CN111518961A - 一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及基因分型方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及基因分型方法。该引物为猫冠状病毒S基因引物，应用该引物可以建立猫冠状病毒纤突蛋白基因S上一个SNP位点(g.23531A＞Y)的高分辨率溶解曲线(HRM)鉴别方法。应用该引物建立的检测方法可快速地从宠物临床样本中检测并鉴定猫冠状病毒基因组第23531位点的基因型，进而推断相应毒株全身性感染力表型，可作为猫冠状病毒致病力筛查的依据，亦可作为猫传染性腹膜炎临床诊断的重要参考。

Description

一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及基因分型方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及检测与分型方法。
背景技术
猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)属于冠状病病毒科，冠状病毒属成员。根据感染猫只的临床症状差异，人们习惯于将FcoV分为猫肠道冠状病毒(Feline entericcoronavirus，FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus，FIPV)。其中由FECV引起的猫肠道感染可能出现脱水，但临床症状轻微，致死率较低。猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis，FIP)则是一种免疫介导的慢性、渐进性传染病，以腹膜炎、化脓性肉芽肿性血管炎、大量腹水积聚及高致死率为主要特征。该病主要感染两岁以下幼猫，尤其纯种猫更易感。发病猫可表现为干性(非渗出性)和湿性(渗出性)腹膜炎。本病是威胁猫类健康的最为重要的一种传染性疾病。
FIP病变的确切过程不清楚，目前主要有两个假说。(1)内源性变异假说：病毒在巨噬细胞内发生复制。猫感染没有毒力的猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)，病毒在肠道细胞内复制，某些基因片段出现突变，形成不同的表型，使它有能力在细胞内复制。(2)抗体依赖性感染增强假说：任何的猫冠状病毒都可以引发FIP，是否出现FIP与猫的免疫应答机制决定，病毒感染后可产生免疫复合物疾病、抗病毒抗体在体内不能有效地清除病毒，反而通过Fc受体介导的抗体依赖性感染增强作用(ADE)使感染增强，造成免疫系统功能紊乱。两个假说的关键病理核心过程都是病毒在巨噬细胞内复制。如果早期没有将感染的巨噬细胞清除掉，身体将出现致命的III型变态反应，即为传染性腹膜炎。
基于以上原因，FIP临床上的生前诊断(ante-mortem diagnosis)一直是本病诊断的难点，原因在于目前FIP致病性病原FIPV与FCoV难以区分。在猫群中，FCoV的抗体阳性率可达到36-75％，而FIP只占FCoV感染猫的5-10％，也就是说在这些病毒感染阳性者中只有约5％的最后会发生猫传染性腹膜炎。因此，单纯的FCoV抗体阳性及核酸的检出对于FIP的诊断无实际的参考意义。传统的诊断多以综合性诊断为主，在没有渗出性病变的案例中，诊断FIP尤为困难。当有积液存在时，首先需要检测积液，进行排查，这种方法要比检测血液的指标更具有参考性。在没有渗出性案例中，多个流行病学因素需要排查，包括病史、猫的来源、临床症状、实验室数据改变、抗体滴度都应该考虑在内，根据这些信息来决定是否需要做侵入性的进一步确诊。
FIP具有发生率高、诊断困难、难于预防以及很短时间内几乎不可逆死亡等特点，目前还没有有效的长期治疗的方案，建立并推广一种快速准确的诊断方案至关重要。但受诸多因素影响，目前现有的FIP的诊断方法结果可靠性和实际操作性差，因此市场迫切需要一种快速、简便、准确的FIP诊断新产品或新技术。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种猫冠状病毒基因检测与分型引物及HRM扩增方法。采用本发明的引物可以快速地从猫粪便、血浆、血清、腹水等样本提取的RNA中的检测猫冠状病毒核酸，具有简便、快速、准确、特异、敏感等优点，可作为猫冠状病毒全身性感染能力和毒力表型的基因分型方法，也可作为猫冠状病毒感染和排毒的检测方法，尤其适合作为猫传染性腹膜炎的临床排查和诊断的参考依据。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种用于猫冠状病毒扩增的寡核苷酸引物，引物能够特异性识别猫冠状病毒S基因，应用该引物可鉴定病毒23531位单核苷酸多态性位点的基因型。
