CN116064939A - 同时检测pcv3、prv、ppv的多重荧光定量专用引物组及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的多重荧光定量专用引物组，其中，猪圆环病毒III型的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，猪圆环病毒III型的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，猪伪狂犬病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，猪伪狂犬病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，猪细小病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，猪细小病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。本发明还提供了能够同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂盒及其用途。本发明能够同时灵敏、准确检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒。

Description

同时检测PCV3、PRV、PPV的多重荧光定量专用引物组及试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种同时检测PCV3(猪圆环病毒III型)、PRV(猪伪狂犬病毒)、PPV(猪细小病毒)的多重荧光定量专用引物组及试剂盒，以及同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的方法。
背景技术
我国是世界养猪第一大国，近年来随着我国养猪业规模化和集约化发展，猪繁殖障碍性疾病成为猪场常见疾病之一，而引起这类疾病的病因较为复杂，一般可能由多病原混合感染等因素造成的。由于临床上较难控制，治疗效果也不佳，从而导致猪群整体生长缓慢、母猪不孕不育、妊娠母猪流产、早产、产死胎或木乃伊胎等临床症状，给养猪户造成了严重的经济损失。
值得注意的是猪圆环病毒III型(PCV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的几种主要病原。由于这几种病原在临床上呈现出相似的临床症状，又常常发生混合感染，常规的诊断方法很难将此症状相似的一类疾病加以区分，因此建立快速、准确的检测方法非常有必要。目前现有的荧光定量PCR检测方法有荧光染料和荧光探针两种，其中，荧光探针特异性较好但成本相对较高，荧光染料(SYBRGreen I)法成本相对较低，但对引物特异性要求较高，容易引起非特异扩增造成假阳性等。
发明内容
针对以上要解决的技术问题，本发明的一个目的是提供一种能够同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的多重荧光定量专用引物组。
本发明的第二个目的是提供一种能够同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂盒。
本发明的第三个目的是提供一种同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的方法。
为了实现以上发明目的，本发明提供了一种能够同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的多重荧光定量专用引物组，其中，所述引物组的核苷酸序列如SEQID NO：1至SEQ ID NO：6所示，其中，猪圆环病毒III型的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，猪圆环病毒III型的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，猪伪狂犬病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，猪伪狂犬病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，猪细小病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，猪细小病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
另一方面，本发明还提供了一种能够同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂盒，其包括根据本发明的多重荧光定量专用引物组。即，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示，其中，猪圆环病毒III型的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，猪圆环病毒III型的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，猪伪狂犬病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，猪伪狂犬病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，猪细小病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，猪细小病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
