CN116042917A - 一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重rt-pcr引物组及其应用 - Google Patents

一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重rt-pcr引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT‑PCR引物组及其应用，属于生化检测技术领域。本发明的检测试剂盒，能够实现一个PCR反应管中同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒，并具有较好的特异性、敏感性和重复性，可直接应用于猪临床腹泻样品病原的实验室诊断，为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的流行病学研究及临床鉴别诊断提供了一种快速、准确的检测方法，特别适用于科研及临床应用，具有很好的商业应用价值。

Description

一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR引物组及其应用
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR引物组及其应用。
背景技术
病毒性腹泻是困扰养猪业的一大难题。临床上以猪流行性腹泻病毒感染引起的病毒性腹泻最为常见，且常伴有多种腹泻病原的混合感染，这些常见病原包括猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒等。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(P.transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)均属于冠状病毒科的成员，其临床症状和病理变化极为相似，仅通过简单的临床症状辨别难以有效区分。且有研究显示，猪丁型冠状病毒是一种新型的人畜共患病原，这些病原的混合感染给临床腹泻病原诊断带来巨大挑战，其防控也具有重要的公共卫生意义。目前临床上鉴别这3种疾病的传统方法有临床观察、病毒分离、显微病变观察、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。因为PEDV，TGEV和PDCoV感染仔猪后引起的临床症状和病理变化非常相似，依赖临床观察和显微病变观察不能有效区分；免疫组织化学法和荧光抗体法具有较强的非特异性；而病毒分离周期较长，且这3种病毒只能感染一些特定的细胞。因此，建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的快速、准确的检测方法迫在眉睫。
多重qPCR检测技术，可在一个反应管中同时检测并定量分析多种病原，在临床多种病原混合感染的情况下进行病原快速区分优势明显，与单重qPCR相比，大大降低了检测过程中的材料成本和人力成本。然而建立一个有效的多重qPCR检测方法并非易事，由于多重qPCR反应体系中同时存在多种引物和探针对，如何保障引物和探针序列的特异性，避免出现非特异性扩增是多重qPCR检测技术面临的一大挑战。
发明内容
本发明的目的在于针对猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒基因S和猪丁型(德尔塔)冠状病毒M基因，筛选保守区域设计特异性引物探针，建立了猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量qPCR检测方法，可快速准确确诊临床腹泻的感染病原，有效指导腹泻防控。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR引物组，包括用于检测猪流行性腹泻病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-F如SEQ ID NO.1所示；
PEDV-R如SEQ ID NO.2所示；
PEDV-probe如SEQ ID NO.3所示；
用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
TGEV-F如SEQ ID NO.4所示；
TGEV-R如SEQ ID NO.5所示；
TGEV-probe如SEQ ID NO.6所示；
用于检测猪丁型冠状病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PDCoV-F如SEQ ID NO.7所示；
PDCoV-R如SEQ ID NO.8所示；
PDCoV-probe如SEQ ID NO.9所示。
优选地，所述探针的5’端分别修饰不同的荧光基团，3’端分别修饰不同的淬灭基团。
优选地，所述荧光基团为CY5、ROX和FAM，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
本发明提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含如上述所述引物组。
优选地，所述试剂盒还包括热启动Taq DNA聚合酶、反转录酶、无酶水、PCR反应液、配套Buffer、对照品。
优选地，所述对照品包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为带有猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因和猪丁型冠状病毒M串联基因片段的阳性重组质粒标准品模板，所述阴性对照为pUC57空载体。