采取上述方案的有益效果为：猫冠状病毒的S基因上第23531位的突变对于FIP的发病具有关键性作用，该位点突变表型的病毒占FIP发病病例的95％以上。其中该位点的A突变为T或C可导致S蛋白的第1058位的甲硫氨酸突变(M)为亮氨酸(L)，因此S23531A＞T/C检测是检测M1058L的关键位点。S蛋白该位点突变对于该病毒的全身系统性感染至关重要，因此，S23531A＞T/C特异性突变型病毒的检测是FIP诊断和毒力分型的关键分子靶标。本发明提供的引物是可识别猫冠状病毒S基因引物，应用该引物可以建立猫冠状病毒纤突蛋白基因S上单核苷酸多态性(SNP)位点(g.23531A＞Y)的高分辨率溶解曲线(HRM)鉴别方法，可快速、高效的鉴定病毒23531位单核苷酸多态性(SNP)位点的基因型。应用该引物建立的检测方法可快速地从宠物临床样本中检测并鉴定猫冠状病毒基因组第23531位点的基因型，进而推断相应毒株全身性感染力表型，可作为猫冠状病毒致病力筛查的依据，亦可作为猫传染性腹膜炎临床诊断的重要参考。
进一步，上述引物包括上游引物(Fwd primer)、下游引物(Rev primer)和探针引物(probe)中的一种或几种的组合。
采取上述方案的有益效果为：本发明提供的引物是可以用于猫冠状病毒核酸检测的寡核苷酸引物，基于荧光定量PCR的HRM方法检测猫冠状病毒特异性S基因位点，亦可对S23531A＞Y突变位点进行分型鉴定。具有特异性强、灵敏度高、简便、准确、快速等优点，还兼具无后续操作和分析、可实现闭管操作，防止交叉污染等优点。
以猫冠状病毒毒株C1Je基因组为参考基因组，上游引物(Fwd primer)的序列包括与参考基因组第23421-23444位区域序列一致的序列；下游引物(Rev primer)的序列包括与参考基因组第23533-23555位区域反向互补的序列；探针引物(probe)的序列包括与参考基因组第23449-23472区域序列一致的序列；探针引物的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素(FAM)和BHQplus基团。
具体的，以猫冠状病毒毒株C1Je基因组为参考基因组，上游引物(Fwd primer)的序列与参考基因组第23421-23444位区域序列一致的序列；下游引物(Rev primer)的序列与参考基因组第23533-23555位区域反向互补的序列；探针引物(probe)的序列与参考基因组第23449-23472区域序列一致的序列；探针引物的5′-末端和3′-末端还分别标记有5-羧基荧光素(FAM)和BHQplus基团。
采取上述方案的有益效果为：上游引物包括与参考基因组第23421-23444位区域序列一致的序列，采用这样的引物设计有利于：(1)避免引物与下游引物或自身形成稳定高级结构，能与模板更好结合；(2)确保扩增产物大小合适；(3)确保扩增产物包含基因分型靶位点，可以避免扩增特异性差、效率低等问题；下游引物包括与参考基因组第23533-23555位区域反向互补的序列，采用这样的引物设计有利于：(1)避免引物与下游引物或自身形成稳定高级结构，能与模板更好结合；(2)确保扩增产物大小合适；(3)确保扩增产物包含基因分型靶位点，可以避免非特异性扩展和敏感性差等问题；探针引物包括与参考基因组第23449-23472区域序列一致的序列，采用这样的引物设计有利于增加反应特异性，可以避免非特异性扩增问题；探针引物的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素(FAM)和BHQplus基团利用双重稳定技术、允许设计较短的寡核苷酸探针的特点，有利于检测复杂靶序列，增强反应特异性，适合SNP基因分型。
进一步，上游引物(Fwd primer)的序列包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；下游引物(Rev primer)的序列包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；探针引物(probe)的序列包括SEQ ID NO：3核苷酸序列，探针引物(probe)的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素和BHQplus基团。
具体的，上游引物(Fwd primer)的序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；下游引物(Rev primer)的序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；探针引物(probe)的序列为SEQ IDNO：3核苷酸序列，探针引物(probe)的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素和BHQplus基团。
