CN111763774A - 用于DuHCV和DuMV双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于DuHCV和DuMV双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组，所述引物组和探针组的序列如SEQ.ID.No.1‑SEQ.ID.No.6所示，本发明利用所述引物组和探针组建立的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，能够同时对鸭群中流行的DuHCV和DuMV的进行检测和精确定量，简化操作程序、节约成本、检测快速、高效、特异性强且灵敏度高，DuHCV的最低检测限为72.1拷贝/μL；DuMV的最低检测限为60.8拷贝/μL。

Description

用于DuHCV和DuMV双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探 针组

技术领域

本发明属于兽医学领域，具体涉及一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组。

背景技术

实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速，已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。目前根据实时荧光定量PCR所使用荧光化学物质的不同，实时荧光定量PCR技术主要包括荧光染料和荧光探针两类。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标molecular Beacon。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团，如FAM、VIC、ROX、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA等。实时荧光定量PCR技术在检测病原时不仅可以定性检测病原的有无，而且还可以定量分析病毒含量的多少，在病原核酸检测技术上被广泛使用。多重实时荧光定量PCR是一种特殊的荧光定量PCR形式，其突出的特点是一次实时荧光定量PCR可同时检测多种病原，对病原复杂或存在多种基因型的病原鉴别检测十分有效。

根据国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy ofViruses)的最新分类，黄病毒科(Flaviviridae Family)下设4个病毒属：黄病毒属(Flavivirus)，有53个病毒种，有些是人畜共患病原体，如流行性乙型脑炎病毒、登革热病毒；丙型肝病毒属(hepacivirus)，有14个病毒种；Pegivirus病毒属，有11个种；瘟病毒属(Pestivirus)，有11个种，常见的如猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是属于黄病毒科、丙型肝炎病毒属的单股正链RNA病毒，其病毒粒子呈球形，直径约40-60nm，核衣壳呈二十四面体对称，核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。鸭丙型肝炎病毒(duck hepacivirus，DuHCV)是从患有产蛋异常现象的鸭群中新发现的一种丙型肝炎病毒，其基因组具有一般丙型肝炎的特征，为单股正链RNA，基因组长为11422bp，编码一个长度为10824bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码的多聚蛋白长为3607个氨基酸。

微核糖核酸科(Picornaviridae Family)病毒是重要的人畜共患病原体，它会导致人和动物出现亚临床感染或从轻度发热到心脏、肝脏和中枢神经系统的严重疾病。微核糖核酸科病毒是一类二十面体对称、呈球形，直径约20-30nm、无囊膜的单股正链RNA病毒。微核糖核酸科病毒包含63个病毒属，常见的有口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、肠病毒属(Enterovirus)、心病毒属(Cardiovirus)、肝病毒属(Hepatovirus)等。微核糖核酸科病毒基因长度一般为6.6kb-9.8kb，基因组一般仅含有一个大的开放阅读框(open readingframe，ORF)，3’端为Poly A尾，5’端有VPg蛋白与之共价结合，基因组RNA有感染性。近年来，随着病毒宏基因组学研究的不断深入，归属于微核糖核酸科Megrivirus属的病原先后从火鸡、鸡、鸽子和鸭中发现。基因组学分析发现，鸭新型微核糖核酸病毒(duck megrivirus,DuMV)的基因组结构特征和火鸡源Megrivirus、鸡源Megrivirus相似，且其聚蛋白含有典型微核糖核酸科病毒的特征性基序。遗传进化分析表明，鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)与Megrivirus属的火鸡、鸡、鸽子源新型微核糖核酸病毒处于同一遗传进化分支。

但是，当前尚未见可同时对新发现的鸭丙型肝炎病毒(DuHCV)和鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)进行双重TaqMan实时荧光定量PCR检测的引物的研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够对鸭群中流行的DuHCV和DuMV的进行检测和精确定量，为鸭群中开展新发DuHCV和DuMV分子流行病学调查及后续科学防控相关疾病奠定基础，具有十分重要的研究意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组及其试剂盒，建立能够同时检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的检测方法，简化操作程序、节约成本。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组，所述引物组包括：

