CN112538550A - 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用 - Google Patents

基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系及应用，基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系包括RT‑RPA体系和CRISPR/Cas体系，RT‑RPA体系包括DHAV‑1的RT‑RPA扩增引物RPA‑F1/RPA‑R1和DHAV‑3的RT‑RPA扩增引物RPA‑F3/RPA‑R3，CRISPR/Cas体系同时包括CRISPR//Cas12a和CRISPR//Cas13a两种蛋白，Cas12a为LbCas12a，Cas13a为LwCas13a。本发明基于RT‑RPA和CRISPR/Cas的DHAV‑1和DHAV‑3检测体系能够快速、精准检测DHAV‑1和DHAV‑3，而且可检测出含单拷贝DHAV‑1和DHAV‑3的样品，灵敏度高，而且可一次性全面检测DHAV‑1和DHAV‑3，并且区分是血清1型或是血清3型感染或是共感染，检测体系可在恒温37℃进行反应，对设备要求低，将上述DHAV‑1和DHAV‑3检测体系制作为试剂盒适用于推广使用。

Description

基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用
技术领域
本发明属于病原检测技术领域，具体涉及基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用。
背景技术
鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)引起的鸭病毒性肝炎主要侵害1～3周龄的雏鸭。感染该病毒后发病过程迅速，雏鸭在感染24小时左右即发病，并且该病毒的传染性强、致死率高，感染后雏鸭的病死率可高达90％以上，因此DHAV对我国养鸭业造成了严重影响。DHAV现有3个血清型，我国主要流行血清1型(DHAV-1)和血清3型(DHAV-3)。目前，DHAV-1疫苗已推广使用，并且也已有成功获得DHAV-3弱毒疫苗候选株的研究报道。因此，疫情的实时监测和及时的疫苗接种是有效防控鸭甲型肝炎的重要手段。
目前，针对鸭甲型肝炎病毒的检测方法有常规的如病毒中和试验、ELISA、电镜检测、胶体金试纸等，这些方法有其各自的优势，但也存在例如操作复杂、耗时较长、灵敏度和特异性差等缺点。另外，实时荧光定量PCR技术也是目前广泛应用于DHAV检测的技术，然而该方法对于Ct值接近临界点的样本常常无法准确判断检测结果，并且仪器设备价格昂贵，难以在基层普及应用。
这两年新兴的基因编辑工具CRISPR/Cas系统已被应用于核酸诊断检测，在2018年其被美国Science杂志誉为“下一代分子诊断技术”。CRISPR/Cas的核酸检测技术与现在检测最常用的qPCR和ELISA相比更快速且易实施。CRISPR/Cas检测可以与基于等温扩增技术的RPA技术结合，这样可以不需要复杂的仪器设备即可完成检测；另外，该技术的检测结果也可以用试纸条进行显色，因此CRISPR/Cas检测技术在疫病的现场快速检测方面也具有非常大的应用潜力。目前，还没有将CRISPR/Cas检测技术运用于DHAV检测的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用，采用该检测体系可同时检测DHAV-1和DHAV-3，特异性好，灵敏度高，并且可应用于开发现场快速检测试剂盒或检测产品。
为实现上述技术目的，本发明采取的技术方案为：一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，包括RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas检测体系，RT-RPA等温扩增体系包括DHAV-1的RT-RPA扩增引物和DHAV-3的RT-RPA扩增引物，DHAV-1的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.3所示的RPA-F1和SEQ ID NO.4所示的RPA-R1，DHAV-3的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.5所示的RPA-F3和SEQ ID NO.6所示的RPA-R3，CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR//Cas12a和CRISPR//Cas13a，Cas12a为LbCas12a，Cas13a为LwCas13a。
进一步地，所述RT-RPA等温扩增体系还包括Rehydration Buffer、RNaseInhibitor、模板RNA、RNase free water和醋酸镁。
进一步地，所述Cas12a识别的靶向DHAV-1序列的crRNA为核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的crRNA1：所述Cas13a识别的靶向DHAV-3序列的crRNA为核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的crRNA3。
进一步地，所述CRISPR/Cas检测体系还包括检测探针、T7RNA聚合酶、RNaseInhibitor、NTPs Mix、MgCl2、RT-RPA反应产物和RNase free water。