优选地，所述串联基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR检测体系，以25μL总体积反应体系计，包括2×One Step RT-PCRBuffer III 12.5μL，5U Takara Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，浓度分别为0.4μmol/L的PEDV-F、PEDV-R、TGEV-F、TGEV-R各0.8μL，浓度分别为0.3μmol/LPDCoV-F、PDCoV-R各0.6μL，浓度分别为0.15μmol/L的PEDV-probe和TGEV-probe各0.3μL，浓度为0.1μmol/L PDCoV-probe 0.2μL，模板1μL、无核酶水加至25μL。
本发明提供了一种非诊断目的同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪德尔塔冠状病毒的三重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，使用所述引物组，或所述试剂盒，或所述检测体系进行PCR扩增，收集荧光信号；根据机器测算的荧光信号及Ct值判断样品中是否有PEDV、TGEV、PDCoV荧光信号，Ct＞35判定可疑，需重检。
优选地，所述反应程序如下：荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：ROX，通道3：CY5；反应条件为：42℃、5min，95℃、10s；95℃、5s，50.5℃、30s，35℃、30s，扩增35～40个循环。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明的试剂盒，能够在一个PCR反应管中同时进行猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎及猪丁型冠状病毒的检测，为这三种病原的检测提供了一种简便、高效和低成本的方法。
(2)本发明的试剂盒，为腹泻类病原的诊断提供了可靠的技术支撑，且在很大程度上降低了单重检测的工作量，大幅提高了检测效率。
(3)本发明的试剂盒重复性、特异性和灵敏性均较好，可以同时对三种猪腹泻病毒进行快速精准的临床检测，支撑临床腹泻病原的确诊。
附图说明
图1为不同Tm值得到的荧光定量PCR扩增曲线图；其中，从上至下依次为猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎及猪丁型冠状病毒扩增曲线。
图2为不同引物浓度得到的荧光定量PCR的扩增曲线图；
图3为不同探针浓度得到的荧光定量PCR的扩增曲线图；
图4为荧光定量PCR的扩增标准曲线；其中，1为2.19×107拷贝的阳性重组质粒；2为2.19×106拷贝的阳性重组质粒；3为2.19×105拷贝的阳性重组质粒；4为2.19×104拷贝的阳性重组质粒；5为2.19×103拷贝的阳性重组质粒；6为2.19×102拷贝的阳性重组质粒；7为阴性对照；
图5为实施例中荧光定量PCR的灵敏性检测结果图；其中，1为2.19×107拷贝的阳性重组质粒；2为2.19×106拷贝的阳性重组质粒；3为2.19×105拷贝的阳性重组质粒；4为2.19×104拷贝的阳性重组质粒；5为2.19×103拷贝的阳性重组质粒；6为2.19×102拷贝的阳性重组质粒；7为2.19×101拷贝的阳性重组质粒；8为2.19×100拷贝的阳性重组质粒；9为0.219×100拷贝的阳性重组质粒；10为阴性对照；
图6为实施例中的特异性检测结果图；其中，1是以阳性重组质粒2.19×106拷贝为模板的PEDV检测结果；2是以阳性重组质粒2.19×106拷贝为模板的TGEV检测结果；3是以阳性重组质粒2.19×106拷贝为模板的PDCoV检测结果；4是以猪蓝耳病毒核酸为模板的检测结果；5是以猪急性腹泻综合征冠状病毒核酸为模板的检测结果；6是以猪伪狂犬病毒核酸为模板的检测结果；7是以猪轮状病毒核酸为模板的检测结果；8是以猪圆环病毒2型核酸为模板的检测结果；9是阴性对照的检测结果。
图7为2.19×106拷贝阳性重组质粒为模板的重复性检测结果图。1是PEDV重复性检测结果；2是TGEV重复性检测结果；3是PDCoV重复性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR引物组，包括用于检测猪流行性腹泻病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-F如SEQ ID NO.1所示；
PEDV-R如SEQ ID NO.2所示；
PEDV-probe如SEQ ID NO.3所示；
用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
TGEV-F如SEQ ID NO.4所示；
TGEV-R如SEQ ID NO.5所示；
TGEV-probe如SEQ ID NO.6所示；
用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PDCoV-F如SEQ ID NO.7所示；
PDCoV-R如SEQ ID NO.8所示；
PDCoV-probe如SEQ ID NO.9所示。本发明所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
在本发明中，所述探针的5’端分别修饰不同的荧光基团，3’端分别修饰不同的淬灭基团。