采取上述方案的有益效果为：采用该引物扩增的目标片段包含了S基因的第23531位，该位点的碱基差异可通过高分辨率溶解曲线进行基因分型。
probe的核苷酸序列包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。probe探针序列5′-末端和3′-末端分别标记5-羧基荧光素(FAM)和BHQplus基团。采取上述方案的有益效果为：本发明选用上述序列的引物可增强扩增反应特异性，最大限度避免假阴性和假阳性结果。
本发明还提供一种用于检测猫冠状病毒的核苷酸片段、载体和/或菌株，所述核苷酸片段包括猫冠状病毒S基因第23531位点的序列，核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；所述载体包括该核苷酸片段；所述菌株包括该核苷酸片段。
本发明还提供猫冠状病毒S基因的RNA阳性对照物，所述RNA阳性对照物包括上述核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段的。具体的，核糖核酸片段的序列可以包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和/或SEQ ID NO：9所示的序列。
上述的核苷酸片段、载体、菌株和/或RNA阳性对照物可以在建立猫冠状病毒检测方法中进行应用。进一步，在制备检测猫冠状病毒的检测和/或分型的试剂盒中进行应用。
例如，在本发明实施例中，本发明提供了3种用于检测猫冠状病毒的S基因第23531位点的片段，该基因片段包括猫冠状病毒参考毒株C1Je纤突蛋白编码基因S序列，(GenBank登录号：DQ848678，基因组中第23400位至第23705位序列)。并在基因5′-末端和3′-末端分别引入限制性酶切位点。将该基因片段通过质粒构建的方式可以获得重组质粒pGEM-23531T、pGEM-23531C和pGEM-23531A。将重组质粒通过转化等方式可以获得含有该质粒的菌株。将重组质粒经线性化、纯化、转录等操作后，可以作为用于检测冠状病毒的试剂盒的阳性对照或敏感性试验的RNA模板。
采取上述方案的有益效果为：本发明所述的重组S基因质粒载体以及体外转录的RNA分子具有易于获得、便于定量等优点，可用于基于核酸检测方法的科学研究与临床应用的阳性对照标准品。
本发明还提供上述引物在制备猫冠状病毒的检测和/或基因分型中的应用。优选地，用于制备检测猫冠状病毒的基因分型方法。
本发明还提供一种基于猫冠状病毒g.23531A＞Y SNP位点的RNA阳性对照物，所述RNA阳性对照物包括RNA阳性对照物1、RNA阳性对照物2、RNA阳性对照物3中的一种或几种的组合；RNA阳性对照物1的序列包括SEQ ID NO：7所示的序列；RNA阳性对照物2的序列包括SEQ ID NO：8所示的序列；RNA阳性对照物3的序列包括SEQ ID NO：9所示的序列。
进一步，RNA阳性对照物1为23531T的核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段，23531T的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：4所示的序列；RNA阳性对照物2为23531C的核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段，23531C的核苷酸片段的序列包括SEQ IDNO：5所示的序列；RNA阳性对照物3为23531A的核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段，23531A的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：6所示的序列。
为满足需要，23531A、23531T、23531C的核苷酸片段分别在5′端设计有Kpn I酶切位点，序列为GGTACC，3′端设计有BamH I酶切位点，序列为GGATCC。
本发明还提供上述RNA阳性对照物在制备猫冠状病毒检测和/或基因分型试剂盒中的应用。
本发明还提供一种猫冠状病毒检测和/或基因分型的试剂盒的制备方法，可以包括以下步骤：合成上述引物。
本发明提供一种猫冠状病毒检测和/或基因分型试剂盒，包括上述引物。优选的，还可以包括上述RNA阳性对照物；进一步的，还可以包括扩增反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、反转录酶、阴性对照标准品、待检测样品中的一种或几种。