进一步地，所述检测探针包括CRISPR//Cas12a可剪切的携带VIC荧光基团用于检测DHAV-1的ssDNA探针和CRISPR//Cas13a可剪切的携带FAM荧光基团用于检测DHAV-3的ssRNA探针，所述携带VIC荧光基团的ssDNA探针的序列为5’-VIC-TTATTATT-BHQ1-3’，所述携带FAM荧光基团的ssRNA探针的序列为5’-FAM-UUUUUUUC-BHQ1-3’。进一步地，所述检测探针为在上述用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上改变报告基团后获得的探针。
所述检测探针为在上述用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上改变报告基团后获得的探针。
进一步地，所述检测探针为在用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上将荧光报告基团去除后在探针的巯基处修饰纳米金或在探针的3’端引入Biotin基团后获得的探针
利用上述基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系检测DHAV-1和DHAV-3基因的方法，包括以下步骤：
(1)首先用RT-RPA引物对待测样品中的病毒RNA进行反转录后进行RPA扩增；
(2)取步骤(1)RT-RPA扩增后的体系与CRISPR/Cas体系混合反应后进行荧光检测或直接观察显色反应。
本发明还提供了一种采用上述基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系的DHAV-1和DHAV-3检测试剂盒。
本发明还提供了上述基于RT-RPA和CRISPR/Cas检测体系或DHAV-1和DHAV-3检测试剂盒在制备DHAV-1和DHAV-3检测产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas检测体系能够快速、精准检测DHAV-1和DHAV-3的检测体系和方法，基于本发明的检测体系进行DHAV-1和DHAV-3同时检测的方法具有灵敏度高的技术优势：目前DHAV公认最准确的检测方法为荧光定量PCR，我们通过试验比较，本发明建立的检测方法灵敏度比荧光定量PCR至少高一个数量级，可以检测到单个核酸分子；
(2)本发明的DHAV-1和DHAV-3检测体系可一次性全面检测血清1型和血清3型鸭甲型肝炎病毒，并且可以区分是血清1型或是血清3型感染或是共感染；而且该检测体系在恒温37℃就能进行反应，对设备要求不高，只需简单的恒温设备甚至体温即可使反应进行，有利于在基层检测普及；
(3)本发明所建立的检测体系中负责显示检测结果的探针可以采用荧光探针，也可以替换为可直接显色的探针，从而开发成采用如试纸等可以不需仪器设备用肉眼即可判断结果的检测试剂盒，可以随时随地及时检测，适用于临床和基层人员检测，降低成本。
附图说明
图1是本发明实施例2的特异性检测结果；
图2是本发明本发明实施例2的灵敏度检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：靶向病毒特异位点crRNA的设计
CRISPR/Cas检测方法的核心在于识别病毒特异位点的crRNA，crRNA的序列包括：与Cas蛋白结合的锚定支架序列和crRNA向导序列，其中向导序列则与靶序列中的片段匹配。为了筛选效果较好的crRNA，我们分别针对DHAV-1的VP0基因和DHAV-3的VP3基因设计了一些crRNA，结果发现如表1所示的crRNA具有很好的检测效果。
Cas12a识别的靶向DHAV-1序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.1所示；
Cas13a识别的靶向DHAV-3序列的crRNA：其序列如SEQ ID NO.2所示；
表1 识别DHAV-1和DHAV-3特异位点的crRNA
Figure BDA0002862646770000041
(注：表中大写字母为Cas蛋白结合的锚定支架序列；小写字母为向导序列)
以上设计的crRNA序列，可由生物公司直接化学合成，也可以构建crRNA体外转录载体用T7体外转录试剂盒进行体外转录和纯化获得。
实施例2：基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及其检测方法的建立
一、建立基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系
基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系(简记“DHAV-1和DHAV-3检测体系”)包括RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas检测体系，其中RT-RPA等温扩增体系(25μl)如表2所示：
表2 RT-RPA等温扩增体系
Figure BDA0002862646770000042
其中，RNase Inhibitor、RNase free water、Rehydration Buffer和醋酸镁(MgAc)来自
Figure BDA0002862646770000043
Basic RT RPA试剂盒(TwistDx，产品货号：TABASRT01KIT)；
DHAV-1的RT-RPA扩增引物：
RPA-F1：5’-GTTCCAAATGATGATTATTATGCCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO.3)