用于检测鸭丙型肝炎病毒的引物：

DuHCV-qT-F：5’-CAGCTGATGCTGGTATGGCG-3’，

DuHCV-qT-R：5’-CGTCCCCAGAAACGTTGACC-3’；

用于检测鸭新型微核糖核酸病毒的引物：

DuMV-qT-F：5’-ACTGGAACCTGGCTTTTGG-3’，

DuMV-qT-R：5’-TCGGGTAGTTTTCTTGGGTTC-3’；

所述探针组包括：

用于检测鸭丙型肝炎病毒的探针：

DuHCV-qT-probe：5’-ACCGGTCGCGCACCAACTGTACACA-3’；

用于检测鸭新型微核糖核酸病毒的探针：

DuMV-qT-probe：5’-AGGCTGAAATCTCTGGAAACGGGAC-3’；

其中，DuHCV-qT-probe的5’-端标记荧光报告基团CY5，3’-端标记BHQ2；DuMV-qT-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记Eclipse。

本发明双重实时荧光定量PCR反应体系为：在20μL体系中含有以下成分：

试剂	使用量/μL
		TaqMan qPCRMix	10
DuHCV-qT-F(10μmol·L<sup>-1</sup>)	0.2
		DuHCV-qT-R(10μmol·L<sup>-1</sup>)	0.2
DuHCV-qT-probe(5μmol·L<sup>-1</sup>)	0.6
		DuMV-qT-F(10μmol·L<sup>-1</sup>)	0.3
DuMV-qT-R(10μmol·L<sup>-1</sup>)	0.3
		DuMV-qT-probe(5μmol·L<sup>-1</sup>)	0.6
cDNA模板	1
		灭菌去离子水	6.8

；

双重实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

实时荧光定量PCR反应结束后，分析试验结果，当仅CY5通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭丙型肝炎病毒(DuHCV)阳性；当仅FAM通道出现阳性扩增信号，结果判定为鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)阳性；当CY5通道和FAM通道均出现阳性扩增信号，结果判定为鸭丙型肝炎病毒(DuHCV)和鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)混合感染。

用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的试剂盒，包括所述的引物组和探针组。

本发明提供用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组及试剂盒，并建立能够同时检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的检测方法，具有以下优点和效果：

1.同时检测、检测快速、高效：本发明利用所述引物组和探针组建立的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法能够同时对鸭群中的DuHCV和DuMV进行检测、鉴别诊断和精确定量，简化操作程序、节约成本，同时该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

2.定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，可根据检测待检样品中DuHCV和DuMV的Ct值，可直接对其感染DuHCV和DuMV进行准确定量。

4.灵敏度高：DuHCV的最低检测限为72.1拷贝/μL；DuMV的最低检测限为60.8拷贝/μL。

5.特异性强：对其他水禽常见病原(如DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV)均未见阳性扩增荧光信号，仅对DuHCV(CY5通道)和DuMV(FAM通道)检测出现扩增信号。

6.重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行DuHCV检测的组内变异系数为0.52-1.05％，组间变异系数0.60-1.92％，进行DuMV检测的组内变异系数为0.66-1.44％，组间变异系数0.74-2.07％，表明本发明建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法重复性好。

附图说明

图1是双重实时荧光定量PCR方法检测DuHCV的标准曲线。

图2是双重实时荧光定量PCR方法检测DuMV的标准曲线。

图3是双重实时荧光定量PCR方法检测DuHCV的敏感性试验结果图；其中1:质粒浓度为7.21×10³拷贝/μL；2:质粒浓度为7.21×10²拷贝/μL；3:质粒浓度为7.21×10¹拷贝/μL；4:质粒浓度为7.21×10⁰拷贝/μL。