本发明还提供一种猫冠状病毒检测和/或基因分型方法，包括以下步骤：利用上述引物采用扩增方法建立溶解曲线来明确23531位核苷酸对应的基因型。
进一步，检测猫冠状病毒的检测与基因分型方法中，进行扩增的反应体系中除引物外还可以包括扩增反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、反转录酶、对照标准品、待检RNA样本中的一种或几种。
所述待检RNA样本可以包括从猫粪便、血浆、血清和/或腹水等样本提取的RNA。
采取上述方案的有益效果为：采用本发明的引物可以快速地猫粪便、血浆、血清、腹水等样本提取的RNA中的检测猫冠状病毒S基因第23531位的核苷酸，具有简便、快速，无需后续测序分析等优点，可作为猫冠状病毒感染的临床检测方法，亦可作为病毒毒力分型的重要参考。
所述对照标准品包括阳性对照品和/或阴性对照标准品。
阳性对照标准品可以通过以下方法制备：合成用于检测猫冠状病毒的S基因片段，该基因片段包括该基因片段包括猫冠状病毒参考毒株C1Je纤突蛋白编码基因S序列，(GenBank登录号：DQ848678，基因组中第23400位至第23705位序列)，在23531处设置有不同基因型。将该基因片段通过质粒构建的方式可以获得重组质粒pGEM-23531T、pGEM-23531C和pGEM-23531A。将重组质粒经线性化、纯化、转录得到RNA，即为阳性对照标准品。
具体的，猫冠状病毒检测和/或基因分型方法，可以包括以下步骤：
(1)制备阳性对照标准品；
(2)制备阴性对照标准品；
(3)制备引物混合液；
(4)建立实时定量PCR扩增反应体系，进行扩增；
(5)检测结果判断。
采取上述方案的有益效果为：具有快速、简便、特异、敏感等优点。
具体的，在步骤(5)进行扩增结果分析的时候，通过分析扩增曲线进行分析，可快速鉴别猫冠状病毒该位点的基因型。
附图说明
图1为特异性引物在猫冠状病毒毒株C1Je参考基因组中的位置，由左至右的箭头表示该引物与参考基因组序列一致；由右至左方向的箭头表示该引物与参考基因组序列反向互补。灰色背景方括弧内序列为基因分型的靶位点。
图2为高分辨率溶解曲线检测猫冠状病毒23531位3种SNP位点对应的溶解曲线图。
图3为验证猫冠状病毒RT-实时定量扩增(RT-Realtime PCR)敏感性的实验结果，图3中，微量反应管上方数字示RT-Realtime PCR反应起始模板的拷贝数。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
除非另外指明，否则本发明的实施将采用本领域常规的分子生物学、生物技术和农业领域技术。除非另外指明，否则本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
本发明涉及用于猫冠状病毒核酸检测的寡核苷酸引物以及应用这些引物建立的高分辨率溶解曲线(HRM)的检测与分型方法。该扩增反应体系包括扩增反应缓冲液、特异性引物、探针引物、dNTPs、DNA聚合酶-反转录酶混合物、ROX Reference Dye以及待检RNA样本。建立的反应体系经反转录和扩增反应后应用HRM软件进行分析可确定样本病毒的存在与否和对应的基因型。
下面通过具体的实施例进行介绍。
实施例1建立用于猫冠状病毒HRM检测和分型方法
步骤1：制备阳性对照标准品
委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成3个猫冠状病毒参考株C1Je纤突蛋白编码基因S序列片段，(GenBank登录号：DQ848678基因组中第23400位至第23705位序列)，分别命名为片段1、片段2、片段3，3条片段分别包含了猫冠状病毒该位点的3个基因型，片段1的序列包括基因组第23531位为T的基因型，片段2的序列包括基因组第23531位为C的基因型，片段3的序列包括基因组第23531位为A的基因型。在每个合成的S基因片段的5′-末端和3′-末端分别引入Kpn I和BamH I限制性酶切位点，分别命名为23531T、23531C和23531A。
23531T的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：4所示的序列；23531C的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：5所示的序列；23531A的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：6所示的序列。
将每个合成的S基因片段和
Figure BDA0002558080530000103
-3Z(Promega)质粒载体分别经Kpn I和BamHI双酶切获得具有黏性末端的线性载体和外源基因。具体酶切反应体系如下：