在本发明中，所述荧光基团为CY5、ROX和FAM，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
本发明提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含如上述所述引物组。
在本发明中，所述试剂盒还包括热启动Taq DNA聚合酶、反转录酶、无酶水、PCR反应液、配套Buffer、对照品。
在本发明中，所述对照品包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为带有猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因和猪丁型冠状病毒M串联基因片段的阳性重组质粒标准品模板，所述阴性对照为pUC57空载体。
在本发明中，所述串联基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明提供了一种同时检测猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒和丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR检测体系，以25μL总体积反应体系计，包括2×One Step RT-PCRBuffer III 12.5μL，5U Takara Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，浓度分别为0.4μmol/L的PEDV-F、PEDV-R、TGEV-F、TGEV-R各0.8μL，浓度分别为0.3μmol/LPDCoV-F、PDCoV-R各0.6μL，浓度分别为0.15μmol/L的PEDV-probe和TGEV-probe各0.3μL，浓度为0.1μmol/L PDCoV-probe 0.2μL，模板1μL、无核酶水加至25μL。本发明采用25μL反应体系，上下游引物的浓度按照0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L 5个浓度的反应体系进行扩增，得到扩增曲线，优化上下游引物浓度。探针浓度按照0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.15μmol/L、0.2μmol/L、0.25μmol/L、0.3μmol/L 6个浓度梯度的反应体系进行扩增，得到扩增曲线，优化探针浓度。最终确定PEDV、TGEV和PDCoV上下游引物浓度分别为0.4μmol/L、0.4μmol/L、0.3μmol/L时，p-PEDV-TGEV-PDCoV阳性对照质粒的扩增效率最高，Ct值最低。所以上下游引物的最佳浓度PEDV和TGEV为0.4umol/L，PDCoV为0.3umol/L。依据最低的Ct值，探针的最佳浓度为PEDV和TGEV为0.15μmol/L，PDCoV为0.1μmol/L。
本发明提供了一种非诊断目的同时检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪丁型冠状病毒的三重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，使用所述引物组，或所述试剂盒，或所述检测体系进行PCR扩增，收集荧光信号；根据机器测算的荧光信号及Ct值判断样品中是否有PEDV、TGEV、PDCoV荧光信号，Ct＞35判定可疑，需重检。
在本发明中，所述反应程序如下：荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：ROX，通道3：CY5；反应条件为：42℃、5min，95℃、10s；95℃、5s，50.5℃、30s，35℃、30s，扩增35～40个循环。在本发明中，通过对不同退火温度(Tm)扩增曲线的Ct值进行比较，结果如图1所示，50.5℃时的猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎及猪丁型冠状病毒扩增的效果最佳，因此，退火温度50.5℃是p-PEDV-TGEV-PDCoV阳性对照质粒扩增的最佳退火温度。
本发明中所用的试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均为无DNA酶污染的容器分装。荧光定量PCR仪(天隆Gentier 96R)，紫外分光光度计(BioTek)等仪器均由本实验室提供。本发明使用的仪器为One Step TB
Figure BDA0003888687270000072
PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)，购自TaKaRa(CatNo.RR066A)。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1特异性引物和探针设计
根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒M基因，猪传染性胃肠炎病毒S基因及猪丁型冠状病毒M基因序列，针对其保守区域设计三对特异性引物，三条特异性探针。引物和探针具体序列如表1所示。
表1荧光定量PCR引物和探针序列
Figure BDA0003888687270000071
注：红色标注碱基Y、R、V均为简并碱基，其中Y为C/T；R为A/G；V为G/A/C。
实施例2三重荧光定量PCR试剂盒
1.一种同时检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR试剂盒，包括以下组分：