图4是双重实时荧光定量PCR方法检测DuMV的敏感性试验结果图。其中，1：质粒浓度为6.08×10²拷贝/μL；2：质粒浓度为6.08×10¹拷贝/μL；3：质粒浓度为6.08×10⁰拷贝/μL；

图5是双重实时荧光定量PCR方法的特异性检测结果图；其中，1：DuHCV；2：DuMV；C：试验对照(DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV)，肉眼无法有效区分。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例1：

1.材料与方法

1.1 毒株和菌株

试验用病原鸭丙型肝炎病毒(DuHCV，H36a8株)、鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV，M19g24株)、鸭1型肝炎病毒(DHAV-1)、鸭3型肝炎病毒(DHAV-3)、鸭源禽流感病毒(AIV)、鸭源禽1型副粘病毒(APMV-1)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和新型鸭呼肠孤病毒(N-DRV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

1.2 引物设计

根据鸭丙型肝炎病毒(DuHCV)和鸭新型微核糖核酸病毒(DuMV)核苷酸序列及其和同属其他病原的核苷酸序列的分析比对结果，利用引物设计软件设计特异性的引物和探针。

针对DuHCV的引物序列为：

DuHCV-qT-F：5’-CAGCTGATGCTGGTATGGCG-3’

DuHCV-qT-R：5’-CGTCCCCAGAAACGTTGACC-3’

针对DuHCV的探针序列为：

DuHCV-qT-probe：5’-ACCGGTCGCGCACCAACTGTACACA-3’；

针对DuMV的引物序列为：

DuMV-qT-F：5’-ACTGGAACCTGGCTTTTGG-3’

DuMV-qT-R：5’-TCGGGTAGTTTTCTTGGGTTC-3’

针对DuMV的探针序列为：

DuMV-qT-probe：5’-AGGCTGAAATCTCTGGAAACGGGAC-3’；

其中DuHCV-qT-probe的5’-端标记荧光报告基团CY5，3’-端标记BHQ2；

DuMV-qT-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记Eclipse。

所有的引物和探针经primer-BLAST分析均符合实验预期，所述引物和探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 核酸的提取及cDNA的制备

按照病毒核酸提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)提取DuHCV、DuMV、DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV的核酸RNA。利用反转录试剂盒(

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)将提取的RNA反转录为cDNA备用。

1.4 阳性标准品的构建

1.4.1 DuHCV阳性标准品的构建

利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物DuHCV-F5：5＇-TGAGGTCTGTGCTACTTTTGCT-3＇，DuHCV-R5：5＇-TTGACCCACACAACAGCAGAGT-3＇，预期扩增片段大小为576bp。上述引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液25μL、上/下游引物(DuHCV-F5/DuHCV-R5)(引物浓度为10μmol·L^-1)各2μL、DuHCV核酸cDNA模板1μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性50s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。

PCR扩增反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(DuHCV-F5/DuHCV-R5)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经BLAST分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuHCV)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为7.21×10⁸拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度为7.21×10⁷拷贝/μL至7.21×10⁰拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。

1.4.2 DuMV阳性标准品的构建

利用Oligo 7引物设计软件设计引物，上游引物DuMV-F6：5＇-ACGGATCAACACTCAGCAGGTA-3＇，DuMV-R6：5＇-TGCAGCAGAAATTTGAGGAGCCAT-3＇，预期扩增片段大小为813bp。上述引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

使用PCR扩增试剂(2×PCR Master试剂)推荐的50μL体系进行扩增，其中2×PCRMaster Mix反应液25μL、上/下游引物(DuMV-F6/DuMV-R6)(引物浓度为10μmol·L^-1)各2μL、DuHCV核酸cDNA模板1μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94℃预变性5min后进入循环，94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸60s，35个循环结束后，72℃终延伸10min。

PCR扩增反应结束后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(DuMV-F6/DuMV-R6)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经BLAST分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品(P-DuMV)。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为6.08×10⁸拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度为6.08×10⁷拷贝/μL至6.08×10⁰拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。

