CN108531651A - 一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测并鉴别FAdV‑4和FAdV‑8b的特异性引物及其应用，属于生物技术领域。本发明根据FAdV‑4和FAdV‑8b的保守序列设计了两对特异性引物，扩增的片段大小分别为138bp、122bp，解链温度分别为81.5℃、87.3℃，可根据荧光定量扩增曲线及溶解曲线对FAdV‑4和FAdV‑8b进行区分。特异性实验表明，本发明对其它家禽常见病毒AIV(H5N6，H9N2)、NDV、IBV、IBDV、ALV、ILTV等无交叉反应。本检测方法灵敏、高效，可对临床样品进行批量检测，因此大大节省了临床诊断FAdV‑4和FAdV‑8b的时间，给养鸡业带来了巨大经济效益。

Description

一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测并鉴别两种血清型禽腺病毒的检测方法，具体涉及一种用于检测并鉴别FAdV-4(禽腺病毒血清4型)和FAdV-8b(禽腺病毒血清8b型)的特异性引物及其应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，为双股DNA病毒，由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒。禽腺病毒分为3个群，Ⅰ群禽腺病毒是从鸡、火鸡、鹅、鸭的呼吸道感染分离出的禽腺病毒，分为12个血清型，分别为1-8a、8b-11，主要引起包涵体肝炎、轻度呼吸道疾病、心包积液综合症、肌胃糜烂及产蛋下降等。Ⅱ群腺病毒主要是火鸡出血性肠炎病毒(Hemorrhagic Enteritis，HEV)，主要引起火鸡出血性肠炎。Ⅲ群腺病毒是减蛋综合症病毒(Egg Drop Syndrome，EDSV)，主要引起减蛋综合症。

心包积液综合症(Hydropericardium syndrome，HPS)主要是由禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)引起的，该病的典型症状为心包中出现淡黄色、凝胶样物质，死亡率30％～90％。1987年HPS首次在巴基斯坦报道，之后在伊拉克、印度、俄罗斯、韩国、日本、墨西哥、美国和加拿大等国家陆续报道。自2015年6月开始，我国黑龙江、北京、山东、河南、安徽、湖北、江苏、新疆等地区的肉鸡中爆发了一种以死亡快、死亡率高、剖检以心包积液为主要病变特征的传染病。该病的传染速度很快，感染的宿主也扩大到蛋鸡、麻鸡、白羽肉鸡、三黄鸡、土鸡等品种，并呈区域性流行，经鉴定，确定该病原为Ⅰ群禽腺病毒。血清分型表明我国已报道的省份流行的禽腺病毒主要是FAdV-4型和FAdV-8b型，因此造成鸡群的死亡率较高，发病急、传播快，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。

荧光定量PCR染料法技术原理是，荧光染料SYBR可以结合到双链DNA上面，当体系中的模板被扩增时，SYBR可以有效结合到新和成的双链上面，随着PCR进行，结合的染料越来越多，被仪器检测到的荧光信号也越来越强，从而达到定量目的。当荧光定量扩增反应完成后，为判定产物是否相对专一，会对产物逐渐加温，PCR产物随温度增高会逐渐变成单链，从而不能和SYBR结合，当产物达到PCR产物的Tm值时，产物解离成指数增多，系统检测荧光信号会突然减少，从而达到检测产物Tm值的目的。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物。该特异性引物具有快速、方便、高效、灵敏度高、特异性强等特点。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述特异性引物或试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的双重荧光定量PCR方法。该方法可以快速、灵敏、准确的检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b，极大的缩短了检测时间。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物，包括如下序列：

RT-FAdV-4-F：5′-TTGGTTTCGTCGGCTTTG-3′；

RT-FAdV-4-R：5′-TTTCGCCTTCTTTGTGGG-3′；

RT-FAdV-8b-F：5′-GTGAACGGGTCGTATCGG-3′；

RT-FAdV-8b-R：5′-TGCTGGCAGAGGTATGAGG-3′；

RT-FAdV-4-F/R扩增的目的片段大小为138bp，RT-FAdV-8b-F/R扩增的目的片段大小为122bp。

本发明还提供一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的试剂盒，包括上述特异性引物。

上述特异性引物或试剂盒可以用于检测疑似感染FAdV-4和FAdV-8b病毒的临床样品或者已分离的病毒。

本发明还提供一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的双重荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