优选地，除了上述多重荧光定量专用引物组之外，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应液、猪伪狂犬病毒阳性标准品、猪细小病毒阳性标准品、猪圆环病毒III型阳性标准品和阴性对照。更优选地，所述阴性对照为DEPC水。更优选地，所述引物组中各引物的浓度均为10μM。
另一方面，本发明还提供了根据权利要求1所述的多重荧光定量专用引物组用于制备同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂和/或试剂盒的用途。
另一方面，本发明还提供了一种能够同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的方法，其包括以下步骤：
步骤一、提取猪临床样本总DNA，制备待检测样品；
步骤二、配制含有权利要求1所述的引物组的实时荧光定量PCR反应体系，同时设阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组；
步骤三、将待检测样品、阴性对照及阳性对照进行实时荧光定量PCR扩增，查看熔解曲线峰值；
步骤四、对待检测样品的多重荧光定量PCR结果进行判定和有效性分析。
优选地，根据本发明的方法，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃ 30s；95℃5s，65℃ 35s，40个循环，65℃采集荧光信号，熔解曲线分析从65℃到95℃。
优选地，根据本发明的方法，所述实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包括猪细小病毒正向引物0.4μL、猪细小病毒反向引物0.4μL、猪圆环病毒III型正向引物0.6μL、猪圆环病毒III型反向引物0.6μL、猪伪狂犬病毒正向引物1.2μL、猪伪狂犬病毒反向引物1.2μL、猪细小病毒DNA模板1μL、猪圆环病毒III型DNA模板1μL、猪伪狂犬病毒DNA模板1μL、DEPC水补足20μL。
优选地，根据本发明的方法，所述步骤四包括：根据猪圆环病毒III型扩增片段的Tm值变化范围(79.5-80℃)、猪细小病毒扩增片段的Tm值变化范围(84-84.3℃)与猪伪狂犬病毒扩增片段的Tm值变化范围(90-90.4℃)的差异，借此利用熔解曲线的三个特异性的峰值对这三种病毒进行鉴别。
优选地，根据本发明的方法，所述步骤四还包括：根据荧光定量熔解曲线峰判定结果的有效性；如果阳性对照组出现相应的熔解曲线峰，而阴性对照组未出现相应的熔解曲线峰，则结果有效，否则结果无效，需要再次进行检测。
优选地，所述步骤四中，对待检测样品的结果判定方式如下：
当待检测样品出现至少一个与阳性对照组相对应的熔解曲线峰，表明待检测样品中存在至少一种相关病毒的感染；
当待检测样品未出现与阳性对照组相对应的熔解曲线峰，则表明样品中无三种相关病毒感染。
本发明根据PPV NS1基因序列、PRV gE基因序列和PCV3 Cap基因序列，分别在各基因序列的保守区设计特异引物，运用SYBR Green I染料法发明了能够同时检测PPV、PRV和PCV3的三重荧光定量PCR检测方案，相比于现有技术，定量PCR通过分析收集反应中的荧光信号后对检测结果判定，可避免核酸电泳的污染也节省检测时间。与PCR相比，定量PCR提高了灵敏度，改善了易用性，加快了工作效率。三重荧光定量PCR检测可用作PRV、PPV和PCV3的单一检测，或组合使用，这使其更适合于临床样本检测，而不影响结果的质量，能够更快速、更准确地对临床样品进行检测。
附图说明
图1是根据本发明的同时检测猪圆环病毒III型(PCV3)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的试剂盒的示意图。
图2是PCV3的标准曲线结果。
图3是PRV的标准曲线结果。
图4是PPV的标准曲线结果。
图5是PRV的熔解曲线峰图。
图6是PPV的熔解曲线峰图。
图7是PCV3的熔解曲线峰图。
图8是三重荧光定量PCR敏感性检测结果。
图9是PRV敏感性检测结果。
图10是PPV敏感性检测结果。
图11是PCV3敏感性检测结果。
图12是三重荧光定量PCR特异性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
如图1所示，根据本发明的同时检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒III型的荧光定量试剂盒由荧光定量PCR反应液、专用引物组(包括分别PRV、PPV、PCV3特异性引物)、PRV阳性标准品、PPV阳性标准品、PCV3阳性标准品和阴性对照组成。