Figure BDA0002558080530000101
37℃酶切反应30min，反应结束后的线性质粒载体和外源基因用Cycle-Pure PCR产物回收试剂盒(Omega Bio-tek)回收后，建立连接反应，具体反应体系为：
Figure BDA0002558080530000102
室温连接不少于15min，得到三种连接产物。随后将连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α。具体方法如下：取大肠杆菌感受态细胞DH5α，在溶融状态下加入连接产物，冰上放置30min。随后在42℃水浴热激90s，再冰浴1-2min。加入800μL SOC培养基，37℃温和振荡培养60min。取200μL涂布于LB/Ampicillin筛选平板培养基上，37℃培养箱中培养过夜。将中等大小菌落接种于LB/Ampicillin液体培养基，37℃震荡培养12h。应用质粒提取试剂盒(Omega Bio-tek)提取质粒。Kpn I/BamH I双酶切法鉴定阳性质粒，获得阳性重组质粒，分别命名为pGEM-23531T、pGEM-23531C和pGEM-23531A。阳性重组质粒经Xba I线性化、纯化后做为模板，应用T7RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System(Promega)试剂盒，建立如下体外转录体系：
Figure BDA0002558080530000111
混匀后37℃水浴中反应30min，得到反应混合液。向反应混合液中加入1U的RQ1RNase-Free DNase(Promega)，37℃作用15min，消化模板DNA。随后反应混合物用RNeasyMini Kit(Qiagen)试剂盒纯化RNA转录物，50μL RNase-Free H2O溶解后备用。
按以下公式：copies/μl＝6.02×1023×10-9×RNA浓度/(片段长度×340)将RNA转录物稀释成不同浓度后作为阳性对照标准品或敏感性试验的RNA模板。将阳性对照标准品置于-80℃保存。
采用上述方法获得的RNA阳性对照物分别为RNA阳性对照物1、RNA阳性对照物2、RNA阳性对照物3；RNA阳性对照物1的序列包括SEQ ID NO：7所示的序列；RNA阳性对照物2的序列包括SEQ ID NO：8所示的序列；RNA阳性对照物3的序列包括SEQ ID NO：9所示的序列。SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9还包括了pGEM-3Z中启动子和多克隆酶切位点的部分序列，转录起始在T7启动子上。
步骤2：制备阴性对照标准品
以无菌无酶水(DNase/RNase-free ddH2O)作为阴性对照，具体制备方法包括：用超纯去离子水配置0.1％(v/v)的焦碳酸二乙酯(DEPC)，混匀过夜，经121℃，20min高压灭菌后分装。经检测无核酸酶和蛋白酶活性。
步骤3：引物合成与稀释
本发明所涉引物包括正向引物Fwd primer、反向引物Rev primer和探针引物probe等特异性引物。
如图1所示，为特异性引物在猫冠状病毒毒株C1Je参考基因组中的位置，由左至右的箭头表示该引物与参考基因组序列一致；由右至左方向的箭头表示该引物与参考基因组序列反向互补。灰色背景方括弧内序列为基因分型的靶位点。从图1中可以看出，上游引物的序列包括与参考基因组第23421-23444位区域序列一致的序列；下游引物的序列包括与参考基因组第23533-23555位区域反向互补的序列；探针引物的序列包括与参考基因组第23449-23472区域序列一致的序列；在探针引物的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素和BHQplus基团。
具体的，引物Fwd primer的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；引物Rev primer的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。probe的核苷酸序列包括SEQID No：3所示核苷酸序列。在probe探针序列5′-末端和3′-末端分别标记5-羧基荧光素(FAM)和BHQplus基团。
委托北京六合华大基因科技有限公司合成上述引物。
将上述合成的引物冻干粉先分别用无酶灭菌去离子水稀释成100μM。之后制备10μM引物工作液。
步骤4：建立扩增反应体系
在0.2mL PCR 8联管中建立反应体系，具体如下：
Figure BDA0002558080530000131
同时，以RNA阳性对照物1、RNA阳性对照物2和RNA阳性对照物3作为不同基因型的阳性对照，以无核酶的灭菌去离子水作为阴性对照，建立同样反应体系。
