した。したがって、単一および多重リアルタイムRT−PCRアッセイの分析感度を比較した。第1に、PC−RNAの2倍ずつの段階希釈物のバッチをIC−RNAの共増幅を伴う場合または伴わない場合で増幅した。単一および多重アッセイにおいて、RT−PCRのウェル当たり1000コピーのPC−RNAから開始し、RT−PCR反応当たり8コピーの同一の感度限界を検出できた(表4)。第2に、抽出されたCSFV−RNAの段階希釈物をICの共増幅を伴う場合または伴わない場合で増幅した。これらの実験では、両方の系で類似の結果が得られた。例として、CSFV株「パダーボーン(Paderborn)」(遺伝子型2.1.)のRNAの段階希釈物を増幅した後の蛍光シグナルを図3aに示す。黒線は単一アッセイのFAM−蛍光値を示す一方、四角を伴うグレイ線はICの共増幅を含む多重アッセイのFAM−蛍光値を示す。内部対照(IC)の増幅は、それとは別に図3bに描かれる。ICの共増幅を伴うすべてのRT−PCR反応が検出可能なHEX蛍光シグナルを示したことに言及する必要があり、IC−RNAの量を約30の閾値サイクル(TC)に達するように調節した。多重アッセイにおけるICにおいて観察されたTC範囲は29〜32であり(図3b)、試験ではCSFVゲノムのコピー数が増加していくにつれてICのTCスコアは高まった(図3b)。それにもかかわらず、IC増幅の競合阻害がCSFV−RNAの量の増加という好ましい増幅によって引き起こされることが観察された(図3b)。
最適な単一のCSFに特異的なリアルタイムRT−PCRアッセイにおいてプライマーおよびプローブ濃度を測定しかつICに特異的なプライマーにおける限界濃度を同定した後、最適化されたCSFに特異的な多重リアルタイムRT−PCRプロトコルを確立した。したがって、単一および多重リアルタイムRT−PCRアッセイの分析感度を比較した。第1に、PC−RNAの2倍ずつの段階希釈物のバッチをIC−RNAの共増幅を伴う場合または伴わない場合で増幅した。単一および多重アッセイにおいて、RT−PCRのウェル当たり1000コピーのPC−RNAから開始し、RT−PCR反応当たり8コピーの同一の感度限界を検出できた(表4)。第2に、抽出されたCSFV−RNAの段階希釈物をICの共増幅を伴う場合または伴わない場合で増幅した。これらの実験では、両方の系で類似の結果が得られた。例として、CSFV株「パダーボーン(Paderborn)」(遺伝子型2.1.)のRNAの段階希釈物を増幅した後の蛍光シグナルを図3aに示す。黒線は単一アッセイのFAM−蛍光値を示す一方、四角を伴うグレイ線はICの共増幅を含む多重アッセイのFAM−蛍光値を示す。内部対照(IC)の増幅は、それとは別に図3bに描かれる。ICの共増幅を伴うすべてのRT−PCR反応が検出可能なHEX蛍光シグナルを示したことに言及する必要があり、IC−RNAの量を約30の閾値サイクル(TC)に達するように調節した。多重アッセイにおけるICにおいて観察されたTC範囲は29〜32であり(図3b)、試験ではCSFVゲノムのコピー数が増加していくにつれてICのTCスコアは高まった(図3b)。それにもかかわらず、IC増幅の競合阻害がCSFV−RNAの量の増加という好ましい増幅によって引き起こされることが観察された(図3b)。
K.実施例11:「ゴールドスタンダード」のウイルス単離と比較される多重「CSF−システム1(CSF−System1)」の感度
「CSF−システム1(CSF−System1)」と「ゴールドスタンダード」のウイルス単離との比較試験において、CSFV陽性の細胞培養上清における10倍ずつの段階希釈物を調製した(表2)。ウイルス単離のために各段階希釈物からの一定分量を用い、RNAの単離および多重リアルタイムRT−PCR分析のために第2の一定分量を用いた。試験には異なるCSFV遺伝子型についての数種の株を含め、結果では多重リアルタイムRT−PCRアッセイが高感度であることが明示された。ほとんどの場合、リアルタイムRT−PCRアッセイの感度は、少なくとも同一であるか(CSFV−ウェルゼン(Uelzen)、遺伝子型2.3)またはウイルス単離よりもさらに高かった(CSFV−コズロフ(Kozlov)、遺伝子型1.2;CSFV−パダーボーン(Paderborn)、遺伝子型2.1)(表3)。しかし、細胞培養に適合した株アルフォート(Alfort)187(遺伝子型1.1)の場合、リアルタイムRT−PCRの感度はウイルス単離と比べて約10倍低めであった(表3)。
「CSF−システム1(CSF−System1)」と「ゴールドスタンダード」のウイルス単離との比較試験において、CSFV陽性の細胞培養上清における10倍ずつの段階希釈物を調製した(表2)。ウイルス単離のために各段階希釈物からの一定分量を用い、RNAの単離および多重リアルタイムRT−PCR分析のために第2の一定分量を用いた。試験には異なるCSFV遺伝子型についての数種の株を含め、結果では多重リアルタイムRT−PCRアッセイが高感度であることが明示された。ほとんどの場合、リアルタイムRT−PCRアッセイの感度は、少なくとも同一であるか(CSFV−ウェルゼン(Uelzen)、遺伝子型2.3)またはウイルス単離よりもさらに高かった(CSFV−コズロフ(Kozlov)、遺伝子型1.2;CSFV−パダーボーン(Paderborn)、遺伝子型2.1)(表3)。しかし、細胞培養に適合した株アルフォート(Alfort)187(遺伝子型1.1)の場合、リアルタイムRT−PCRの感度はウイルス単離と比べて約10倍低めであった(表3)。
L.実施例12:CSF−リアルタイムRT−PCRアッセイの特異性
多重アッセイにおけるCSFVとBVDV、BDVまたは非定型ぺスティウイルスとを識別する能力を評価するため、90種の異なるぺスティウイルス株の1群について試験した(表3)。あらゆる既知のCSFV遺伝子型のメンバーである全部で36種の異なるCSFV株を正確に検出し(表3)、さらにすべての場合に急峻に増加する曲線の蛍光シグナルが観察された(データは示さず)。遺伝子型3.4のCSFVであるCSFV株「カナガワ(Kanagawa)」の場合であっても、TC値および蛍光シグナルに顕著な差異は全く観察されなかった(データは示さず)。リアルタイムRT−PCRアッセイの特異性もまた所定の陰性のブタ集団由来の血清試料(n=100)を用いて証明された。RNAを試料から単離し、CSFVに特異的な多重リアルタイムRT−PCRにおいて試験した。すべての試料が陰性と記録され、バックグラウンドの蛍光レベルのみが観察された。