其中，荧光定量PCR反应液为TaKaRa的TB Green Mix(RR820A)共3管标记为△，PRV正向引物1管标记为○，反向引物1管标记为●，PPV正向引物1管标记为□，反向引物1管标记为■，PCV3正向引物1管标记为☆，反向引物1管标记为★，PRV阳性标准品标记为1，PPV阳性标准品标记为2，PCV3阳性标准品标记为3，阴性对照为DEPC水，标记为4。各PRV、PPV、PCV3特异性引物的浓度均为10μM。
1.引物设计
根据Gen Bank登录的PPV序列(Gen Bank：AY502114.1)NS1基因序列、PRV序列(GenBank：KP257591)gE基因序列、PCV3序列(Gen Bank：MG868940.1)Cap基因序列，分别设计其特异性引物(见表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。
表1：各病毒特异性引物
Figure BDA0003814753320000051
2.引物设计重组质粒的制备
采集猪临床血液组织样本共50份，其中在广东地区采集全血3份，组织病料47份。将含青霉素和链霉素各1000IU/mL的PBS(pH7.4)加入样本中，涡旋震荡混匀，置于-20℃或-80℃冰箱，反复冻融3次后，用AxyGen公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(AP-MN-BF-VNA-250)说明书步骤操作提取病毒基因组DNA。
利用上述特异性引物以及利用TaKaRa公司的PCR试剂(RR902A)对提取的病毒基因组DNA模板进行PCR扩增。扩增体系为25μL，扩增条件为95℃5min，98℃10s、60℃30s、72℃20s，35个循环，72℃延伸10min。
PCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳后，按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒使用说明书对PCR产物纯化回收，并与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，接种于氨苄抗性的LB平板上；37℃培养过夜后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，对PCR检测结果呈阳性的菌液提取质粒并鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送公司测序。
3.反应条件优化及标准曲线的建立
将送测鉴定为阳性的重组质粒用微量分光光度计测定浓度，进行10倍梯度稀释，PPV质粒模板拷贝数为3.67×109-3.67copies/μL，PRV质粒模板拷贝数为1.87×109-1.87copies/μL，PCV3质粒模板拷贝数为3.07×109-3.07copies/μL，进行荧光定量标准曲线的构建。
荧光定量PCR反应液由TaKaRa公司TB
Figure BDA0003814753320000052
Premix Ex Taq II试剂盒(RR820A)提供，反应体系20μL：2×TB Green Mix 10μL，上下游引物各0.8μL，DEPC水7.4μL，模板1μL。
使用AriaMx荧光定量PCR仪，反应程序为：95℃30s；95℃5s，65℃35s，40个循环；65℃采集荧光信号，熔解曲线分析从65℃到95℃。
4.PRV、PPV、PCV3多重荧光定量PCR的反应体系及反应程序
多重荧光定量PCR的反应体系：2×TB Green Mix 10μL，PPV上下游引物各0.4μL，PRV上下游引物各1.2μL，PCV3上下游引物各0.6μL，PPV模板DNA1 μL，PCV3模板DNA 1μL，PRV模板DNA 1μL，DEPC水4.6μL，共20μL。
使用AriaMx荧光定量PCR仪，反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 35s，40个循环，65℃采集荧光信号，熔解曲线分析从65℃到95℃。
结果如图2至图7所示。
参见图2，PRV标准曲线结果显示，标准品浓度与标准曲线产生的Ct值具有良好的线性关系，相关系数为0.998，扩增效率为102.05％(R2>0.99)(图2，B)。参见图3，PPV标准曲线结果显示，标准品浓度与标准曲线产生的Ct值具有良好的线性关系，相关系数为0.999，扩增效率为108.99％(R2>0.99)(图3，B)。参见图4，PCV3标准曲线结果显示，标准品浓度与标准曲线产生的Ct值具有良好的线性关系，相关系数为0.995，扩增效率为110.61％(R2>0.99)(图4，B)。
如图5至图7所示，PRV、PPV和PCV3熔解曲线Tm值分别为90-90.4℃(例如，90℃)、84-84.3℃(例如，84℃)和79.5-80℃(例如，80℃)，熔解曲线均显示为单一特异性峰，表面没有二聚体和非特异性扩增。
根据猪圆环病毒III型扩增片段的Tm值变化范围79.5-80℃、猪细小病毒扩增片段的Tm值变化范围84-84.3℃与猪伪狂犬病毒扩增片段的Tm值变化范围90-90.4℃的差异，借此利用熔解曲线的三个特异性的峰值对这三种病毒进行鉴别。