(1)用常规方法或试剂盒提取病料或病料分离物的DNA；

(2)所述实时荧光PCR的反应体系为：Premix Ex Taq^TM(2×)10μL；RT-FAdV-4-F(20μM)0.2μL；RT-FAdV-4-R(20μM)0.2μL；RT-FAdV-8a-F(20μM)0.2μL；RT-FAdV-8b-R(20μM)0.2μL；DNA模板2μL；ROX Reference Dye II(50×)0.4μL；dH₂O(灭菌蒸馏水)6.8μL，总体积为20μL；

(3)所述实时荧光PCR的反应程序为：Stage1：预变性，Repa：1，95℃30秒；Stage2：PCR反应，Repa：40，95℃5秒，56℃34秒；stage3：Dissociation Stage，Repa：1，95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒，60℃15秒；

(4)最后根据荧光定量获得的Tm值来区分FAdV-4与FAdV-8b；其中，Tm值为81.5℃，检测结果则为FAdV-4；Tm值为87.3℃，检测结果则为FAdV-8b。

本发明进一步提供了一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的双重实时定量PCR方法在特异性方面的验证。本发明对禽常见病毒如禽流感病毒(H5N6，H9N2)、新城疫病毒(NDV)、禽白血病毒(ALV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的检测均为阴性。但对禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b的检测均为阳性。

本发明进一步提供了一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的双重实时定量PCR方法在检测临床样品或已分离的病毒时的应用。根据本实验室收集的52份已知病料(其中，47份腺病毒阳性样品，5份腺病毒阴性样品，所用的阴性样品用来检测该方法的特异性及敏感性，如果引物特异性不好，阴性样品可能会起峰)，用试剂盒提取DNA后，使用本发明的方法对该批样品进行检测。检测结果表明共47份病料检测阳性，其中38份病料仅检测到FAdV-4，4病料仅检测到FAdV-8b，5份病料既检测到了FAdV-4又检测到FAdV-8b，5份阴性样品检测结果为阴性。该检测结果与该52份已知样品的实际信息100％吻合，说明该检测结果真实可靠。

本发明的机理是：

本检测方法原理根据FAdV-4的保守基因ORF14a，与FAdV-8b的保守基因DNApolymerase的GC％含量不同而设计了两对特异性引物，然后由于该引物扩增的两条目的片段的GC％含量不同，从而产物的解链温度不同，因此生成的产物的熔融曲线的Tm值不同，最后根据Tm值对FAdV-4及FAdV-8b进行区分。

本检测方法，相比常规PCR检测方法而言，操作简便、无污染，不仅检测灵敏、可以快速得到结果，而且还可以对PCR产物进行定量，因此大大节省了临床诊断FAdV-4和FAdV-8b的时间，给养鸡业带来了巨大经济效益。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明根据FAdV-4和FAdV-8b的保守序列分别设计了两对特异性扩增引物，该两对引物扩增的片段大小分别为138bp、122bp；GC％含量分别为44.2％，66.0％；解链温度分别为81.5℃、87.3℃，本发明可以根据荧光定量扩增曲线及溶解曲线对FAdV-4和FAdV-8b进行区分。特异性实验表明，本发明对其它家禽常见病毒AIV(H5N6，H9N2)、NDV、IBV、IBDV、ALV、ILTV等无交叉反应。通过临床应用证实，该方法可以快速灵敏的检测FAdV-4和FAdV-8b，并能快速获知FAdV-4和FAdV-8b的混合感染情况。本发明方法简便、高效，可以用于临床及实验室的FAdV-4和FAdV-8b的检测。

附图说明

图1是FAdV-4AV211代表毒株实时荧光定量扩增的熔融曲线。

图2是FAdV-8b IBH1401代表毒株实时荧光定量扩增的熔融曲线。

图3是FAdV-4AV211和FAdV-8b IBH1401代表毒株实时荧光定量扩增的熔融曲线。

图4是检测临床常见病毒的实时荧光定量扩增的熔融曲线(双峰为阳性对照)。

图5是检测临床样品的实时荧光定量扩增的熔融曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例所用的生物材料的来源如下：

文献(1)：Biological Characterizations of H5Nx Avian Influenza VirusesEmbodying Different Neuraminidases.Frontiers in Microbiology,2017,8.