1.5 双重TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化

按照TaqMan说明书配制20μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同引物终浓度、对不同反应条件进行优化，确定建立的实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件。

优化后的TaqMan实时荧光定量PCR最佳反应体系(20μL)如下：TaqMan qPCRMix 10μL、DuHCV-qT-F(引物浓度为10μmol·L^-1)0.2μL、DuHCV-qT-R(引物浓度为10μmol·L^-1)0.2μL、DuHCV-qT-probe(探针浓度为5μmol·L^-1)0.6μL、DuMV-qT-F(引物浓度为10μmol·L^-1)0.3μL、DuMV-qT-R(引物浓度为10μmol·L^-1)0.3μL、DuMV-qT-probe(探针浓度为5μmol·L^-1)0.6μL、DuHCV和DuMV核酸cDNA模板各0.5μL(进行临床检测时加入的cDNA模板为1.0μL)，补充灭菌去离子水至终体积20μL。优化出的实时荧光定量PCR方法最佳反应条件为：95℃预变性2min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

1.6 标准曲线的建立

1.6.1 DuHCV标准曲线的建立

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同浓度(7.21×10⁵～7.21×10¹拷贝/μL)的阳性标准品(P-DuHCV)为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得对应的扩增动力学曲线，从不同浓度标准品扩增动力学曲线可知，建立的实时荧光定量PCR方法在7.21×10⁵～7.21×10¹拷贝/μL(P-DuHCV质粒)反应范围内有很好的线性关系。其中，针对DuHCV相关系数为0.998。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以出现的循环数阈值(Ct值)结果为纵坐标，获得检测DuHCV实时荧光定量PCR方法的标准曲线(见图1)的线性方程Y＝-3.401X+38.89。

1.6.2 DuMV标准曲线的建立

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同浓度(6.08×10⁵～6.08×10¹拷贝/μL)的阳性标准品(P-DuMV)为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得扩增动力学曲线，从不同浓度标准品扩增动力学曲线可见，建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法在6.08×10⁵～6.08×10¹拷贝/μL范围内有很好的线性关系。其中，针对DuMV相关系数为0.997。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以出现的循环数阈值(Ct值)结果为纵坐标，获得基于检测DuMV实时荧光定量PCR方法的标准曲线(见图2)的的线性方程Y＝-3.269X+37.75。

1.7 敏感性试验

1.7.1 DuHCV敏感性实验

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同浓度(7.21×10³～7.21×10⁰拷贝/μL)的阳性重组质粒P-DuHCV(即标准品P-DuHCV)为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，确定建立的实时荧光定量PCR方法的最低检测限。

用优化后的TaqMan实时荧光定量PCR方法对不同浓度质粒进行检测，结果显示(见图3)其最低检测限为7.21×10¹拷贝/μL(即72.1拷贝/μL)。

1.7.2 DuMV敏感性实验

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同浓度(6.08×10²～6.08×10⁰拷贝/μL)的阳性重组质粒P-DuMV(即标准品P-DuMV)为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，确定建立的实时荧光定量PCR方法的最低检测限。

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法对不同浓度质粒进行检测，结果显示(见图4)其最低检测限为6.08×10¹拷贝/μL(即60.8拷贝/μL)。

1.8 特异性试验

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以DuHCV和DuMV为阳性对照，对鸭群常见病原，如DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV提取的核酸RNA反转录为cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，评价建立的实时荧光定量PCR方法的特异性。

从扩增曲线(见图5)可见，建立的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法在CY5通道仅见有DuHCV扩增信号；在FAM通道仅见有DuMV扩增信号；若样品为DuHCV和DuMV混合感染，则CY5通道和FAM通道均见有扩增信号。对其他水禽常见病原(如DHAV-1、DHAV-3、AIV、APMV-1、MDRV和N-DRV)均未见阳性扩增荧光信号，表明建立的实时荧光定量PCR方法特异性强。