5.灵敏度检测
选择拷贝数稀释梯度为107-101copies/μL的3种病毒标准品质粒进行SYBR GreenI荧光定量PCR扩增，验证该方法能够检测出标准质粒的最小拷贝数，同时将同一稀释梯度的3种病毒的标准品质粒按108-102copies/μL混合，以验证该方法能够同时检出标准质粒的最小拷贝数(灵敏度检测中混合质粒标准品在荧光反应体系中同一稀释梯度的标准品模板PCV3为0.5μL，PPV为0.5μL，PRV为1μL)。
三重实时荧光定量PCR反应体系共20μL：2×TB Green Mix 10μL，PPV正向引物0.4μL，PPV反向引物0.4μL，PCV3正向引物0.6μL，PCV3反向引物0.6μL，PRV正向引物1.2μL，PRV反向引物1.2μL，PPV模板DNA1μL，PCV3模板DNA 1μL，PRV模板DNA 1μL，DEPC水补足20μL。
使用AriaMx荧光定量PCR仪，反应程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，65℃ 35s，40个循环；65℃采集荧光信号，熔解曲线分析从65℃到95℃。
根据猪圆环病毒III型扩增片段的Tm值变化范围79.5-80℃、猪细小病毒扩增片段的Tm值变化范围84-84.3℃与猪伪狂犬病毒扩增片段的Tm值变化范围90-90.4℃的差异，利用熔解曲线的三个特异性的峰值对这三种病毒进行鉴别。
如图8所示，为三重荧光定量PCR敏感性检测结果，其中，曲线从左到右对应质粒稀释拷贝梯度依次为108、107、106、105、104、103、102。可见，将PRV、PPV和PCV3质粒标准品浓度梯度为108copies/μL-102copies/μL的同一拷贝稀释梯度的PRV、PPV和PCV3的标准品质粒混合，荧光定量PCR同时检测下限为1000copies/μL，即PRV 1870copies/μL、PPV 1835copies/μL和PCV3 1535copies/μL。
如图9所示，为PRV敏感性检测结果，其中，PRV三重荧光定量PCR敏感性结果，曲线从左到右为4.67×106-4.67copies/μL。可见，PRV在三重荧光定量PCR体系下敏感性试验结果显示检测下限可达46.7copies/μL。
如图10所示，为PPV敏感性检测结果，其中，PPV三重荧光定量PCR敏感性结果，曲线从左到右为3.67×107-36.7copies/μL。可见，PPV在三重荧光定量PCR体系下敏感性试验结果显示检测下限可达367copies/μL。
如图11所示，为PCV3敏感性检测结果，其中，PCV3三重荧光定量PCR敏感性结果，曲线从左到右为3.07×107-30.7copies/μL。可见，PCV3在三重荧光定量PCR体系下敏感性试验结果显示检测下限可达307copies/μL(图9)。
6.特异性检测
猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒及猪圆环病毒Ⅱ型和Ⅲ型阳性临床样本均由佛山科学技术学院预防兽医学实验室保存。提取上述病毒核酸做为模板，DEPC水为阴性对照，进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测，验证引物特异性。实时荧光定量PCR的反应体系及反应程序与上述“灵敏度检测”中所述的相同。
结果如图12所示，只有加入PRV、PPV、PCV3模板时，出现了特异性熔解曲线峰；由于阴性、PCV2、CSFV、PRRSV出现了非特异性熔解曲线峰，但仍可与PPV、PCV3和PRV特异性熔解曲线峰区分判定。
7.重复性检测
选择拷贝稀释梯度为108、106、104的3种病毒质粒标准品进行重复性验证，进行组内和组间实验，每个模板分别做3次不同批次的试验，来计算平均周期阈值、标准差(SD)和变异系数(CV)。实时荧光定量PCR的反应体系及反应程序与上述“灵敏度检测”中所述的相同。
结果如以下表2所示，组间变异系数为0.62％-1.44％，组内变异系数为0.63％-0.97％，表明该方法具有良好的重复性。
表2：多重实时荧光定量PCR重复性结果
Figure BDA0003814753320000081
8.临床样本检测
利用本发明上述的三重荧光定量PCR方法，对采集的广东省猪临床血液组织样本50份，其中全血3份，组织病料47份。将50份临床样本进行PPV、PRV、PCV3这3种病毒的检测。该三重荧光定量PCR方法的反应体系及反应程序与上述第4部分“PRV、PPV、PCV3多重荧光定量PCR的反应体系及反应程序”中所述的相同。
对待检测样品的结果判定方式如下：
当待检测样品组出现至少一个与阳性对照组相对应的熔解曲线峰，表明待检测样品中存在至少一种相关病毒的感染；当待检测样品未出现与阳性对照组相对应的熔解曲线峰，则表明样品中无三种相关病毒感染。
此外，可以对待检测样品的多重荧光定量PCR结果进行判定和有效性分析。
有效性分析步骤包括：根据荧光定量熔解曲线峰判定结果的有效性；如果阳性对照组出现相应的熔解曲线峰，而阴性对照组未出现相应的熔解曲线峰，则结果有效，否则结果无效，需要再次进行检测。
根据猪圆环病毒III型扩增片段的Tm值变化范围79.5-80℃、猪细小病毒扩增片段的Tm值变化范围84-84.3℃与猪伪狂犬病毒扩增片段的Tm值变化范围90-90.4℃的差异，借此利用熔解曲线的三个特异性的峰值对这三种病毒进行鉴别。
