CN113862396B - 一种鹅Pegivirus环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 - Google Patents
一种鹅Pegivirus环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于动物传染病病原检测领域，本发明公开了一种鹅Pegivirus环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，该方法根据鹅Pegivirus NS5A基因保守区域设计特异性LAMP引物，包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、环引物LB。根据所设计的引物建立一种检测鹅Pegivirus的环介导等温扩增方法，本检测方法与鹅常见传染病病原不发生交叉反应，且检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高，无需昂贵仪器设备，方便快速，便于基层使用。可用于鹅Pegivirus的快速临床诊断，减少疾病的传播和蔓延，为病毒的基础研究提供了一种有力工具。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种鹅Pegivirus环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。
背景技术
鹅Pegiviruses是黄病毒科中的单链的RNA病毒，病毒的基因组长度约为11.5kb，包含一个长的开放阅读框，编码的蛋白可被病毒蛋白酶和宿主蛋白酶切割成多种蛋白，包括E1、E2、Px、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B；其中，NS5为黄病毒分子量最大、最保守的蛋白，含有甲基转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性，可抑制干扰素和IL-8的表达。Pegivirus以前被称为GB病毒，于1995年首次在狨猴血清样本中发现。在过去的几年中，已经在各种哺乳动物物种中报告了pegiviruses，包括猪、人类、马、黑猩猩、蝙蝠、啮齿动物和猪。2020年，在四川省30～90日龄雏鹅出现严重腹泻和猝死，未发现其他明显症状，对病死鹅只的十二指肠、直肠、肝脏、肾脏、脾脏和大脑进行了取样和分析，未发现已知细菌感染，对已知病毒鹅细小病毒、鹅圆环病毒、鹅星形病毒、鹅冠状病毒、鹅副粘病毒和禽流感病毒检测也也呈阴性。为了确定引起该病的可能病原体，从死鹅的肠和肝匀浆通过尿囊腔注射感染9日龄的胚胎鹅卵，并通过高通量测序分析发现新的病原体——鹅pegivirus。利用分离的鹅pegivirus接种3日龄雏鹅，鹅只出现体重降低，胸腺充血肿胀。研究还发现其与鹅细小病毒混合感染，会出现更严重的症状和更高的死亡率。
环介导等温扩增技术(LAMP)可以在恒温的情况下高特异、高效率、快速的扩增核酸，与传统的RT-PCR方法相比，RT-LAMP不需要先进行反转，然后进行PCR，可以一步完成整个反应，无需热循环；并且LAMP反应中会产生大量的焦磷酸镁副产物沉淀，可以无需电泳就可以通过肉眼或者浊度仪判定结果的阴阳性，还可以添加SYBR green I或者钙黄绿素用肉眼观察颜色变化判定结果。基于等温扩增技术的优势，近年来应用于人类病原微生物、食品病原微生物、动植物病原等各个方面的检测。目前，还未见针对鹅pegivirus LAMP方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测鹅pegivirus的环介导等温扩增反应的引物组及其试剂盒。应用该引物组可为基层现场检测提供一种简便、快捷的检测鹅pegivirus的方法。该方法具有检测快速、操作简便、成本低、灵敏度高、检测结果准确和检测周期短等优点。
本发明所采用的技术方案为：
一种鹅pegivirus的环介导等温扩增方法的检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一条环引物，所述外引物和内引物的核苷酸序列如下：
外引物F3：5'-GAGGACAACCAGTTCCGC-3'，如SEQ ID NO.1所示；
外引物B3：5'-GGGAACTGGTCCCGATGT-3'，如SEQ ID NO.2所示；
内引物FIP：5'-TATCTGCCGCTCCAAGACCGTTACCAGGGCATTGCCGTAT-3'，如SEQ IDNO.3所示；
内引物BIP：5'-CGTCTGGTCACCCCTTGCAAAGAGACCTTCTTCCCATCCA-3'，，如SEQ IDNO.4所示；
环引物LB：5'-TGAGCTGTCATGTGCCAAAAC-3'，如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种含所述引物组的检测试剂盒。
作为本发明可选的实施方案，所述试剂盒包括：荧光目视检测试剂、2×反应缓冲液﹑所述的引物组、Bst DNA聚合酶、ddH2O。
作为本发明可选的实施方案，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