反应体系配制好后，轻混匀微量反应管内液体。进行如下反应：
Figure BDA0002558080530000132
步骤5：结果判断
如无扩增曲线，说明整个扩增反应过程中检测不到扩增信号，待测样品中不存在引物特异性猫冠状病毒；如扩增的循环阈值Ct(cycle threshold)≤37，则说明病毒基因得到较好扩增，则可根据待检样品的HRM曲线与阳性对照物的溶解曲线和峰型比对结果确定样品中病毒的23531位核苷酸对应的基因型。如果反应的38≤Ct值≤40，说明检测结果存疑；如果Ct值＞40则说明反应没有扩增到目的条带，检测结果为阴性。
如图2所示，为高分辨率溶解曲线检测猫冠状病毒23531位3种SNP位点对应的溶解曲线图，从左到右依次为23531C、23531A、23531T转录得到的阳性对照扩增反应的结果，通过待检样品的HRM曲线与阳性对照物的溶解曲线和峰型比对结果确定样品中病毒的23531位核苷酸对应的基因型。
如待检样品中的该位点对应的核苷酸为T或C位点，其编码的病毒S蛋白第1058位为亮氨酸(L)，说明病毒具有较强的全身性感染的能力，毒力较强；如待检样品中的该位点对应的核苷酸为A，说明S蛋白第1058位则为甲硫氨酸(M)，病毒仅具有轻微的肠道感染能力，毒力较弱(图2)。
实施例2
验证采用本发明实施例1所述引物进行猫冠状病毒实时定量扩增的检测结果敏感性。包括以下步骤：
稀释RNA模板：取体外转录制备好的RNA作为模板(即实施例1步骤1制备的3种阳性对照标准品)，定量后用无菌无酶去离子水将RNA拷贝数浓度分别稀释至104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、5copies/μL和100copy/μL作为待检样本，同时取阴性对照作为0copy/μL模板RNA。
检测体系的建立
在0.2mL PCR 8联管中建立反应体系，具体如下：
Figure BDA0002558080530000151
反应体系配制好后，轻混匀微量反应管内液体。进行如下反应：
Figure BDA0002558080530000152
通过实时扩增曲线判定反应结果，确定反应敏感性。
图3为验证猫冠状病毒RT-实时定量扩增(RT-Realtime PCR)敏感性的实验结果，图3中，微量反应管上方数字示RT-Realtime PCR反应起始模板的拷贝数。从图3中可以看出当反应体系内待测RNA拷贝数大于5copies/μL时，扩增反应的Ct值为32，得到较好扩增，而当模板RNA小于5个拷贝数时则没有出现明显的扩增曲线，说明应用本发明提供的引物建立的方法检测下限可达到5个拷贝数的RNA分子，具有检测灵敏度高的优点。
实施例3
采用本发明实施例1所述引物的HRM检测方法在猫冠状病毒宠物临床检测中的应用。
2018年8月-2018年11月，从长春、沈阳、烟台多家宠物医院获取了包括血浆、血清和腹水在内的42份FIP疑似病料样本。经发明实施例1所述方法进行了检测。其中6份样品的无明显扩增曲线，低于检测下限，结果为阴性，1份样品Ct值为39，结果存疑，37份样本Ct值≤37，判定为猫冠状病毒阳性，为总样本量的88.0％；在这37份阳性样本中，第23531位HRM扩增曲线对应的基因型为T的有22个；鉴定为C的为4个，该位点为A的共有11个。据此推断，该位点对应的S蛋白第1058位氨基酸为L的样本共有26个，占总阳性样本的70.3％，占总样本量的61.9％；而该位点氨基酸为M的样本共有11个，占总阳性样本的29.7％，占总样本量的26.2％。以上结果与RT-PCR扩增产物测序验证结果一致，以上结果说明，收集的这些样品中近九成(88％)含有猫冠状病毒，其中，约70％样本包含具有全身性感染能力的冠状病毒，在致病性和诱导传染性腹膜炎方面具有重要作用。使用本发明提供的检测方法可应用于宠物临床，不但能检测出猫冠状病毒感染，还可给出更明确的致病力相关信息。对宠物猫的冠状病毒携带、排毒监测、流行病学调查以及发生传染性腹膜炎可能性等都具有重要的临床指导意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 鲁东大学 吉林大学
<120> 一种用于猫冠状病毒基因扩增引物及基因分型方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgatttag tctgcgctca gtat 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgctaccgct gatgtgatag atc 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggcataat ggtactacct ggtg 24
