CN112779353A - 一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用 - Google Patents

一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用，涉及基因工程技术领域，该核酸组合物包括第一试剂和/或第二试剂；第一试剂包括序列如SEQ ID No.1～2所示的引物对1和/或序列如SEQ ID No.3所示的探针1；第二试剂包括序列如SEQ ID No.4～5所示的引物对2和序列如SEQ ID No.6所示的探针2。第一试剂能有效检测猫冠状病毒的感染，第二试剂能快速检测是否有猫冠状病毒传染性腹膜炎相关突变位点，且灵敏度高，特异性好，准确度可高达95％左右，为猫冠状病毒或其相关疾病的临床诊断提供了快速准确的检测途径。

Description

一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试 剂盒和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用。
背景技术
猫冠状病毒(Feline Covronavirus，FCoV)感染在猫群中极为普遍，感染后一般引起较轻的胃肠道症状。猫传染性腹膜炎(Feline Infectious Peritonitis，FIP)是由冠状病毒引起的疾病，主要侵害2岁以下幼猫，临床症状一旦出现，死亡率很高。
“体内突变”假说认为在有些猫体内，FCoV基因组的某一特定区域发生突变，从而产生一种新的表型，能在巨噬细胞内复制，FCoV特定位点突变后，改变了原有的组织嗜性，使其发展为全身性、渐进性、高致死性疾病，即为FIP。
FIP临床大多分为渗出型和非渗出型两类：渗出型FIP以腹膜炎、大量腹水聚集为主要症状；非渗出型FIP以眼部以及神经症状为主，渗出型和非渗出型致死率均较高。
在FIP的临床诊断中，一般需要结合病猫的生化指标特点和其他检测方法共同判断，对医生经验要求较高。常用的检测方法如检测渗出液/漏出液的李凡他实验，其阳性符合率较低；间接免疫荧光检测抗体法则不能区分未突变的FCoV与FIPV，对实际临床治疗无明显意义；RT-PCR(Reverse Transcription-PCR)：由于猫冠状病毒为RNA病毒，突变率高，引物设计较为困难，一般在病毒的高度保守序列设计引物，然后对扩增产物进行测序，才能进一步确认是否为猫传染性腹膜炎。
FIP具有发病率高、诊断困难的特点，且暂无有效疫苗进行预防。而目前常用的检测手段存在特异性及敏感性较低、检测周期过长等缺点。因此需要一款快速准确的检测试剂，以便尽早对患有FIP的病猫进行特异性的诊断治疗。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，所述核酸组合物包括：用于检测猫冠状病毒的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎相关突变位点的第二试剂；
所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示，所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。第二方面，本发明实施例提供了一种核酸组合物，所述核酸组合物包括：用于检测猫冠状病毒的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎相关突变位点的第二试剂；
所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示，所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。第三方面，本发明实施例提供了一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒，其包括如前述实施例所述的核酸组合物。
第四方面，本发明实施例提供了一种用于检测猫冠状病毒的方法，其包括：采用如前述实施例所述的核酸组合物或如前述实施例所述的试剂盒对待测样本进行检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用，该核酸组合物包括用于检测猫冠状病毒的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎的第二试剂；所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示，所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。上述第一试剂能有效检测猫冠状病毒的感染，第二试剂能快速检测是否有猫冠状病毒传染性腹膜炎相关突变位点，且检测的灵敏度高，特异性好，准确度可高达95％左右，为猫冠状病毒或其相关疾病的临床诊断提供了快速准确的检测途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Taqman-MGB探针法原理图，其中A为探针完全匹配时的示意图，B为探针错配时的示意图；
图2为登录号为NC_012938.1的猫冠状病毒中S蛋白基因序列；
图3为验证例1中实施例1和对比例1提供的引物对的扩增结果图；
图4为验证例2中特异性检测结果；
图5为验证例3中的猫冠状病毒在最低检测限时的扩增图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，所述核酸组合物包括：用于检测猫冠状病毒(FCoV)的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎(FIP)相关突变位点的第二试剂；
所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示，所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。由于猫冠状病毒的核酸序列具有高突变性，检测时很难特定有效地检测区域，上述引物对1和探针1的检测目的区域为序列号DQ848678.1的第26788～27157位的区域进行检测，若存在PCR扩增结果，则可以判定该样本的主体感染了猫冠状病毒。
此外，引物对2和探针2用于检测登录号为NC_012938.1的猫冠状病毒中S蛋白基因序列，请参照附图2，当该序列的第3139位置的碱基由A突变为Y(C或T)，则判定此冠状病毒已突变为可引起猫传染性腹膜炎的病毒。采用上述第二试剂能够特异性地检测待测样本的主体是否有猫传染性腹膜炎，且检测过程快速，灵敏度高，准确度可高达95％左右，为猫冠状病毒或其相关疾病的临床诊断提供了快速准确的检测途径。
在实际临床使用中可先使用猫冠状病毒检测试剂进行筛查，若为阳性则可进一步检测是否具有猫传染性腹膜炎相关位点突变，若为阴性则可排除猫冠状病毒感染。
优选地，所述探针1序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、CY3、NED、TXR、ROX、CY5中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY中的任意一种。
优选地，所述探针2为Taqman-MGB探针，参照附图1，5’端标记有荧光报告基团。Taqman-MGB(Minor Groove Binder)探针法是高度特异的实时荧光定量PCR技术，由于其在3’端特有的小沟结合物，使得探针在长度较短时就可达到所需的Tm(MeltingTemperature)值，且待测模板一旦在探针位置发生突变，探针就不能与模板结合，从而实现单核苷酸突变检测。
优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、NED、TXR和ROX中的任意一种。
当核酸组合物同时包括第一试剂和第二试剂时，FCoV为阳性、FIP为阴性，则指示待测样本的主体仅有猫冠状病毒感染，但猫传染性腹膜炎的可能性很低；若FCoV与FIP为均为阳性，则指示待测样本的主体存在猫冠状病毒感染，且猫传染性腹膜炎的可能性很高；若FCoV与FIP为均为阴性，则指示未检测到有猫冠状病毒感染。
