CN113999939A - 一种用于猪瘟病毒荧光定量rt-pcr检测的引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于猪瘟病毒荧光定量RT‑PCR检测的引物，所述引物为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的引物对。本发明采用上述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT‑PCR检测的引物及试剂盒，操作简便、灵敏、特异、快速的猪瘟病毒定性定量检测方法，对实际生产养殖过程中的猪瘟病毒进行监测，从而限制猪瘟病毒的流行。

Description

一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及猪瘟病毒检测技术领域，尤其是涉及一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒。

背景技术

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）俗称“猪霍乱”、“烂肠瘟”，是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起一种的高度接触性致死性传染病，主要表现为发烧、厌食、腹泻、死亡，母猪流产等。对养猪业危害极大，被世界动物卫生组织（OIE）列入OIE疾病名录（OIE Listed diseases）。近几年猪瘟发病特点上多呈现非典型性，临床症状不明显，温和性及隐性感染的现象，免疫失败现象普遍存在。

在19世纪50年代我国研制出猪瘟兔化弱毒疫苗，应用到猪瘟防控后，CSFV感染得到了有效的控制。但在疫苗接种不完善的地方性受感染的国家中，毒性较低猪瘟病毒株的流行往往被管理和生物安全性问题所掩盖，如饲料喂养、公共设施使用等问题，该病毒可在家养猪中长期保持活性。因此，建立一种快速灵敏、特异性强、操作简单、经济实用的诊断方法势在必行。

CSFV只有一个血清型，但根据病毒核苷酸序列的差异，该病毒可分为三个基因型，即基因1型、基因2型和基因3型，每个基因型又含有3至4个基因亚型。CSFV基因组大小约12.3Kb，由5’端非编码区(5’-UTR)、3’端非编码区（3’-TUR）和一大的开放阅读框架（ORF）三部分构成，该开放读码框（ORF）编码约3898个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶作用下，多聚蛋白在翻译的同时被加工成12种成熟的病毒蛋白，各蛋白的基因排列顺序从N端到C端依次为：Npro、C、E0（Erns）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。CSFV基因组编码的12种病毒蛋白中，C、E0、E1、E2为结构蛋白，其它为非结构蛋白。CSFV5'-UTR由360-373个核苷酸组成，随毒株序列不同而有差异。5’端缺乏甲基化“帽子”结构，序列保守性很高，可形成稳定的二级结构，在基因表达和复制中起重要调控作用。在5’-UTR上含有多个AUG密码子和一个高度结构化的核糖体进入位点（IRES）。IRES5’边界位于核苷酸28～66之间，这些核苷酸形成一个茎环结构（发卡B），该结构可能对于IRES的活性十分重要。CSFV的3’-UTR由226-243个核苷酸组成，也随毒株不同而有差异，3’端缺乏Poly（A）尾结构，在属内保守性很高，可能在病毒复制中起一定作用。

建立特异、灵敏、快速的检测方法，对开展畜群猪瘟病毒监测工作来说是必须的，荧光定量PCR检测方法符合这一要求。目前研究表明，由于猪瘟病毒只有一种血清型，且针对于猪瘟的治疗没有特效药，在防控上主要结合综合性预防措施，以疫苗接种为主。迄今为止国内针对CSFV的常用有效疫苗为猪瘟兔化弱毒疫苗（即C株），该疫苗是在19世纪50年代由我国研制成功的，使用该疫苗预防猪瘟既可以降低成本又可以限制传播，但是近些年免疫失败现象普遍存在。日常监测是掌握畜群健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