文献(2)：PB2-588 V promotes the mammalian adaptation ofH10N8, H7N9 andH9N2 avian influenza viruses.Scientific Reports,2016,6:19474.

文献(3)：The construction and application of a cell line resistant tonovel subgroup avian leukosis virus(ALV-K)infection.Archives of Virology,2018,163(1):89-98.

实施例1

(一)引物设计：参照GenBank中的FAdV-4代表序列与FAdV-8b代表序列的全基因组，用MEGA6.0软件找到FAdV-4与FAdV-8b两个毒株GC％含量差异大的两个保守基因，并根据该保守基因分别设计了两对特异性引物，各引物及引物序列如下：

RT-FAdV-4-F：5′-TTGGTTTCGTCGGCTTTG-3′；

RT-FAdV-4-R：5′-TTTCGCCTTCTTTGTGGG-3′；

RT-FAdV-8b-F：5′-GTGAACGGGTCGTATCGG-3′；

RT-FAdV-8b-R：5′-TGCTGGCAGAGGTATGAGG-3′；

(二)病料及病料分离物中病毒DNA的提取：

提取方法参照美吉生物病毒DNA/RNA提取试剂盒，首先将待检的临床病料或已分离的腺病毒，反复冻融三次，混合后离心取上清液备用；其次取上述上清液取0.2mL用DNA提取试剂盒提取DNA；最后将DNA溶于30μL超纯水中-20℃保存备用。具体步骤如下：

(1)称取5g左右的疑似感染FAdV-4或FAdV-8b的病鸡的肝脏和脾脏放到已消毒的研钵中进行充分研磨。

(2)在已研磨充分的匀浆中加入2mL含终浓度1000UI双抗的PBS进行混匀。并分装于2mL的EP管中。

(3)将上述病料反复冻融三次，最后一次放到涡旋器上涡旋3分钟。

(4)将该病料4℃6000r/min离心10min，收集上清液。

(5)吸取20μL的Proteinase K到1.5mL离心管中。

(6)吸取250μL上面处理好的上清液至装有Proteinase K的离心管中，振荡混匀10秒。

(7)加入500μL Buffer GRP到样品中，涡旋混匀30秒，室温静置10分钟。

(8)把HiPure RNA Column A过滤柱装在2mL收集管中，12,000r/min离心60秒。

(9)弃去2mL离心管内的滤液，加入500μL Buffer GW1(已经用乙醇稀释)到柱子中，12000r/min离心60秒。

(10)弃去滤液，把柱子重新装回收集管中，加入650μL Buffer RW2(已经用乙醇稀释)至柱子中，12000r/min离心60秒。

(11)弃去滤液，把柱子重新套回收集管，12000r/min离心120秒，然后离干柱子。

(12)重新装入新的1.5mL离心管，加入30μL Nuclease Free Water至柱子中，室温下静置2min，12000r/min离心60秒。

(13)弃去柱子，把DNA保存于-80℃备用。

(三)实时荧光定量对样品进行检测：

(1)实时荧光PCR的反应体系为：Premix Ex TaqTM(2×)10μL；RT-FAdV-4-F(20μM)0.2μL；RT-FAdV-4-R(20μM)0.2μL；RT-FAdV-8a-F(20μM)0.2μL；RT-FAdV-8b-R(20μM)0.2μL；DNA模板2μL；ROX Reference Dye II(50×)0.4μL；dH₂O(灭菌蒸馏水)6.8μL，总体积为20μL。

(2)进一步，所述实时荧光PCR的反应程序为：Stage1：预变性，Repa：1，95℃30秒；Stage2：PCR反应，Repa：40，95℃5秒，56℃34秒；stage3：Dissociation Stage，Repa：1，95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒，60℃15秒。