多重アッセイにおけるCSFVとBVDV、BDVまたは非定型ぺスティウイルスとを識別する能力を評価するため、90種の異なるぺスティウイルス株の1群について試験した(表3)。あらゆる既知のCSFV遺伝子型のメンバーである全部で36種の異なるCSFV株を正確に検出し(表3)、さらにすべての場合に急峻に増加する曲線の蛍光シグナルが観察された(データは示さず)。遺伝子型3.4のCSFVであるCSFV株「カナガワ(Kanagawa)」の場合であっても、TC値および蛍光シグナルに顕著な差異は全く観察されなかった(データは示さず)。リアルタイムRT−PCRアッセイの特異性もまた所定の陰性のブタ集団由来の血清試料(n=100)を用いて証明された。RNAを試料から単離し、CSFVに特異的な多重リアルタイムRT−PCRにおいて試験した。すべての試料が陰性と記録され、バックグラウンドの蛍光レベルのみが観察された。
本発明は、本発明の幾つかの態様の例示目的の実施例において開示された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではなく、機能的に等価な任意の実施形態は本発明の範囲内にある。実際には、本明細書中で示されかつ記載された改良だけでなく本発明における様々な改良は、当業者にとって明白であり、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるものである。
本願中で参照されるすべての引用の特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書中に援用される。
7.図面の簡単な説明
78種のCSFV株の5’−NTRのコンセンサス配列およびCSFVに特異的なリアルタイムRT−PCR System1の局在について図示する。ヌクレオチドの単一の文字コードを用いてコンセンサス配列が示された。下線の付いた文字は、特異的ヌクレオチドに対する選択性を有するゆらぎ配列を示した。比較された78種のヌクレオチドのうちの1〜3種のみが相違した。太字で印字されたゆらぎ配列でアラインメントを特徴づけ、それは4種以上のヌクレオチド内で相違した。
インビトロで転写されたPCの10倍ずつの段階希釈に基づくCSF−システム1(CSF−System1)の分析感度。増幅ブロット(A)およびそれに関連する標準曲線グラフ(B)が示された(NTC=対照鋳型なし)。
単一アッセイと比較されるCSF−システム1(CSF−System1)多重アッセイの感度。図3Aでは、両アッセイのFAM蛍光値が示される。図3Bでは、IC−RNAの共増幅が示された。多重アッセイに限り、HEX蛍光値が観察された(黒線=単一アッセイ;四角を伴うグレイ線=多重アッセイ)。
Claims (61)
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、および配列番号9からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号5、および配列番号7のオリゴヌクレオチドのプライマーセット。
- 配列番号3または配列番号6のオリゴヌクレオチドのプローブセット。
- 標識をさらに含む請求項3に記載のプローブ。
- 前記標識が蛍光基、ジゴキシゲニンまたはビオチンである請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドが配列番号8または配列番号9である請求項4に記載のオリゴヌクレオチド。
- 生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法であって、
(i)CSFV核酸を逆転写してCSFV cDNAを得るステップと、
(ii)前記CSFV cDNAを、2種以上の第1のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)前記PCR産物を第1の核酸プローブと、前記プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
(iv)配列番号10の内部対照を、前記内部対照にハイブリダイズ可能な少なくとも2種以上の第2のプライマーと接触させるステップであって、少なくとも1種の第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種の第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(v)少なくとも1種の第2の核酸プローブを、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするように添加するステップと、
(vi)前記ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法。 - 前記第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド75〜150に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項7に記載の方法。
- 前記第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド90〜130に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項8に記載の方法。
- 前記第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項9に記載の方法。
- 前記第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド155〜205に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項7に記載の方法。
- 前記第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド165〜195に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項11に記載の方法。
- 前記第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項12に記載の方法。