目前已建立的用于检测CSFV的方法主要有病毒分离、琼脂扩散、酶联免疫吸附试验、RT-PCR、LAMP等。病毒分离实验方法虽然准确，但是该方法也存在耗时长，操作繁琐，需要较高的试验条件和操作水平，容易污染等缺点，不适合基层临床诊断；酶联免疫吸附方法操作要求高，需要酶标仪测定结果，且不适合做单个样本的检测，虽然耗时比病毒分离试验要短，但仍需要2~4小时不等；LAMP检测虽然耗时较短，但是极易出现假阳性，且对于试剂、技术人员的要求较高。上述的种种不便都限制了它们在猪瘟病毒临床检测中的实际应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒，操作简便、灵敏、特异、快速的猪瘟病毒定性定量检测方法，对实际生产养殖过程中的猪瘟病毒进行监测，从而限制猪瘟病毒的流行。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，所述引物为如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成的引物对。

优选的，引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的延长序列。

一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，包括具有如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示核苷酸序列的单链DNA引物对、探针、核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阴性对照、阳性对照。

优选的，阳性对照是由序列为SEQ ID NO.3所示的DNA片段与载体相连后得到的重组质粒。

优选的，探针为与如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列匹配的单链DNA。

优选的，试剂盒的样本来源于猪源样本和非猪源样本，猪源样本来源于猪血液、扁桃体、淋巴结或脾脏，非猪源样本来源于猪生活的饲料、环境。

优选的，试剂盒在猪瘟病毒检测中的应用。

优选的，试剂盒检测时，PCR程序为第一阶段1个循环，50℃ 15min，第二阶段1个循环95℃ 3min，第三阶段40个循环，95℃ 15s，60℃ 30s后采集荧光信号。

因此，本发明采用上述一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒，在尽量缩短了检测时间的同时，提高了检测的灵敏度，并不增加非特异性干扰，还可降低操作误差，提高测定的精确度。

本发明试剂盒的检测方法具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适用范围广、储存简单、保质期长的优点。本发明的试剂盒可实现猪瘟病毒现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是本发明实施例一中猪瘟病毒基因组目的片段常规RT-PCR扩增；

图2是本发明实施例一中引物和对应的探针对比试验图；

图3是本发明实施例五中实时荧光定量RT-PCR标准曲线；

图4是本发明实施例六中实时荧光定量RT-PCR特异性试验图；

图5是本发明实施例七中实时荧光定量RT-PCR敏感性试验图；

图6是本发明实施例七中常规RT-PCR敏感性试验图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式详述本发明，但需说明的是，本发明的保护范围不受这些具体实施方式和原理性解释的限制，而是由权利要求书来确定。

本发明中，除了明确说明的内容之外，未提到的任何事宜或事项均直接适用本领域已知的那些而无需进行任何改变。而且，本文描述的任何实施方式均可以与本文描述的一种或多种其他实施方式自由结合，由此形成的技术方案或技术思想均视为本发明原始公开或原始记载的一部分，而不应被视为是本文未曾披露或预期过的新内容，除非本领域技术人员认为该结合明显不合理。

本发明所公开的所有特征可以任意组合，这些组合应被理解为本发明所公开或记载的内容，除非本领域技术人员认为该组合明显不合理。

本说明书所公开的数值点，不仅包括实施例中具体公开的数值点，还包括说明书中各数值范围的端点，这些数值点所任意组合的范围都应被视为本发明已公开或记载的范围。

本发明中的技术和科学术语，给出定义的以其定义为准，未给出定义的则按本领域的通常含义理解。

实施例一

RT-PCR扩增猪瘟病毒基因组目的片段

提取商品化猪瘟病毒活疫苗的RNA，其RNA的提取参照TIANamp Virus DNA/RNAKit的操作步骤，将提取的总RNA置于-80℃保存备用。病毒cDNA的合成按照TaKaRa的反转录试剂盒说明书进行。

在30μL的反应体系中，加入3μg提取的总RNA和3μL的TaKaRa的反转录试剂盒中随机引物混合后，置于70℃恒温水浴锅中热浴10 min，接着放在冰上冰浴2 min。冰浴结束后加入5× MLV Buffer 6μL，10 mmol dNTP 1.5μL，MLV反转录酶1.5μL，最后加入无RNA酶水补至30μL。cDNA合成反应程序如下：30℃ 10min，42℃ 1h，70℃ 15 s，4℃ 1min。