RPA-R1：5’-TTAGACTCCTTCTCTCAACATTTGCATGGAT-3’(SEQ ID NO.4)
DHAV-3的RT-RPA扩增引物序列：
RPA-F3：5’-TAATACGACTCACTATACTAGCAAGTTTCCAGTGGCAGTCAACCCTAAC-3’(SEQ IDNO.5)
RPA-R3：5’-GTTCACCATCAGCAATTGGATACCAAGACAT-3’(SEQ ID NO.6)；
CRISPR/Cas检测体系(20μl)如表3所示：
表3 CRISPR/Cas检测体系
Figure BDA0002862646770000051
其中，10×Buffer中的组分包括Tris-HCl(400mM)，NaCl(600mM)，MgCl2(60mM)，pH7.5。
DHAV-1-ssDNA探针：5’-VIC-TTATTATT-BHQ1-3’(SEQ ID NO.7)；
DHAV-3-ssRNA探针：5’-FAM-UUUUUUUC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.8)；
实施例中，DHAV-1-ssDNA探针可将荧光报告基团去掉改为在ssDNA探针的巯基处修饰纳米金，DHAV-3-ssRNA探针的3’端改为Biotin基团，这样可以进一步开发为试纸显色产品。
二、基于DHAV-1和DHAV-3检测体系的检测方法
检测机理：RT-RPA引物对待测样品中的病毒RNA进行反转录后进行RPA扩增，得到RT-RPA反应产物；CRISPR/Cas12a在crRNA(crRNA1)的引导下识别靶标分子DHAV-1的DNA，之后CRISPR/Cas12a、crRNA(crRNA1)和靶标DNA分子三者结合形成复合物，该复合物切割检测体系内携带VIC荧光基团的ssDNA探针，探针分子被切开后产生大量可被检测的黄色荧光；CRISPR/Cas13a在crRNA(crRNA3)的引导下识别靶标分子DHAV-3的RNA，之后CRISPR/Cas13a、crRNA(crRNA3)和靶标RNA分子三者结合形成复合物，该复合物切割检测体系内携带FAM荧光基团的ssRNA探针，探针分子被切开后产生大量可被检测的绿色荧光。
利用DHAV-1和DHAV-3检测体系进行DHAV-1和DHAV-3检测的方法包括如下步骤：
1、扩增目的片段
1.1、提取病毒RNA
取200μL病料组织研磨液上清，根据Axygen公司的AxyPrepTM Body Fluid ViralDNA/RNA Miniprep Kit提取待测样品RNA，具体的操作参见该试剂盒产品说明书。
1.2、RT-RPA扩增
设计合成用于扩增靶基因的RPA上下游引物，引物长度为30-35个核苷酸；如表4所示，检测DHAV-1的RPA扩增引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；检测DHAV-3的RPA扩增引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；其中，扩增DHAV-3片段的上游引物RPA-F3包含T7启动子(表4中RPA-F3的下划线部分序列)，T7启动子的引入使得扩增产物可以被CRISPR/Cas13a系统检测；
表4 用于扩增靶基因的RPA上下游引物
Figure BDA0002862646770000061
依照表2所示的RT-RPA等温扩增体系依次加样，混匀后将反应管放入37℃恒温培养箱中反应20min；
表2所示的RT-RPA等温扩增体系中模板RNA选择：对于待测样品，模板RNA为待测样品RNA；对于阴性对照组，模板RNA用灭菌双蒸水替代；
2、CRISPR/Cas检测DHAV-1和DHAV-3
取步骤1的RT-RPA扩增产物1μl加入到表3所示的CRISPR/Cas检测体系中，混匀后放入荧光定量PCR仪，设置FAM通道和VIC通道检测荧光信号变化；设置37℃反应15s，37℃反应45s(收集荧光)，共30个循环；
3、结果判断标准
荧光阈值的确定：阴性对照平均值加标准差三倍的荧光值作为判断区分背景信号与阳性信号的临界点；
VIC通道的荧光值显著高于阈值的判定为DHAV-1阳性，FAM通道的荧光值显著高于阈值的判定为DHAV-3阳性，VIC和FAM通道的荧光值都显著高于阈值的判定为DHAV-1和DHAV-3共感染。
实施例3：基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系检测DHAV-1和DHAV-3的特异性分析
用Axygen公司的AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取鸭坦布苏病毒(DTMUV)、禽流感病毒H9亚型(AIV-H9)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、鸭瘟病毒(DPV)以及DHAV-1和DHAV-3的RNA，按照本发明实施例2的基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系的DHAV-1和DHAV-3检测体系及程序对上述样品依次进行RT-RPA扩增和CRISPR/Cas检测DHAV-1和DHAV-3。
结果如图1所示，DTMUV、AIV-H9、NDRV、DPV这些常见的鸭易感病毒样品反应前后的荧光信号值基本不变与阴性对照相似，而DHAV-1和DHAV-3样品反应结束后的荧光信号值远远高于阴性对照的荧光值且差异极显著。以上结果表明，本发明构建的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系的检测方法特异性良好。