作为本发明可选的实施方案，所述的2×反应缓冲液包括pH8.8 Tris-HC1为40mM、KC1为20mM、MgSO4为16mM、(NH4)2SO4为20mM、Triton X-100为1％、Betaine为1.6M、dNTPsmixture每种均为2.8mM。
作为本发明可选的实施方案，所述LAMP反应体系25μL：2×反应缓冲液12.5μL，40μM FIP和BIP各1μL，10μM F3和B3各0.5μL，10μM LB2μL，Bst DNA聚合酶1μL，待检样品cDNA模板2.5μL，荧光目视检测试剂1μL，其余用ddH2O补足至25μL。
作为本发明可选的实施方案，所述LAMP扩增反应的程序为：62℃反应50min，然后80℃作用10min终止反应。
本发明根据所设计的一套特异引物组成功建立了对鹅pegivirus特异﹑快速、灵敏而且便捷实用的LAMP分子检测方法，具有以下优点和效果：
(1)经济便捷、快速：恒温条件下反应，金属浴或者水浴锅即可，无需昂贵的PCR仪，从样品提取到检测结果出来，可在一个半小时内完成。
(2)特异性强、灵敏度高：本发明建立的LAMP方法检测出鹅pegivirus，所检测的鹅常见病原(如鹅星状病毒﹑鹅细小病毒﹑坦布苏病毒、鹅呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鹅大肠杆菌及沙门氏菌)和水对照样品均无阳性结果出来，和PCR检测结果一致。经实验对比，LAMP比常规PCR灵敏度高两个数量级。
(3)污染小，结果易于分辨：在反应前加入钙黄绿素荧光试剂，随着LAMP反应的进行，钙黄绿素恢复游离态从而发出荧光，并进而与反应液中的镁离子相结合，荧光信号得到增强，依据肉眼即可分辨阴性阳性。反应产物不用开盖检验，可以保证产物污染环境而造成假阳性的出现。
附图说明
图1为鹅pegivirus LAMP凝胶电泳(左)和可视化(右)检测结果。其中1为鹅pegivirus阳性样品；2为阴性对照。
图2为鹅pegivirus LAMP反应温度优化结果。其中泳道1：58℃；泳道2：60℃；泳道3：62℃；泳道4：64℃；泳道5：66℃。
图3为鹅pegivirus LAMP反应时间优化结果。其中泳道1：20min；泳道2：30min；泳道3：40min；泳道4：50min；泳道5：60min；泳道6：70min。
图4为鹅pegivirus LAMP特异性实验，其中泳道1：鹅pegivirus；泳道2：鹅星状病毒；泳道3：鹅细小病毒；泳道4：坦布苏病毒；泳道5：鹅呼肠孤病毒；泳道6：鸭瘟病毒；泳道7：鹅大肠杆菌；泳道8：鹅沙门氏菌；泳道9：阴性对照。
图5为鹅pegivirus LAMP方法敏感性试验。其中泳道M：DNA分子量标准2000；1：1.0×108拷贝/μL；2：1.0×107拷贝/μL；3：1.0×106拷贝/μL；4：1.0×105拷贝/μL；5：1.0×104拷贝/μL；6：1.0×103拷贝/μL；7：1.0×102拷贝/μL；8：1.0×101拷贝/μL；9：1.0×100拷贝/μL；10：阴性对照。
图6为鹅pegivirus LAMP检测试剂盒对临床样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步详细说明，并不对本发明的范围构成限制。
实施例1
1材料和方法
1.1临床样品与毒株
样品采集自江西地区养鹅场严重腹泻和猝死的鹅肝脏、肾脏、脾脏等；鹅pegivirus、鹅星状病毒、鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鹅源大肠杆菌、鹅源沙门氏菌均由江西省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
1.2引物的设计和筛选
根据NCBI报道的鹅pegivirus的保守基因NS5A，利用LAMP引物设计的在线网站PrimerExplorer V5(https：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计3套引物，进行反应温度和各引物比例的优化，最终筛选出最佳的特异性引物，所述引物对的核苷酸序列如下所示：
外引物F3：5'-GAGGACAACCAGTTCCGC-3'，如SEQ ID NO.1所示；
外引物B3：5'-GGGAACTGGTCCCGATGT-3'，如SEQ ID NO.2所示；
内引物FIP：5'-TATCTGCCGCTCCAAGACCGTTACCAGGGCATTGCCGTAT-3'，如SEQ IDNO.3所示；
内引物BIP：5'-CGTCTGGTCACCCCTTGCAAAGAGACCTTCTTCCCATCCA-3'，，如SEQ IDNO.4所示；
环引物LB：5'-TGAGCTGTCATGTGCCAAAAC-3'，如SEQ ID NO.5所示。
1.3 cDNA的制备
1.3.1核酸提取
使用宝日医生物技术(北京)有限公司的TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0提取鹅pegivirus核酸RNA，操作方法依照试剂盒说明书进行。其他病原样品按照相同的方法进行(提取的DNA可直接用于LAMP检测)。
