CN104962663A - 一种猪捷申病毒通用型荧光定量rt-pcr检测方法 - Google Patents

一种猪捷申病毒通用型荧光定量rt-pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪捷申病毒通用型荧光定量RT-PCR检测方法，包括下述步骤：1)样品处理：取组织样品、粪便样品或液体样品，提取核酸；2)设计如下引物：上游引物PTVF：如SEQ ID NO.1所示序列或其互补链；下游引物PTVR：如SEQ ID NO.2所示序列或其互补链；3)采用步骤2)的引物进行荧光定量RT-PCR检测；4)结果判定：根据扩增的曲线、Ct值和融解温度确定检测阳性和阴性。此外，本发明还公开了该方法的检测用引物。该方法敏感性、特异性良好，通用性强，检测成本低廉，性价比高，适用于临床样品猪捷申病毒的快速检测。

Description

一种猪捷申病毒通用型荧光定量RT-PCR检测方法
技术领域
本发明涉及动物疫病分子检测领域，具体涉及一种猪捷申病毒的检测方法，尤其涉及一种猪捷申病毒通用型荧光定量RT-PCR检测方法。此外，本发明还涉及检测猪捷申病毒的引物。
背景技术
猪捷申病毒(Porcine Teschovirus，PTV)是小RNA病毒科(Picornaviridae)捷申病毒属(Teschovirus)的成员，该病毒有13个血清型，在工业化猪场广泛存在，不同的血清型会引起猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、腹泻、心包炎和心肌炎等临床疾病，其中以1型病毒引起的高致病性、高死亡率的脑脊髓炎最为严重。该病毒可同其他病毒混合感染，协同作用，给养猪业造成巨大的经济损失。因此，对猪群中病毒感染情况的检测，是疫病预防控制、消除猪群间相互感染的重要措施。本发明利用Genbank中1～13型猪捷申病毒的全基因组，设计一套通用型的引物，达到快速准确检测捷申病毒的目的。
目前，对捷申病毒的检测手段，主要是病毒分离鉴定和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。病毒分离鉴定是疫病诊断的经典基础方法，但也是最耗时的检测手段，对于突发疫病的早期快速诊断无能为力，会延误疫病确诊和控制的时机。分子生物学的检测方法已受到日益重视，RT-PCR已成为疫病诊断实验室的常规检测技术。特别是实时荧光定量PCR的出现，对于病原的检测，大大提高了检测方法的敏感性和特异性，实现了快速、精准和可视化，同时实现了从定性到定量的飞跃。
在本发明之前，还没有出现涉及基于SYBR染料的猪捷申病毒荧光定量RT-PCR检测方法的公开报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通用型的高效、快速的猪捷申病毒荧光定量RT-PCR检测方法，可用于口岸动物检疫实验室、各级兽医诊断实验室以及企业。为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供的是一种基于SYBR Green I实时荧光定量的通用型RT-PCR方法来检测猪捷申病毒，包括下述操作步骤：
1)样品处理：取组织样品、粪便样品或液体样品，提取核酸；
2)设计引物，该引物序列为：
上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)或其互补链；
下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)或其互补链；
3)采用步骤2)设计的引物进行荧光定量RT-PCR检测；
4)结果判定：根据扩增的曲线、Ct值和融解温度确定检测阳性和阴性。
作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述组织样品处理步骤具体为：无菌取组织样品，加入灭菌PBS，匀浆，取匀浆液提取核酸或-20℃保存备用；所述粪便样品处理步骤具体为：取粪便，加入灭菌PBS，涡旋混匀，离心，取上清提取核酸；所述液体样品处理步骤具体为：取液体样品(例如血清等)直接进行核酸提取。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应体系为20μL，包括：2倍RT-PCR缓冲液10μL，反应酶混合物0.8μL，ROX参比染料II 0.4μL，无RNase水5.2μL，同时加入步骤2)设计的10μmol/L浓度上下游引物各0.8μL和RNA模板2μL。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应体系在ABI7500或ViiA7荧光PCR检测系统进行。
作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应条件为：
阶段1为反转录反应：42℃5min，95℃10sec；
阶段II为PCR反应：95℃5sec,56℃10sec，72℃30sec，72℃收集荧光，45个循环；
阶段III为融解曲线分析：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，ABI仪器自动生成。