实施例4：基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系检测DHAV-1和DHAV-3的灵敏度分析
为了确定基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系的DHAV-1和DHAV-3检测体系的检测方法的灵敏度，将已知DHAV-1和DHAV-3病毒拷贝数的混合样品稀释成104拷贝/μl、103拷贝/μl、102拷贝/μl、101拷贝/μl、100拷贝/μl五个浓度梯度后作为模板，按照实施例2中的检测体系和检测程序分别进行扩增和检测。
结果如图2所示，100～104拷贝/μl模板扩增15min后的荧光信号显著高于阴性对照且具有统计学差异(P﹤0.0001)。以上结果说明，本发明建立的基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系的DHAV-1和DHAV-3检测体系及程序的检测方法可以检测出含单拷贝DHAV-1和DHAV-3的样品。
荧光定量PCR是目前公认的检测DHAV-1和DHAV-3方法中灵敏度最高的方法。而根据已有的通过双重荧光定量PCR方法检测DHAV-1和DHAV-3的文献(Qin,Hu,Dekang,et al.Aone-step duplex rRT-PCR assay for the simultaneous detection of duckhepatitis A virus genotypes 1 and 3[J].Journal of Virological Methods,2016.)报道该检测方法的最小检出量分别是98拷贝/反应(DHAV-1)和10拷贝/反应(DHAV-3)。由此可以看出，与荧光定量PCR相比，本发明建立的基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系的检测方法具有更高的检测灵敏度。
实施例5：已知临床样品的检测
按照本发明实施例2的方法(记作“RT-RPA-CRISPR/Cas”)与文献(Qin,Hu,Dekang,et al.A one-step duplex rRT-PCR assay for the simultaneous detection of duckhepatitis A virus genotypes 1 and 3[J].Journal of Virological Methods,2016.)报道的双重实时荧光定量PCR方法(记作“qRT-PCR”)同时对18份已知的临床样品(6份DHAV-1阳性：样品4、6、7、11、12、18；6份DHAV-3阳性：样品2、3、8、9、14、17；6份DHAV-1和DHAV-3阳性：样品1、5、10、13、15、16；已通过ELISA、普通PCR和qPCR多种方法检测确认样品阴阳性)进行检测，以对本发明的检测效果做进一步的确认；结果如表5所示；
表5 RT-RPA-CRISPR/Cas法与qRT-PCR法的检测结果
Figure BDA0002862646770000081
Figure BDA0002862646770000091
由表5中结果可知，18份阳性样品本发明的检测结果与qPCR的检测结果一致，并且本发明方法检测阴性对照的结果也为阴性，与实际结果一致。以上结果说明本发明建立的基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系的DHAV-1和DHAV-3检测体系及程序的检测方法可以准确检测出样品中的DHAV-1和DHAV-3阳性样品，检测结果可信度高。
实施例6：未知临床样品的检测
为了进一步评价本发明建立的基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系的DHAV-1和DHAV-3检测体系及程序的检测方法的效果，我们收集了40份未知的疑似DHAV临床样品，利用本发明实施例2的方法和文献(Qin,Hu,Dekang,et al.A one-step duplex rRT-PCR assay forthe simultaneous detection of duck hepatitis A virus genotypes 1and 3[J].Journal of Virological Methods,2016.)报道的双重荧光定量PCR方法进行检测，荧光定量PCR方法所用的反应引物、探针、反应体系和反应条件参照上述文献。
结果如表6所示，40份临床样品中有9份样品两种方法均检测为阴性；有26份样品荧光定量PCR检测为阳性样品，定量结果显示其病毒载量范围从102～108拷贝/μl，其中有9份样品的病毒载量低于103拷贝/μl，而利用本发明建立的检测方法也均可以检测出这些样品DHAV阳性，说明本方法对于荧光定量PCR检测DHAV阳性的样品无漏检情况。
表6 RT-RPA-CRISPR/Cas法与qRT-PCR法的检测结果
Figure BDA0002862646770000092
值得注意的是，在qRT-PCR检测出的结果﹤100拷贝/μl的14份样品中有8份样品荧光定量PCR检测所得Ct值与阴性对照Ct值相差不多难以判定阴阳性，而本发明的检测方法检测出这8份样品中有5份样品为阳性。以上结果说明本发明基于RT-RPA和CRISPR/Cas体系建立的检测DHAV-1和DHAV-3的方法能更敏感地检出病毒含量极低的样品，与荧光定量PCR方法相比灵敏度更高，发生漏检的几率更小。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aauuucuacu aaguguagau gaugcccuac cccuauuguc 40