结果显示，PCV3、PPV和PRV均有检出，其中PRV的阳性率为18％(9/50)，PPV的阳性率为18％(9/50)，PCV3的阳性率为8％(4/46)，存在多种病毒混合感染情况(即，在同一份生物样本中检测出同时存在以上三种病毒或同时存在其中两种病毒)。所检测的样品与分别单独用伪狂犬病病毒染料法荧光定量PCR试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)、猪细小病毒染料法荧光定量PCR试剂盒(上海邦景实业有限公司)及猪圆环病毒III型染料法荧光定量PCR试剂盒(上海邦景实业有限公司)检测相比，符合率如表3所示。
表3：三重与单重荧光定量PCR对临床样品检测结果及符合率
Figure BDA0003814753320000091
由此可见，本发明构建的三重荧光定量PCR检测方法与单重检测试剂盒检测方法相比，符合率为100％，表明本发明的方法能够准确检测出PPV、PRV、PCV3这三种病毒。此外，本发明的方法能够在一份样品中同时检测出这三种病毒中的一种、两种或三种，更节省了检测时间和工作量，提高检测效率，降低检测成本，可应用于对临床样品大规模检测，有利于疫病防控。

Claims (10)

1.一种同时检测PCV3、PRV、PPV的多重荧光定量专用引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6所示，其中，猪圆环病毒III型的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，猪圆环病毒III型的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，猪伪狂犬病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，猪伪狂犬病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，猪细小病毒的正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，猪细小病毒的反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.一种同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂盒，其包括权利要求1所述的多重荧光定量专用引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括实时荧光定量PCR反应液、猪伪狂犬病毒阳性标准品、猪细小病毒阳性标准品、猪圆环病毒III型阳性标准品和阴性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为DEPC水。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中各引物的浓度均为10μM。
6.权利要求1所述的多重荧光定量专用引物组用于制备同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的试剂和/或试剂盒的用途。
7.一种同时检测猪圆环病毒III型、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的方法，其包括以下步骤：
步骤一、提取猪临床样本总DNA，制备待检测样品；
步骤二、配制含有权利要求1所述的引物组的实时荧光定量PCR反应体系，同时设阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组；
步骤三、将待检测样品、阴性对照及阳性对照进行实时荧光定量PCR扩增，查看熔解曲线峰值；
步骤四、对待检测样品的多重荧光定量PCR结果进行判定和有效性分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃30s；95℃5s，65℃35s，40个循环，65℃采集荧光信号，熔解曲线分析从65℃到95℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包括猪细小病毒正向引物0.4μL、猪细小病毒反向引物0.4μL、猪圆环病毒III型正向引物0.6μL、猪圆环病毒III型反向引物0.6μL、猪伪狂犬病毒正向引物1.2μL、猪伪狂犬病毒反向引物1.2μL、猪细小病毒DNA模板1μL、猪圆环病毒III型DNA模板1μL、猪伪狂犬病毒DNA模板1μL、DEPC水补足20μL。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤四包括：根据猪圆环病毒III型扩增片段的Tm值变化范围79.5-80℃、猪细小病毒扩增片段的Tm值变化范围84-84.3℃与猪伪狂犬病毒扩增片段的Tm值变化范围90-90.4℃的差异，借此利用熔解曲线的三个特异性的峰值对这三种病毒进行鉴别。
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