将上述反应得到的cDNA为模板，使用本发明的特异性引物进行PCR扩增，扩增反应体系为：金牌Mix（Green）24μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，模板2μL。反应程序如下：98℃ 5min；98℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s；进行40个循环，最后取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，见图1。

根据GenBank上已公布的猪瘟病毒5'UTR (GenBank号为MN654017)、Classicalswine fever virus strain Zaozhuang-1 5'UTR (GenBank号为MK962794)、Classicalswine fever virus isolate IVRI-CSF-BS (全基因GenBank号为MT586134)等序列，截取中间的保守序列而设计，通过从猪瘟病毒的保守序列中筛选设计的方式保证引物序列的特异性，降低检测结果假阳性发生概率。

其中，设计的三套引物及探针序列为：

CSFV-F1：5’-GAGTACAGGACAGTCGTCAG-3’

CSFV-R1：5’-CAGCGCCCTATCAGGTCGTACTC-3’

CSFV-P1：FAM-GAGATGCTATGTGGACGAGGG-MGB

CSFV-F2：5’-AGCCCACCTCGAGATGCTATGT-3’

CSFV-R2：5’-GCCCTATCAGGTCGTACTCC-3’

CSFV-P2：FAM-ACGAGGGCATGCCCAAGACA-MGB

CSFV-F3：5’-ATGGCACATGGAGTTGAATC-3’

CSFV-R3：5’-CGGGTCTCCAAACAATG-3’

CSFV-P3：FAM-AACCAATGGGAGTGGAGGAACCG-MGB

将上述3套引物和对应的探针按照50℃ 15min；95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 30s采集荧光信号，40个循环进行荧光RT-PCR检测，结果如图2。发现，荧光值最高的CSFV-F1、CSFV-R1、CSFV-P1组，即本发明的引物对最佳。

实施例二

阳性质粒的制备

将含有目的基因的产物使用商品化试剂盒纯化后连接转化到pCold I载体上，菌株为大肠杆菌。对阳性菌液进行提取和纯化后，于-20℃保存备用。

实施例三

实时荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件

以上述质粒为模板，进行RT-PCR扩增。反应体系：2×Probe RT-qPCR Buffer 212.5μL，25×Enzyme Mix 1 1μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，探针（10 μmol/L）0.5μL，最后加入无RNA酶水补至25μL。反应程序：50℃ 15min；95℃ 3min；95℃ 15s，60℃ 30s采集荧光信号，40个循环。

实施例四

重组质粒拷贝数计算以及标准品的制备

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值，判断其纯度（OD_260nm/ OD_{280 nm}>1.8者为纯品），按照公式转换为质粒拷贝数：拷贝数=质粒浓度×10^-9×6.02×10²³/（660×质粒总长度）。上述质粒浓度为26.3ng/μL，总长为4545 bp，所得拷贝数为5.27×10⁹copies/μL，-20℃保存备用。

实施例五

实时荧光定量RT-PCR反应标准曲线及方程的建立

将上述已知拷贝数的质粒进行10倍梯度稀释，获得浓度5.27×10⁵copies/μL-5.27×10⁰copies/μL的标准模板，反应程序采用优化好的实验条件进行RT-PCR扩增。扩增结果使用Applied Biosystems QuantStudio 3 QuantStudio TMDesign&AnalysisSoftware v1.5.1软件进行分析，结果各点在一条直线上。以Ct值作为纵坐标，以起始模板浓度的对数作为横坐标，绘制一条标准曲线，得出拷贝数的对数值与Ct值之间的线性关系表达式y=-3.413x+35.058，R²=0.999，扩增效率E=0.963，不同浓度的标准品之间具有良好的线性关系，见图3。