<210> 2
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuacu ggagaggguc auuggagguu 60
aaau 64
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttccaaatg atgattatta tgcctgccta c 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttagactcct tctctcaaca tttgcatgga t 31
<210> 5
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactatacta gcaagtttcc agtggcagtc aaccctaac 49
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcaccatc agcaattgga taccaagaca t 31
<210> 7
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttattatt 8
<210> 8
<211> 8
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uuuuuuuc 8

Claims (9)

1.一种基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于，包括RT-RPA等温扩增体系和CRISPR/Cas检测体系，所述RT-RPA等温扩增体系包括DHAV-1的RT-RPA扩增引物和DHAV-3的RT-RPA扩增引物，所述DHAV-1的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.3所示的RPA-F1和SEQ ID NO.4所示的RPA-R1，所述DHAV-3的RT-RPA扩增引物为SEQ ID NO.5所示的RPA-F3和SEQ ID NO.6所示的RPA-R3，所述CRISPR/Cas检测体系包括CRISPR//Cas12a和CRISPR//Cas13a，所述Cas12a为LbCas12a，所述Cas13a为LwCas13a。
2.根据权利要求1所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于：所述RT-RPA等温扩增体系还包括Rehydration Buffer、RNase Inhibitor、模板RNA、RNase free water和醋酸镁。
3.根据权利要求1所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于：所述Cas12a识别的靶向DHAV-1序列的crRNA为核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的crRNA1：所述Cas13a识别的靶向DHAV-3序列的crRNA为核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的crRNA3。
4.根据权利要求1所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于：所述CRISPR/Cas检测体系还包括检测探针、T7 RNA聚合酶、RNase Inhibitor、NTPsMix、MgCl2、RT-RPA反应产物和RNase free water。
5.根据权利要求4所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于：所述检测探针包括CRISPR//Cas12a可剪切的携带VIC荧光基团用于检测DHAV-1的ssDNA探针和CRISPR//Cas13a可剪切的携带FAM荧光基团用于检测DHAV-3的ssRNA探针，所述携带VIC荧光基团的ssDNA探针的序列为5’-VIC-TTATTATT-BHQ1-3’，所述携带FAM荧光基团的ssRNA探针的序列为5’-FAM-UUUUUUUC-BHQ1-3’。
6.根据权利要求5所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于：所述检测探针为在权利要求5所述的用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上改变报告基团后获得的探针。
7.根据权利要求6所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系，其特征在于：所述检测探针为在权利要求5所述的用于检测DHAV-1的ssDNA探针和用于检测DHAV-3的ssRNA探针基础上将荧光报告基团去除后在探针的巯基处修饰纳米金或在探针的3’端引入Biotin基团后获得的探针。
8.基于RT-RPA和CRISPR/Cas的基于RT-RPA和CRISPR/Cas的一种采用权利要求1-7任一项所述基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系的DHAV-1和DHAV-3检测试剂盒。
9.权利要求1-7任一项所述的基于RT-RPA和CRISPR/Cas检测体系或权利要求8所述的DHAV-1和DHAV-3检测试剂盒在制备DHAV-1和DHAV-3检测产品中的应用。
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