- 前記第1のプローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド130〜175に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項7に記載の方法。
- 前記第1のプローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド135〜170に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項14に記載の方法。
- 前記第1のプローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項15に記載の方法。
- 前記第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド625〜675に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項7に記載の方法。
- 前記第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド630〜665に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項17に記載の方法。
- 前記第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項18に記載の方法。
- 前記第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド740〜780に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項7に記載の方法。
- 前記第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド745〜775に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項20に記載の方法。
- 前記第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項21に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド690〜635に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項7に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド695〜730に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項23に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項24に記載の方法。
- 生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法であって、
(i)CSFV核酸を逆転写してCSFV cDNAを得るステップと、
(ii)前記CSFV cDNAを、2種以上の第1のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)前記PCR産物を第1の核酸プローブと、前記プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチドに対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
を含む方法。 - 内部対照をさらに含む請求項26に記載の方法。
- 前記内部対照が配列番号10である請求項27に記載の方法。
- 前記第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド75〜150に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項26に記載の方法。
- 前記第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド90〜130に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項29に記載の方法。
- 前記第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項30に記載の方法。
- 前記第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド155〜205に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項26に記載の方法。
- 前記第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド165〜195に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項32に記載の方法。
- 前記第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項33に記載の方法。
- 前記第1のプローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド130〜175に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項26に記載の方法。
- 前記第1のプローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド135〜170に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項35に記載の方法。
- 前記第1のプローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項36に記載の方法。
- 第2のフォワードプライマーをさらに含む請求項27に記載の方法。
- 前記第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド625〜675に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項38に記載の方法。