作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，结果判定具体为：出现扩增曲线，Ct值小于38个循环且融解温度为86.7±0.17℃范围内判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测猪捷申病毒的引物，其序列为：
上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)或其互补链；
下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)或其互补链。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明一种通用型猪捷申病毒荧光RT-PCR检测方法，基于SYBR染料的通用型猪捷申病毒荧光PCR检测方法国内外尚未有报道。该方法敏感性、特异性良好，通用性强，检测成本低廉，性价比高，检测灵敏度可达到12copies/μL，检测时间在100min内，适用于临床样品猪捷申病毒的快速检测。
附图说明
图1是本发明实施例5中质粒标准品扩增的标准曲线。
图2是本发明实施例5中质粒标准品的扩增曲线。
图3是本发明实施例6中用质粒标准品进行10×梯度稀释后的扩增曲线。
图4是本发明实施例6中由图3系列稀释扩增后的融解曲线。
图5是本发明实施例6中猪捷申病毒SYBR荧光RT-PCR方法特异性验证的结果示意图。
图6是图5的特异性验证试验的融解曲线。
图7是本发明实施例7中临床样品检测时的融解曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
本发明实施例中的分子检测试剂、RNA提取试剂均为商品化试剂，特异性检测对照用病毒为市售商品化疫苗或实验室常用参考毒株。
实施例1引物设计：
登陆GenBank数据库，获取数据库内全部的1～13型猪捷申病毒的全基因组序列，利用Bioedit软件的Clustal W程序，进行全基因组序列比对，筛选该病毒基因组的保守片段，借助Beacon Designer软件进行引物设计和评估筛选，最后利用GenBank的BLAST功能对引物的特异性进行筛选。引物由英维捷基(上海)有限公司合成。
上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；
下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；PTVF/PTVR预期扩增片段大小为384bp。
实施例2样品处理及核酸提取：
1、样品处理：
组织样品：无菌取组织样品5g，加入10mL灭菌PBS，匀浆。取1.5mL匀浆液提取核酸或-20℃保存备用。
粪便样品：取1g粪便，加入3mL灭菌PBS，涡旋混匀，2000g离心5min，取上清提取核酸。
其他液体样本，如血清等，直接用于核酸提取。
2、核酸提取：
采用自动化磁珠核酸提取仪(Thermofisher kingfisher)或RNA提取试剂盒(Qiagen)提取RNA，获得RNA直接上机检测或保存在-80℃备用。
实施例3荧光定量RT-PCR检测
1、反应体系
采用商品化的宝生物(大连)有限公司的一步法SYBR荧光定量RT-PCR试剂盒，根据试剂盒说明书进行反应体系的配制，以20μL体系为例，其中2倍RT-PCR缓冲液10μL，反应酶混合物0.8μL，ROX参比染料II 0.4μL，无RNase水5.2μL，10μmol/L浓度引物各0.8μL，RNA模板2μL。该荧光定量RT-PCR检测的反应体系在ABI 7500或ViiA7荧光PCR检测系统进行，均可获得良好扩增。
2、反应条件
阶段1(反转录反应)：42℃5min，95℃10sec；
阶段II(PCR反应)：95℃5sec，56℃10sec，72℃30sec，72℃收集荧光，45个循环；
阶段III(融解曲线分析)：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，ABI仪器可自动生成该步骤。
实施例4标准质粒的制备
按RNA提取试剂盒说明书操作步骤提取猪捷申病毒基因组RNA。在PCR反应管内加入Ex Premix 15μL，10μmol/L上下游引物PTV F/PTVR各2μL，RNase Free Water 9μL，捷申病毒cDNA模板2μL，将PCR管置PCR仪中，按下列程序进行目的基因扩增：94℃3min；94℃15sec，55℃15sec，72℃30sec，共35个循环；72℃延伸7min。反应结束后取5μL PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将特异性的PCR产物用基因回收试剂盒(天根生化)回收。
将回收纯化的PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化至DH5α感受态大肠杆菌，氨苄抗性和蓝白斑筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种到LB培养基振荡过夜培养，提取质粒，经PCR鉴定带有目的基因后，将重组质粒测序鉴定。鉴定正确的阳性质粒作为标准质粒，-20℃保存备用。