1.9 变异系数测定

1.9.1 DuHCV变异系数

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同浓度(7.21×10⁵拷贝/μL、7.21×10⁴拷贝/μL、7.21×10³拷贝/μL)的阳性标准品(P-DuHCV)为模板进行检测。每种标准品含量重复3次，计算组内(intra-group)变异系数。分别将上述标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d取出，用优化后的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。

将不同稀释度的标准品分别进行组内和组间的重复性试验，结果显示(见表1)组内变异系数为0.52-1.05％，组间变异系数0.60-1.92％，表明本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法重复性好。

表1-1实时荧光定量PCR的组内和组间变异系数

1.9.2 DuMV变异系数

用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同浓度(6.08×10⁵拷贝/μL、6.08×10⁴拷贝/μL、6.08×10³拷贝/μL)的阳性标准品(P-DuMV)为模板进行检测。每种标准品含量重复3次，计算组内(intra-group)变异系数。分别将上述标准品分装后置于-20℃保存，每隔7d取出，用优化后的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。

将不同稀释度的标准品分别进行组内和组间的重复性试验，结果显示(见表2)组内变异系数为0.66-1.44％，组间变异系数0.74-2.07％，表明本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法重复性好。

表1-1实时荧光定量PCR的组内和组间变异系数

2.临床样品检测

根据对158份临床送检鸭源病料按照常规方法处理后，利用病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取相应的核酸RNA后反转录为cDNA，利用优化后的双重TaqMan实时荧光定量PCR方法进行DuHCV和DuMV感染的检测。结果可见，检测到18份DuHCV感染阳性(CY5通道)，阳性率为11.39％；检测到24份DuMV感染阳性(FAM通道)，阳性率为15.19％；检测到5份DuHCV和DuMV共感染阳性(CY5通道和FAM通道)，阳性率为3.16％，表明建立的方法可用于DuHCV和DuMV的分子流行病学鉴别诊断和后续致病机制相关研究。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 用于DuHCV和DuMV双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

cagctgatgc tggtatggcg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cgtccccaga aacgttgacc 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

accggtcgcg caccaactgt acaca 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

actggaacct ggcttttgg 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tcgggtagtt ttcttgggtt c 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aggctgaaat ctctggaaac gggac 25

Claims (3)

1.一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的引物组和探针组，其特征在于：所述引物组包括：

用于检测鸭丙型肝炎病毒的引物：

DuHCV-qT-F：5’-CAGCTGATGCTGGTATGGCG-3’，

DuHCV-qT-R：5’-CGTCCCCAGAAACGTTGACC-3’；

用于检测鸭新型微核糖核酸病毒的引物：

DuMV-qT-F：5’-ACTGGAACCTGGCTTTTGG-3’，

DuMV-qT-R：5’-TCGGGTAGTTTTCTTGGGTTC-3’；

所述探针组包括：

用于检测鸭丙型肝炎病毒的探针：

DuHCV-qT-probe：5’-ACCGGTCGCGCACCAACTGTACACA-3’；

用于检测鸭新型微核糖核酸病毒的探针：

DuMV-qT-probe：5’-AGGCTGAAATCTCTGGAAACGGGAC-3’；

其中，DuHCV-qT-probe的5’-端标记荧光报告基团CY5，3’-端标记BHQ2；

DuMV-qT-probe的5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记Eclipse。

2.利用权利要求1所述的引物组和探针组检测鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒的双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：PCR反应体系为：在20μL体系中含有以下成分：

试剂 使用量/μL TaqMan qPCRMix 10 DuHCV-qT-F(10μmol·L^-1) 0.2 DuHCV-qT-R(10μmol·L^-1) 0.2 DuHCV-qT-probe(5μmol·L^-1) 0.6 DuMV-qT-F(10μmol·L^-1) 0.3 DuMV-qT-R(10μmol·L^-1) 0.3 DuMV-qT-probe(5μmol·L^-1) 0.6 cDNA模板 1 灭菌去离子水 6.8

；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

3.一种用于鸭丙型肝炎病毒和鸭新型微核糖核酸病毒双重实时荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和探针组。

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