本发明实施例还提供了一种核酸组合物，所述核酸组合物包括：用于检测猫冠状病毒的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎的第二试剂；
所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示，所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。优选地，当所述核酸组合物包括引物对1、引物对2、探针1和探针2时，所述引物对1和所述引物对2中上下游引物,以及所述探针1～2的工作浓度均为0.2～0.6μM。
在一些实施例中，引物对1～2、探针1～2的工作浓度均可以选自：0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM中的任意浓度。在该范围内，PCR检测具有更好的扩增效果。
本发明实施例还提供了一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒，其包括如前述任一实施例所述的核酸组合物。
优选地，所述试剂盒中还包括有PCR反应液。
在一些实施例中，PCR反应液包括逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2中的至少一种。
此外，本发明实施例还提供了一种用于检测猫冠状病毒的方法，其包括：采用如前述任一实施例所述的核酸组合物或如前述任一实施例所述的试剂盒对待测样本进行检测，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
优选地，所述检测的方式为PCR检测，所述PCR检测的反应条件为：48～52℃逆转录5～30min；93～97℃预变性2～5min；93～97℃变性5～15s；56～60℃退火延伸20～40s。在该反应条件下，PCR检测具有更好的检测效果。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。
其中，第一试剂包括引物对1和探针1，序列参照表1，引物的退火温度为55～65℃。
第二试剂包括引物对2和探针2，具体参照表1。
表1序列信息
Figure BDA0002878166710000051
实施例2
一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的方法，其包括以下步骤。
采用实施例1提供的试剂盒进行PCR反应，试剂盒采用25μL反应体系，包括12.5μLPCR反应液(包括逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和MgCl2等)和引物探针组，引物探针浓度见表2，其中PCR反应液均购自常规商业厂家，模板体积为5μL。
表2反应浓度
Figure BDA0002878166710000061
PCR反应条件为：50℃10min，95℃3min，95℃5s，56℃30s，共45个循环，其中56℃设置采集荧光信号。
对比例1
一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，与实施例1大致相同，区域在第一试剂和第二试剂的引物探针序列不同，请参照表3。
表3序列信息
Figure BDA0002878166710000062
Figure BDA0002878166710000071
验证例1
验证实施例1和对比例1的引物探针组的检测效果。
委托赛默飞世尔科技公司进行合成引物探针组(实施例1和对比例1)，并按照说明书进行稀释。对猫冠状病毒的临床样本进行核酸提取，提取后的病毒核酸先使用市售Y厂家的PCR单项检测试剂进行扩增，以确认样本中确实含有猫冠状病毒。分别使用实施例1和实施例2的引物探针组合配制PCR试剂，并加入对应的阳性病原体核酸，进行扩增，实施例1和对比例1中第一试剂的扩增对比结果如图3所示。第二试剂的扩增对比结果如表4所示。
表4扩增结果
Figure BDA0002878166710000072
由结果可知，相比对比例1的第一试剂和第二试剂，实施例1提供的第一试剂和第二试剂的Ct更小，且荧光值更高，检出率更高。
验证例2
验证实施例1提供的引物探针组的特异性。
采用实施例1提供的试剂盒，根据实施例2提供的检测方法，对加入其它干扰病原体的样本进行测试，包括犬冠状病毒、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒和犬瘟热病毒。
结果如图4所示。结果显示，本发明实施例1提供的试剂盒对其余病原体无交叉扩增。
验证例3
验证实施例1提供的引物探针组的灵敏度。
将猫冠状病毒的质粒稀释至5×102copies/mL、2×102copies/mL的浓度后依次采用实施例1提供的试剂盒，根据实施例2提供的检测方法进行扩增，检出率在95％以上的最低样本浓度即为检测限浓度。猫冠状病毒的质粒稀释至5×102copies/mL时的检测结果如图5所示。
结果显示，终确认实施例1检测猫冠状病毒的第一试剂的检测灵敏度为5×102copies/mL。
验证例4
本实施例使用实施例1中的试剂盒，对收集到的100例临床样本进行测试，其中，共96例猫冠状病毒为阳性，88例FIP阳性，如表5所示。
表5临床样本信息
样本 FCoV FIP
88例 + +
8例 + -
4例 - -
检测结果如表6所示。
表6检测结果
样本 样本类型 FCoV FIP
80例 腹水 + +
4例 腹水 - -
6例 腹水 + -
5例 粪便拭子 + -
5例 腹水 - +
检测结果显示有91例猫冠状病毒阳性，85例FIP阳性，阳性符合率分别为FCoV94.8％(91/96)、FIP 96.6％(85/88)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海基灵生物科技有限公司
<120> 一种用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的核酸组合物及其试剂盒和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtactgataa tttgagtgaa caac 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaaggttca tctccccaca 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aatggccaca cagggacaac cg 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agccatgtac actgchtc 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcctgcactt gcatagcraa 20
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggtatggcd ytgg 14
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cttctaaatg gccacacagg gtg 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cacgagagtt agaacgacca gc 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgtcaactgg ggagatgaac cttgg 25
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agccatgtac actgcctca 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcctgcactt gcatagcaaa a 21
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aggtatggct ytgg 14