实施例5标准曲线绘制和融解曲线确定
将实施例4制得的标准质粒，用紫外分光光度计测定该质粒的OD260nm值，根据OD260nm值计算质粒浓度，换算为拷贝数，然后用蒸馏水将该阳性质粒进行10倍梯度稀释。以103、104、105、106、107倍5个稀释度的质粒溶液作为模板，每个稀释度做三个重复，应用ABI ViiA7荧光定量PCR仪扩增检测。PCR反应体系为20μL，依次加入SYBR Premix ExTaq 10μL，PTVF、PTVR(引物(10μmol/L)各1μL，ROX Reference Dye II(50x)0.4μL，cDNA模板2μL，用灭菌蒸馏水补至20μL。反应条件为：94℃2min，94℃5s，56℃10s，72℃30s，45个循环。反应结束后，利用仪器分析软件自动获得标准曲线(见图1)和扩增曲线(见图2)，如图1所示，标准曲线显示5个稀释度间线性关系良好(R2＝0.996)，扩增效率较高(Eff％＝98.553)。
实施例6敏感性和特异性验证
将制备的标准质粒进行10倍梯度稀释后，以10～101212个梯度质粒溶液作为模板进行SYBR实时荧光PCR检测，最大模板浓度为该方法的检测灵敏度，扩增曲线见图3，融解曲线见图4，如图3所示，自左向右1.2×109copies/μL、1.2×108copies/μL、1.2×107copies/μL、1.2×106copies/μL、1.2×105copies/μL、1.2×104copies/μL、1.2×103copies/μL、1.2×102copies/μL、1.2×101copies/μL，阴性对照未出现扩增曲线，本例中方法敏感性可到12copies/μL。
分别以PTV(猪捷申病毒)、TGEV(猪传染性胃肠炎病毒)、PRV(猪伪狂犬病毒)、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)、FMDV(口蹄疫病毒)、CSFV(猪瘟病毒)和JEV(乙型脑炎病毒)的cDNA或DNA为模板，同时设阴性对照，上述反应条件进行SYBR荧光PCR，检测该方法的特异性。结果见图5，除猪捷申病毒外，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪伪狂犬病毒等均未出现扩增，说明该方法的特异性较高。图6是图5的特异性验证试验的融解曲线。
实施例7临床样品检测
我们在上海地区的供港猪场和进口美国种猪采集110份粪便样品。用PBS处理后，离心收集上清，用Qiagen RNA提取试剂盒提取RNA，按照上述方法配制反应体系，在ABI ViiA7PCR仪上进行反应。结果显示有60份样品出现特异型性扩增，经判定为PTV核酸阳性，如表1所示(出现扩增曲线，Ct值小于38个循环且融解温度为86.7±0.17℃范围内可判定结果为阳性，否则为阴性)。图7是实施例7中临床样品检测时的融解曲线，本例中出现的疑似样本，经RT-PCR扩增获得单一性扩增产物，产物送测序公司进行基因解析，确定为PTV的基因片段后，分析PCR仪软件给出的所有阳性样本的融解温度，最大值与最小值之和的平均值为86.7℃，即得到86.7±0.17℃范围内的阳性样本融解温度。
表1.临床样品检测结果

Claims (7)

1.一种猪捷申病毒通用型荧光定量RT-PCR检测方法，包括下述操作步骤：
1)样品处理：取组织样品、粪便样品或液体样品，提取核酸；
2)设计引物，该引物序列为：
上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)或其互补链；
下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)或其互补链；
3)采用步骤2)设计的引物进行荧光定量RT-PCR检测；
4)结果判定：根据扩增的曲线、Ct值和融解温度确定检测阳性和阴性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述组织样品处理步骤具体为：无菌取组织样品，加入灭菌PBS，匀浆，取匀浆液提取核酸或-20℃保存备用；所述粪便样品处理步骤具体为：取粪便，加入灭菌PBS，涡旋混匀，离心，取上清提取核酸；所述液体样品处理步骤具体为：取液体样品直接进行核酸提取。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应体系为20μL，包括：2倍RT-PCR缓冲液10μL，反应酶混合物0.8μL，ROX参比染料II 0.4μL，无RNase水5.2μL，同时加入步骤2)设计的10μmol/L浓度上下游引物各0.8μL和RNA模板2μL。
4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应体系在ABI 7500或ViiA7荧光PCR检测系统进行。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应条件为：
阶段1为反转录反应：42℃5min，95℃10sec；