(1)实施例1中所述引物组；
(2)阳性对照质粒p-PEDV-TGEV-PDCoV由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具体包括如下步骤：将NCBI GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒M基因，猪传染性胃肠炎病毒S基因及猪丁型冠状病毒M基因部分序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成串联基因片段，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。将串联基因片段插入至pUC57载体的SmalⅠ位点，获得重组质粒并命名为p-PEDV-TGEV-PDCoV。
(3)阴性对照为pUC57空载体；
(4)2×One Step RT-PCR BufferIII、5U/μL Takara Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix II、无核酶水反应试剂。
实施例3三重荧光定量PCR检测方法
1.供试核酸：
将NCBI GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒M基因，猪传染性胃肠炎病毒S基因及猪丁型冠状病毒M基因部分序列送生工生物工程(上海)股份有限公司合成串联基因片段，命名为p-PEDV-TGEV-PDCoV。
其它核酸模板：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪轮状病毒(PoRV)均采购自市场上的商品化疫苗，猪急性腹泻综合征冠状病毒核酸为本研究室保存。
2.病毒核酸提取
按照病毒核酸提取试剂盒(Magen(美基)生物，R4410-03)操作说明，提取SADS、PRV、PoRV、PRRSV和PCV2的病毒基因组核酸，作为模板。
阳性对照质粒p-PEDV-TGEV-PDCoV由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。测序结果与GenBank序列比对无误后，采用全自动紫外分光光度计测定质粒的浓度和纯度。
3.PCR反应体系及扩增条件
反应条件为：42℃、5min，95℃、10s；95℃、5s，50.5℃、30s，35℃、30s，扩增40个循环。
表2 Real-time PCR反应体系
Figure BDA0003888687270000081
Figure BDA0003888687270000091
4.标准曲线的建立
试验步骤：将测定浓度和纯度后的重组质粒p-PEDV-TGEV-PDCoV为标准阳性质粒分别做10倍的倍比稀释，得到2.19×107～2.19×102copies/μL共6个稀释度的重组质粒作为标准品模板，每个模板浓度作3个平行样。根据步骤3建立的荧光定量PCR的反应体系和反应参数进行荧光定量PCR扩增，获得荧光扩增曲线并绘制标准曲线。通过观察扩增曲线来确定检测到重组质粒的最低拷贝数，并最终以Ct值为纵坐标，拷贝数的对数为横坐标，建立标准曲线，对整个PCR体系的灵敏性进行评价。
根据图4可知，p-PEDV-TGEV-PDCoV阳性对照质粒10倍稀释为2.19×102～2.19×107copies/μL共6个稀释度，进行三重荧光定量PCR扩增，获得了扩增曲线，标准曲线的浓度在2.19×102～2.19×107copies/μL范围内PEDV、TGEV和PDCoV具有很好的相关性，线性方程式分别为y＝-3.4883x+35.031，R2＝0.9983，y＝-3.5446x+35.359，R2＝0.9978，y＝-3.5126x+35.141，R2＝0.9986，绘制标准曲线。
5.灵敏性试验
将测定浓度和纯度后的重组质粒p-PEDV-TGEV-PDCoV为标准阳性质粒分别做10倍的倍比稀释，得到2.19×107～0.219×100copies/μL共9个稀释度的重组质粒作为标准品模板，每个模板浓度作3个平行样。根据步骤3中建立的荧光定量PCR的反应体系和反应参数进行荧光定量PCR扩增，对整个PCR体系的灵敏性进行评价。
检测结果如图5显示：p-PEDV-TGEV-PDCoV阳性对照质粒10倍稀释为0.219×100～2.19×107copies/μL共9个稀释度，进行三重荧光定量PCR扩增，各基因的扩增曲线呈现较为典型的S型，各曲线间距均匀。基于猪流行性腹泻病毒M基因，猪传染性胃肠炎病毒S基因及猪德尔塔冠状病毒M基因的最低检测量均为2.19个拷贝。
6.特异性检测
采用步骤3建立的荧光定量PCR反应体系和反应参数，以p-PEDV-TGEV-PDCoV的重组质粒DNA作为标准的阳性对照。PRRSV、PRV、PoRV、SADS、PCV2基因组模板作为其它毒株模板，无菌水作为阴性对照；使用天隆Gentier 96R荧光定量PCR仪进行扩增，以验证所建立方法的特异性。
结果如图6所示，对PRRSV、PRV、PoRV、SADS、PCV2的基因组核酸和p-PEDV-TGEV-PDCoV阳性重组质粒同时进行荧光定量PCR检测，只有p-PEDV-TGEV-PDCoV阳性重组质粒可产生特异性荧光曲线，其余均为阴性，证明该方法特异性较好。
7.重复性检测
采用2.19×106拷贝的阳性质粒p-PEDV-TGEV-PDCoV为模板，按步骤3进行荧光定量PCR试验，重复检测三次分析其稳定性。
如图7所示，PEDV、TGEV和PDCoV三次重复性扩增曲线检测结果基本一致，在相同位置均可观察到相对应的荧光曲线，说明锁核酸探针荧光定量PCR方法重复性良好。
实施例4临床样品的检测