<210> 4
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtacctgtt cagctggaac tgatgtggct gatttagtct gcgctcagta ttataatggc 60
ataatggtac tacctggtgt tgtagaccaa aataagatgg ctatgtatac agcctcatta 120
ataggcggta tggccttggg atctatcaca tcagcggtag cggtcccttt tgctatgcaa 180
gtacaggcta ggcttaatta tgtagcgttg cagactgatg ttttgcaaga gaatcagaaa 240
atacttgcta atgccttcaa taatgccatt ggcaacatca cgctggcgct gggaaaggtc 300
tctaatgcca ttggatcc 318
<210> 5
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtacctgtt cagctggaac tgatgtggct gatttagtct gcgctcagta ttataatggc 60
ataatggtac tacctggtgt tgtagaccaa aataagatgg ctatgtatac agcctcatta 120
ataggcggta tggcctcggg atctatcaca tcagcggtag cggtcccttt tgctatgcaa 180
gtacaggcta ggcttaatta tgtagcgttg cagactgatg ttttgcaaga gaatcagaaa 240
atacttgcta atgccttcaa taatgccatt ggcaacatca cgctggcgct gggaaaggtc 300
tctaatgcca ttggatcc 318
<210> 6
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtacctgtt cagctggaac tgatgtggct gatttagtct gcgctcagta ttataatggc 60
ataatggtac tacctggtgt tgtagaccaa aataagatgg ctatgtatac agcctcatta 120
ataggcggta tggcctaggg atctatcaca tcagcggtag cggtcccttt tgctatgcaa 180
gtacaggcta ggcttaatta tgtagcgttg cagactgatg ttttgcaaga gaatcagaaa 240
atacttgcta atgccttcaa taatgccatt ggcaacatca cgctggcgct gggaaaggtc 300
tctaatgcca ttggatcc 318
<210> 7
<211> 334
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gggcgaauuc gagcucggua ccuguucagc uggaacugau guggcugauu uagucugcgc 60
ucaguauuau aauggcauaa ugguacuacc ugguguugua gaccaaaaua agauggcuau 120
guauacagcc ucauuaauag gcgguauggc cuugggaucu aucacaucag cgguagcggu 180
cccuuuugcu augcaaguac aggcuaggcu uaauuaugua gcguugcaga cugauguuuu 240
gcaagagaau cagaaaauac uugcuaaugc cuucaauaau gccauuggca acaucacgcu 300
ggcgcuggga aaggucucua augccauugg aucc 334
<210> 8
<211> 334
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggcgaauuc gagcucggua ccuguucagc uggaacugau guggcugauu uagucugcgc 60
ucaguauuau aauggcauaa ugguacuacc ugguguugua gaccaaaaua agauggcuau 120
guauacagcc ucauuaauag gcgguauggc cucgggaucu aucacaucag cgguagcggu 180