阶段II为PCR反应：95℃5sec,56℃10sec，72℃30sec，72℃收集荧光，45个循环；
阶段III为融解曲线分析：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，ABI仪器自动生成。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，结果判定具体为：出现扩增曲线，Ct值小于38个循环且融解温度为86.7±0.17℃范围内判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。
7.一种用于检测猪捷申病毒的引物，其特征在于，其序列为：
上游引物PTVF：5’-TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)或其互补链；
下游引物PTVR：5’-AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)或其互补链。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531651A (zh) * 2018-04-13 2018-09-14 华南农业大学 一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物及其应用
CN109321565A (zh) * 2018-11-12 2019-02-12 河南弘腾农业有限公司 一种对粪便样品进行预处理的方法及其应用
CN110016524A (zh) * 2019-05-29 2019-07-16 华南农业大学 用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533672A (zh) * 2012-01-14 2012-07-04 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪捷申病毒的体外分离方法
CN102776210A (zh) * 2012-07-31 2012-11-14 北京大北农科技集团股份有限公司 猪捷申病毒dbn-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533672A (zh) * 2012-01-14 2012-07-04 北京大北农科技集团股份有限公司 一种猪捷申病毒的体外分离方法
CN102776210A (zh) * 2012-07-31 2012-11-14 北京大北农科技集团股份有限公司 猪捷申病毒dbn-10021株全基因组序列，测定其的引物及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDI KRUMBHOLZ，ET AL: "Detection of porcine teschoviruses and enteroviruses by LightCycler real-time PCR", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
CHAOFAN ZHANG,ET AL: "The survey of porcine teschoviruses in field samples in China with a universal rapid probe real-time RT-PCR assay", 《TROP ANIM HEALTH PROD》 *
CRISTINA CANO-GÓMEZ,ET AL: "Evaluation of a fluorogenic real-time reverse transcription-polymerase chain reaction method for the specific detection of all known serotypes of porcine teschoviruses", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 *
张强等: "TaqMan实时荧光RT-PCR检测猪脑心肌炎病毒方法的建立与应用", 《中国动物检疫》 *
胡峰等: "猪捷申病毒TaqMan实时定量RT-PCR方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531651A (zh) * 2018-04-13 2018-09-14 华南农业大学 一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物及其应用
CN109321565A (zh) * 2018-11-12 2019-02-12 河南弘腾农业有限公司 一种对粪便样品进行预处理的方法及其应用
CN110016524A (zh) * 2019-05-29 2019-07-16 华南农业大学 用于检测猪捷申病毒的套式pcr引物、方法及试剂盒

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