采用实施例3中建立的三重荧光定量PCR检测方法对102份送检样品(肛拭子、腹泻粪便样品及肠组织)进行检测，包括如下步骤：
(1)提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，使用实施例2的试剂盒中的三对qPCR引物、相应的TaqMan探针及反应液进行检测：将所述的三对qPCR引物、相应的TaqMan探针及反应液置于qPCR反应体系中，按照步骤3中进行PCR扩增，收集荧光信号；
(2)根据机器测算的荧光信号及Ct值判断样品中是否有PEDV(CY5)、TGEV(ROX)、PDCoV(FAM)。即Ct值≤35，判定为阳性，Ct值＞35判定可疑，需重检。
临床样品的检测结果显示，PEDV为临床腹泻样品的主要病原(90/102)，TGEV(3/102)和PDCoV(4/102)偶有感染，PEDV+TGEV(2/102)、TGEV+PDCoV(2/102)和PEDV+TGEV+PDCoV(1/102)的多重感染也有发生。
表3临床样品的检测结果
Figure BDA0003888687270000111
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR引物组，其特征在于：包括用于检测猪流行性腹泻病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PEDV-F如SEQ ID NO.1所示；
PEDV-R如SEQ ID NO.2所示；
PEDV-probe如SEQ ID NO.3所示；
用于检测猪传染性胃肠炎病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
TGEV-F如SEQ ID NO.4所示；
TGEV-R如SEQ ID NO.5所示；
TGEV-probe如SEQ ID NO.6所示；
用于检测猪丁型冠状病毒的引物及TaqMan探针的核苷酸序列如下：
PDCoV-F如SEQ ID NO.7所示；
PDCoV-R如SEQ ID NO.8所示；
PDCoV-probe如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的5’端分别修饰不同的荧光基团，3’端分别修饰不同的淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述荧光基团为CY5、ROX和FAM，所述淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
4.一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1～3任意一项所述引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括热启动Taq DNA聚合酶、反转录酶、无酶水、PCR反应液、配套Buffer、对照品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述对照品包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为带有猪流行性腹泻病毒M基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因和猪丁型冠状病毒M串联基因片段的阳性重组质粒标准品模板，所述阴性对照为pUC57空载体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述串联基因片段的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。
8.一种检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR检测体系，其特征在于，以25μL总体积反应体系计，包括2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL，5UTakara Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，浓度分别为0.4μmol/L的PEDV-F、PEDV-R、TGEV-F、TGEV-R各0.8μL，浓度分别为0.3μmol/LPDCoV-F、PDCoV-R各0.6μL，浓度分别为0.15μmol/L的PEDV-probe和TGEV-probe各0.3μL，浓度为0.1μmol/LPDCoV-probe 0.2μL，模板1μL、无核酶水加至25μL。
9.一种非诊断目的检测猪流行性腹泻、传染性胃肠炎和丁型冠状病毒的三重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取肛拭子样品、腹泻粪便样品或消化道组织的总RNA，使用权利要求1～3任意一项所述引物组，或权利要求4～7任意一项所述试剂盒，或权利要求8所述检测体系进行PCR扩增，收集荧光信号；根据机器测算的荧光信号及Ct值判断样品中是否有PEDV、TGEV、PDCoV荧光信号，Ct＞35判定可疑，需重检。
10.根据权利要求9所述的非诊断目的检测方法，其特征在于，所述反应程序如下：荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：ROX，通道3：CY5；反应条件为：42℃、5min，95℃、10s；95℃、5s，50.5℃、30s，35℃、30s，扩增35～40个循环。
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