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gcaagagaau cagaaaauac uugcuaaugc cuucaauaau gccauuggca acaucacgcu 300
ggcgcuggga aaggucucua augccauugg aucc 334
<210> 9
<211> 334
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggcgaauuc gagcucggua ccuguucagc uggaacugau guggcugauu uagucugcgc 60
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gcaagagaau cagaaaauac uugcuaaugc cuucaauaau gccauuggca acaucacgcu 300
ggcgcuggga aaggucucua augccauugg aucc 334

Claims (10)

1.一种用于猫冠状病毒扩增的寡核苷酸引物，其特征在于，能够特异性识别猫冠状病毒S基因，应用该引物可鉴定病毒23531位单核苷酸多态性位点的基因型。
2.根据权利要求1所述引物，其特征在于，包括上游引物、下游引物和探针引物中的一种或几种的组合；以猫冠状病毒毒株C1Je基因组为参考基因组，上游引物的序列包括与参考基因组第23421-23444位区域序列一致的序列；下游引物的序列包括与参考基因组第23533-23555位区域反向互补的序列；探针引物的序列包括与参考基因组第23449-23472区域序列一致的序列；探针引物的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素和BHQplus基团。
3.根据权利要求1或2所述引物，其特征在于，包括上游引物、下游引物和探针引物中的一种或几种的组合；上游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；下游引物的核苷酸序列包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；探针引物包括SEQ ID NO：3核苷酸序列，探针引物的5′-末端和3′-末端分别标记有5-羧基荧光素和BHQplus基团。
4.权利要求1-3任一项所述引物在制备猫冠状病毒检测和/或基因分型试剂盒中的应用。
5.一种基于猫冠状病毒g.23531 A＞Y SNP位点的RNA阳性对照物，其特征在于，所述RNA阳性对照物包括RNA阳性对照物1、RNA阳性对照物2、RNA阳性对照物3中的一种或几种的组合；RNA阳性对照物1为23531T的核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段，23531T的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：4所示的序列；RNA阳性对照物2为23531C的核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段，23531C的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：5所示的序列；RNA阳性对照物3为23531A的核苷酸片段通过体外转录获得的核糖核酸片段，23531A的核苷酸片段的序列包括SEQ ID NO：6所示的序列。
6.根据权利要求5所述RNA阳性对照物，其特征在于，RNA阳性对照物1的序列包括SEQID NO：7所示的序列；RNA阳性对照物2的序列包括SEQ ID NO：8所示的序列；RNA阳性对照物3的序列包括SEQ ID NO：9所示的序列。
7.权利要求5或6所述RNA阳性对照物在制备猫冠状病毒检测和/或基因分型试剂盒中的应用。
8.一种猫冠状病毒检测和/或基因分型试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述引物。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包括权利要求5或6所述RNA阳性对照物；优选的，还包括扩增反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、反转录酶、阴性对照标准品、待检测样品中的一种或几种。
10.一种猫冠状病毒检测和/或基因分型方法，其特征在于，包括以下步骤：利用权利要求1-3任一项所述引物采用扩增方法建立溶解曲线来明确23531位核苷酸对应的基因型。
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