Claims (10)

1.核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述核酸组合物包括：用于检测猫冠状病毒的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎相关突变位点的第二试剂；
所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示，所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述探针1序列的5’端标记有荧光报告基团，3’端均标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、CY3、NED、TXR、ROX、CY5中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3和QSY中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述探针2为Taqman-MGB探针，5’端标记有荧光报告基团。
5.根据权利要求4所述的核酸组合物在制备用于检测猫冠状病毒或其相关疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、NED、TXR和ROX中的任意一种。
6.一种核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物包括：用于检测猫冠状病毒的第一试剂和/或用于检测猫传染性腹膜炎的第二试剂；
所述第一试剂包括引物对1和/或探针1，所述引物对1的序列如SEQ ID No.1～2所示；所述探针1的序列如SEQ ID No.3所示；
所述第二试剂包括引物对2和/或探针2，所述引物对2的序列如SEQ ID No.4～5所示；所述探针2的序列如SEQ ID No.6所示。
7.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求6所述的核酸组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，当所述核酸组合物包括引物对1、引物对2、探针1和探针2时，所述引物对1和所述引物对2中上下游引物,以及所述探针1～2的工作浓度均为0.2～0.6μM。
9.一种用于检测猫冠状病毒的方法，其特征在于，其包括：采用如权利要求6所述的核酸组合物，或如权利要求7或8所述的试剂盒对待测样本进行检测；
所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
10.根据权利要求9所述的用于检测猫冠状病毒的方法，其特征在于，所述检测的方式为PCR检测，所述PCR检测的反应条件为：48～52℃逆转录5～30min；93～97℃预变性2～5min；93～97℃变性5～15s；56～60℃退火延伸20～40s。
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