2.2 cDNA模板的制备
应用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit对提取的RNA反转录为cDNA。cDNA反转录配置反应液体系为：2×RT Mix 10μL、HiScript II Enzyme Mix 2μL、Random hexamers(50ng/μl)1μL、RNA模板2μL，其余用ddH2O补足至20μL。cDNA反转录反应条件为：25℃5min，50℃15min，85℃2min。
1.4 LAMP方法的建立和优化
使用扩增效果较好的第一套RT-LAMP的引物作为扩增引物，以该引物最佳的扩增温度62℃为扩增条件，优化各组分的浓度。内外引物浓度以1：2、1：4、1：6、1：8、1：10、1：12为梯度(内引物不变)，Bst DNA聚合酶以0.4μL、0.6μL、0.8μL、1.0μL、1.2μL、1.4μL为梯度，反应时间梯度为10min、20min、30min、40min、50min、60min。2％琼脂糖凝胶电泳观察效果，以确定最佳反应体系和反应时间。
1.5 LAMP检测方法的特异性试验
用优化后的LAMP条件，分别对鹅pegivirus、鹅星状病毒、鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鹅源大肠杆菌、鹅源沙门氏菌的cDNA/DNA进行LAMP扩增，评价建立的LAMP方法的特异性。
1.6 LAMP检测方法的敏感性试验
1.6.1阳性的标准质粒制备
使用实施例1步骤1.2设计的外引物F3和B3对鹅pegivirus阳性样品进行RT-PCR扩增，反应体系为：2×Taq Master Mix(Dye Plus)12.5μL、上游外引物F3 1μL、下游外引物B31μL、cDNA模板2μL、补充ddH2O至终体积25μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃再延伸5min。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，并对扩增特异性目的条带进行胶回收、连接、转化、测序。将测序正确的阳性克隆菌株进行质粒提取，并于-20℃保存备用。
1.6.2敏感性试验
使用最佳的扩增引物、反应体系、反应温度和时间，以阳性的标准质粒为模板，用DropNano2000测定核酸浓度，后双蒸水倍比稀释至1.0×108拷贝/μL、1.0×107拷贝/μL、1.0×106拷贝/μL、1.0×105拷贝/μL、1.0×104拷贝/μL、1.0×103拷贝/μL、1.0×102拷贝/μL、1.0×101拷贝/μL、1.0×100拷贝/μL，用稀释好的质粒做LAMP的灵敏度试验。扩增产物使用2％琼脂糖凝胶电泳观察结果，获得其敏感性试验数据。
1.7稳定性试验
应用建立的一种鹅Pegivirus环温介导等温扩增检测引物及试剂盒保存在-20℃，每月1次用鹅Pegivirus阳性样品及阴阳性对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。
1.8建立的LAMP检测方法的临床应用
应用建立的一种鹅Pegivirus环温介导等温扩增检测引物及试剂盒对江西采集的147份鹅腹泻和猝死的内脏样品进行检测。
2结果
2.1 LAMP反应的可视化
使用扩增效果最佳的鹅Pegivirus LAMP引物组，以最佳的反应体系扩增50min。扩增产物可直接通过肉眼观察，反应液绿色荧光为阳性，橙色为阴性；另外一部分用于普通的琼脂糖凝胶电泳，泳道出现弥散形梯形条带则为阳性，阴性对照无条带(参见图1为鹅pegivirus LAMP凝胶电泳(左)和可视化(右)检测结果。其中1为鹅pegivirus阳性样品；2为阴性对照。)。
2.2 LAMP反应条件优化
将鹅Pegivirus阳性样品提取RNA后反转录为cDNA，使用最佳的引物对以温度梯度为58℃、60℃、62℃、64℃、66℃为梯度进行LAMP反应。结果表明鹅pegivirus LAMP反应的最佳温度为62℃(参见图2为鹅pegivirus LAMP反应温度优化结果。其中泳道1：58℃；泳道2：60℃；泳道3：62℃；泳道4：64℃；泳道5：66℃)。以最佳的反应温度及最佳的反应体系，对反应时间进行优化，结果显示，反应50min以上均能达到最好的扩增效果，故最佳反应时间为50min(参见图3为鹅pegivirus LAMP反应时间优化结果。其中泳道1：20min；泳道2：30min；泳道3：40min；泳道4：50min；泳道5：60min；泳道6：70min)。
2.3敏感性试验
使用最佳的反应条件对稀释好的阳性质粒进行LAMP扩增，扩增结果表明所建立的LAMP试验方法检测限度为10拷贝(参见图4为鹅pegivirus LAMP特异性实验，其中泳道1：鹅pegivirus；泳道2：鹅星状病毒；泳道3：鹅细小病毒；泳道4：坦布苏病毒；泳道5：鹅呼肠孤病毒；泳道6：鸭瘟病毒；泳道7：鹅大肠杆菌；泳道8：鹅沙门氏菌；泳道9：阴性对照)，为普通PCR的100倍。表明LAMP检测技术非常灵敏，可以检测拷贝数非常低的病毒。
2.4特异性试验