实施例六

用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物特异性分析

采用建立好的实时荧光定量RT-PCR方法，以BVDV（牛病毒性腹泻病毒）、PRRSV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）、PPV（猪细小病毒）、PCV2（猪圆环病毒2型）、ddH₂O为模板进行RT-PCR检测，检测结果均为阴性，而对于CSFV则具有较好的扩增效应，结果表明本发明的引物对只能特异性扩增CSFV，其他样本和阴性对照均无特异性扩增，见图4，表明所建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有良好的特异性。

实施例七

用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物敏感性分析

将标准阳性质粒作10倍倍比稀释，直至无荧光信号出现，该实时荧光定量RT-PCR方法所能检出的最低模板拷贝数为5.27×10⁰ copies/μL，见图5。

将该实时荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法进行比较。常规PCR最佳反应条件为98℃ 5 min；98℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s；进行40个循环。常规RT-PCR所能检出的最低模板拷贝数为5.27×10² copies/μL，结果表明本发明的荧光定量RT-PCR灵敏度比常规RT-PCR（图6）高100倍，检测结果更可靠。

整体程序的反应时长上本发明试剂盒可实现猪瘟病毒现场快速检测，操作更为便捷，样本预处理后，扩增体系配制时只需要加入CSF反应液及CSF酶及相应待检测样本，即可开始检测，无需加入更多组分。

实施例八

用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物重复性分析

选取质粒浓度为5.27×10⁵copies/μL-5.27×10¹copies/μL的标准品分别做3个批内重复和批间重复，采用本发明的实时荧光定量RT-PCR方法的反应条件进行扩增，批内重复变异系数均小于0.5，批间重复变异系数均小于1.5，见表1，结果表明本发明的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。

表1 实时荧光定量RT-PCR批内与批间重复性试验

因此，本发明采用上述一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒，操作简便、灵敏、特异、快速的猪瘟病毒定性定量检测方法，对实际生产养殖过程中的猪瘟病毒进行监测，从而限制猪瘟病毒的流行。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 北京纳百生物科技有限公司

<120> 一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtacagga cagtcgtcag 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcgcccta tcaggtcgta ctc 23

<210> 3

<211> 421

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagccatgc ccwyagtagg actagcaaac ggagggacta gccgtagtgg cgagctccct 60

gggtggtcta agtcctgagt acaggacagt cgtcagtagt tcgacgtgag cagaagccca 120

cctcgagatg ctatgtggac gagggcatgc ccaagacaca ccttaaccct agcgggggtc 180

gctagggtga aatcacacca cgtgatggga gtacgacctg atagggcgct gcagaggccc 240

actattaggc tagtataaaa atctctgctg tacatggcac atggagttga atcattttga 300

acttttatac aaaacaaaca aacaaaaacc aatgggagtg gaggaaccgg tatacgatgc 360

cacggggaga ccattgtttg gagacccgag tgaggtacac ccacaatcaa crytgaagct 420

g 421

Claims (8)

1.一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，所述引物为如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示的核苷酸序列组成的引物对。

2.根据权利要求1所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于：引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的延长序列。

3.一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于：包括具有如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的单链DNA引物对、探针、核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阴性对照、阳性对照。

4.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于：阳性对照是由序列为SEQ ID NO.3所示的DNA片段与载体相连后得到的重组质粒。

5.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于：探针为与如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示核苷酸序列匹配的单链DNA。

6.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于：试剂盒的样本来源于猪源样本和非猪源样本，猪源样本来源于猪血液、扁桃体、淋巴结或脾脏，非猪源样本来源于猪生活的饲料、环境。

7.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于：试剂盒在猪瘟病毒检测中的应用。

8.根据权利要求3所述的一种用于猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测的试剂盒，其特征在于：试剂盒检测时，PCR程序为第一阶段1个循环，50℃ 15min，第二阶段1个循环95℃ 3min，第三阶段40个循环，95℃ 15s，60℃ 30s后采集荧光信号。

Images