(四)结果分析：

禽腺病毒血清4型与禽腺病毒血清8b型的双重荧光定量PCR扩增曲线良好，扩增结果参看图1～图3，当样品中仅有FAdV-4时，熔融曲线仅有一个峰值，Tm值为81.5℃，当样品中仅有FAdV-8b时，熔融曲线也仅有一个峰值Tm值为87.3℃，当样品中同时具有FAdV-4和FAdV-8b时，熔融曲线具有两个峰值，分别在Tm值为81.5℃和Tm值为87.3℃处各有一个峰值。

(五)临床应用

根据本发明提供的检测方法，通过对已知结果的52份临床样品(其中，47份腺病毒阳性样品，5份腺病毒阴性样品)进行检测后证实(图5)，使用本发明的方法对该批样品进行检测，检测结果表明共47份病料检测阳性，其中38份病料仅检测到FAdV-4，4病料仅检测到FAdV-8b，5份病料既检测到了FAdV-4又检测到FAdV-8b，5份阴性样品检测结果为阴性。该方法检测结果与已知样品实际结果符合率为100％，说明该检测结果真实可靠；说明该方法可快速灵敏、准确地检测FAdV-4，FAdV-8b，以及FAdV-4与FAdV-8b混合感染的情况，极大地缩短了检测时间；该方法检测特异性强，对禽常见病毒如禽流感病毒(H5N6，H9N2)、新城疫病毒(NDV)、禽白血病毒(ALV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的检测均为阴性；但对禽腺病毒FAdV-4和FAdV-8b的检测均为阳性(图4)。因此，避免了临床上禽常见病毒AIV(H5N6，H9N2)、NDV、IBV、IBDV、ALV、ILTV等对检测结果的干扰。因此，本发明建立的FAdV-4与FAdV-8检测技术具有快速、准确、灵敏、重复性好等优点，可用于FAV样品的临床及实验室检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT-FAdV-4-F

<400> 1

ttggtttcgt cggctttg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT-FAdV-4-R

<400> 2

tttcgccttc tttgtggg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT-FAdV-8b-F

<400> 3

gtgaacgggt cgtatcgg 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> RT-FAdV-8b-R

<400> 4

tgctggcaga ggtatgagg 19

Claims (5)

1.一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物，其特征在于包括如下序列：

RT-FAdV-4-F：5′-TTGGTTTCGTCGGCTTTG-3′；

RT-FAdV-4-R：5′-TTTCGCCTTCTTTGTGGG-3′；

RT-FAdV-8b-F：5′-GTGAACGGGTCGTATCGG-3′；

RT-FAdV-8b-R：5′-TGCTGGCAGAGGTATGAGG-3′。

2.一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的特异性引物。

3.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的试剂盒在检测疑似感染FAdV-4和FAdV-8b病毒的临床样品或者已分离的病毒中的应用。

4.一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的双重荧光定量PCR方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)用常规方法或试剂盒提取病料或病料分离物的DNA；

(2)所述实时荧光PCR的反应体系为：Premix Ex Taq^TM 10μL；20μM的RT-FAdV-4-F 0.2μL；20μM的RT-FAdV-4-R 0.2μL；20μM的RT-FAdV-8a-F 0.2μL；20μM的RT-FAdV-8b-R 0.2μL；DNA模板2μL；50×ROX Reference Dye II 0.4μL；dH₂O 6.8μL，总体积为20μL；

(3)所述实时荧光PCR的反应程序为：Stage1：预变性，Repa：1，95℃30秒；Stage2：PCR反应，Repa：40，95℃5秒，56℃34秒；stage3：Dissociation Stage，Repa：1，95℃15秒，60℃60秒，95℃15秒，60℃15秒；

(4)最后根据荧光定量获得的Tm值来区分FAdV-4与FAdV-8b；其中，Tm值为81.5℃，检测结果则为FAdV-4；Tm值为87.3℃，检测结果则为FAdV-8b。

5.权利要求4所述的用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的双重实时定量PCR方法在检测临床样品或已分离的病毒时的应用。