使用最佳的反应条件对分别对鹅pegivirus、鹅星状病毒、鹅细小病毒、坦布苏病毒、鹅呼肠孤病毒、鸭瘟病毒、鹅源大肠杆菌、鹅源沙门氏菌的cDNA或DNA进行LAMP扩增，结果只有鹅pegivirus的阳性样品有扩增，其他均为阴性，表明该方法的特异性良好(参见图5为鹅pegivirus LAMP方法敏感性试验。其中泳道M：DNA分子量标准2000；1：1.0×108拷贝/μL；2：1.0×107拷贝/μL；3：1.0×106拷贝/μL；4：1.0×105拷贝/μL；5：1.0×104拷贝/μL；6：1.0×103拷贝/μL；7：1.0×102拷贝/μL；8：1.0×101拷贝/μL；9：1.0×100拷贝/μL；10：阴性对照)。
2.5临床样品检测
应用建立的一种鹅Pegivirus环温介导等温扩增检测引物及试剂盒对江西采集的147份鹅腹泻和猝死的内脏样品进行检测。应用建立的鹅pegivirus LAMP方法对从江西采集的147份鹅腹泻和猝死的内脏样品进行检测，检测结果表明，有26份样品为鹅pegivirus阳性，阳性率为17.7％。图6为鹅pegivirus LAMP检测试剂盒对部分临床样品的检测结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 江西省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种鹅Pegivirus环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gaggacaacc agttccgc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gggaactggt cccgatgt 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
tatctgccgc tccaagaccg ttaccagggc attgccgtat 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
cgtctggtca ccccttgcaa agagaccttc ttcccatcca 40
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tgagctgtca tgtgccaaaa c 21
Claims (3)
1.一种含有鹅Pegivirus环介导等温扩增检测引物组的检测试剂盒，其特征在于，所述引物组包括一组外引物、一组内引物和一条环引物LB，所述外引物、内引物及环引物LB的核苷酸序列如下：
外引物F3：5 '-GAGGACAACCAGTTCCGC-3 '；
外引物B3：5 '-GGGAACTGGTCCCGATGT-3 '；
内引物FIP：5 '-TATCTGCCGCTCCAAGACCGTTACCAGGGCATTGCCGTAT-3 '；
内引物BIP：5 '-CGTCTGGTCACCCCTTGCAAAGAGACCTTCTTCCCATCCA-3 '；
环引物LB：5 '-TGAGCTGTCATGTGCCAAAAC-3 '；
所述试剂盒含有荧光目视检测试剂、2×反应缓冲液﹑Bst DNA聚合酶、ddH2O；
所述荧光目视检测试剂为钙黄绿素荧光试剂，并且所述荧光目视检测试剂在反应前加入；
所述2×反应缓冲液包括pH8 .8 Tris-HC1为40mM、KC1为20mM、MgSO4为16mM、(NH4)2SO4为20mM、Triton X-100为1％、Betaine为1 .6M、dNTPs mixture每种均为2 .8mM。
2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒反应体系25μL：2×反应缓冲液12 .5μL，40μM FIP和BIP各1μL，10μM F3和B3各0 .5μL，10μM LB 2μL，Bst DNA聚合酶1μL，待检样品cDNA模板2 .5μL，荧光目视检测试剂1μL，其余用ddH2O补足至25μL。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒扩增反应的程序为：62℃反应50min，然后80℃作用10min终止反应。
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| Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for the detection of porcine pegivirus;Hao Li et al.;《Journal of Virological Methods》(第200期);摘要 * |
| Emergence of a novel pegivirus species in southwest China showing a high rate of coinfection with parvovirus and circovirus in geese;Wu Zhen et al.;《Poult Sci.》;第100卷(第8期);第2页右栏最后一段，第3页表2 * |
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