- 前記第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド630〜665に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項39に記載の方法。
- 前記第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項40に記載の方法。
- 第2のリバースプライマーをさらに含む請求項27に記載の方法。
- 前記第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド740〜780に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項42に記載の方法。
- 前記第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド745〜775に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項43に記載の方法。
- 前記第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項44に記載の方法。
- 第2のプローブをさらに含む請求項27に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド690〜635に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項46に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド695〜730に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項47に記載の方法。
- 前記第2のプローブが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズする請求項48に記載の方法。
- 生体試料中でCSFV核酸を検出するための方法であって、
(i)前記CSFV核酸を逆転写して相補的CSFV複合体(すなわちCSFV cDNA)を得るステップと、
(ii)前記CSFV cDNAを、2種以上の第1のプライマーおよびDNAポリメラーゼと接触させてPCR産物を生成するステップであって、第1のフォワードプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド100〜120に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ第1のリバースプライマーが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド172〜192に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(iii)前記PCR産物を第1の核酸プローブと、前記プローブが配列番号1またはその相補鎖のヌクレオチド141〜166に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
(iv)配列番号10の内部対照を、少なくとも2種以上の第2のプライマーと接触させるステップであって、少なくとも1種の第2のフォワードプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド637〜656に対応する標的部位にハイブリダイズし、かつ少なくとも1種の第2のリバースプライマーが配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド750〜768に対応する標的部位にハイブリダイズするようにするステップと、
(v)少なくとも1種の第2の核酸プローブを、配列番号10またはその相補鎖のヌクレオチド703〜724に対応する標的部位にハイブリダイズするように接触させるステップと、
(vi)前記ハイブリダイズされたプローブの存在を検出するステップと、
を含む方法。 - 前記第1または第2のプローブがオリゴヌクレオチドプローブである請求項7、26、または50に記載の方法。
- 前記第1または第2のプローブが50個までのヌクレオチドを含む請求項51に記載の方法。
- 前記第1または第2のプローブが約10〜30ヌクレオチド長である請求項52に記載の方法。
- 前記第1または第2のプローブが約15〜25ヌクレオチド長である請求項53に記載の方法。
- 前記検出するステップが蛍光の変化を測定するステップである請求項7、26、または50に記載の方法。
- 前記プローブが蛍光標識される請求項51に記載の方法。
- 前記フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーが50個までのヌクレオチドを含む請求項7、26、または50に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが10〜30ヌクレオチド長である請求項57に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが約15〜25ヌクレオチド長である請求項58に記載の方法。
- 第1の単離された試料中で豚コレラウイルスのウイルス負荷を定量する方法であって、(i)前記第1の試料を、配列番号1またはその相同体あるいはそれらの相補鎖によって規定される標的領域にハイブリダイズするプローブと、ハイブリダイゼーションが第1の検出可能なシグナルをもたらすように接触させ、前記第1のシグナルの強度を測定するステップと、(ii)既知のCSFVウイルス負荷を有する第2の対照試料を前記プローブと接触させて第2の検出可能なシグナルをもたらし、前記第2のシグナルの強度を測定するステップと、(iii)前記第1のシグナルの強度と前記第2のシグナルの強度とを比較することにより、前記第1の単離された試料中で豚コレラウイルスのウイルス負荷を定量するステップと、を含む方法。
- 前記CSFVがリアルタイムにもしくは前記アッセイの終点にて閉じたチューブ型で独立に検出されうる請求項7、26、または50に記載の方法。
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