CN101736091A - 一种实时荧光rt-pcr检测h7亚型禽流感病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术早期、快速诊断H7亚型禽流感病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等样品中的H7亚型禽流感病毒的快速早期检测和定量分析。

Description

一种实时荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术早期、快速诊断H7亚型禽流感病毒感染的试剂盒。本试剂盒具有很高的灵敏度和特异性，通过本发明的试剂盒实现对咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等样品中的H7亚型禽流感病毒进行快速早期检测和定量分析。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是禽流行性感冒的简称，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是一种从呼吸道疾病到严重性全身组织出血性病变等多种症状的急性传染病。1878年，Perroncito在意大利的鸡群中首次发现禽流感，其后在世界各地均有报道，每次暴发都造成巨大的经济损失，如，1993年美国宾夕法尼亚州暴发禽流感，政府斥资6000万美元用于捕杀1700万只鸡；1995年，因为禽流感原因，墨西哥捕杀、封锁约5000万只鸡，并对上亿只鸡进行紧急接种疫苗，直接造成10亿美元经济损失。我国自从1994年发现禽流感在鸡群中流行(金元昌，李景鹏，张龙等.禽流感病毒分子生物学研究进展.动物医学进展，2003，24(1)：12-15)以来，已经发生多起暴发事件。禽流感给世界养禽业造成巨大损失，是国际公认的一种禽类毁灭性传染病，国际兽医局动物流行病组织(IOE)规定该病为A类烈性传染病，我国也将其列为一类检疫对象。

引起禽流感的致病元凶——禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)属于正粘病毒科，A型(或甲型)流感病毒，是一种负链RNA病毒，根据其膜蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)抗原性可分成不同的亚型，迄今为止一共发现了16种HA亚型(H1～H16)，其中绝大数AIV呈隐性感染，不表现任何临床症状，只有少数AIV具有迅速传播和高致死性的特征，称之为高致病力禽流感病毒，如，AIV-H5、AIV-H7、AIV-H9。与其他RNA病毒一样，由于RNA聚合酶缺乏校正功能，容易发生变异；更特别的是，流感病毒的基因组都是由非连续的、分节段的8个RNA片段组成，容易发生重排，因此AIV-H7极易发生变异，毒力越来越强。近年来，高致病性禽流感在世界各地的暴发成上升趋势，不但严重危害禽类，也威胁哺乳动物，尤其是可以感染人类并可致死，特别是1997年香港暴发的禽流感，不但损失了1亿港币来捕杀150万只鸡，而且已经对人类健康造成极大威胁，到目前，我国及其他国家已经发生数百人感染禽流感致死的报道。由此可见，研究禽流感具有重要的公共卫生学意义和经济学意义！当前的重点是预防和控制AIV-H7的传播，因此建立快速、准确的病毒检测手段至关重要。

AIV-H7的常用检测方法包括：病毒培养法、免疫学方法和核酸检测方法。病毒培养法是广泛应用的实验室检测方法之一，灵敏度高，但操作周期长(7～10天)，而且对实验室条件的要求也较高(Kaiser L，Briones MS，Hayden FG.Performance of virus isolation andDirectigen Flu A to detect influenza A virus in experimental human infection.J ClinVirol，1999，14：191-197)。与之相比，免疫学方法相对快速简便，但灵敏度和特异性差(Boivin G，Hardy I，Kress A.Evaluation of a rapid optical immunoassay for influenzaviruses(FLU OIA test)in comparison with cell culture and reverse transcription-PCR.J Clin Microbiol，2001，39：730-732)，而且抗体检测的结果仅仅说明被检测的禽类或动物曾经感染过禽流感病毒，但不能准确反映当前是否感染或携带病毒，因此，在应用方面具有一定的局限性。特别是目前的家禽大多被注射疫苗免疫，因此不能使用该方法进行筛查。近年来，飞速发展的核酸分子生物学方法，如逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcriptionPCR，RT-PCR)技术应用于AIV-H7的检测，先通过逆转录酶作用，把AIV-H7RNA逆转录成cDNA，然后再利用Taq酶对cDNA进行PCR扩增，灵敏度高且能够快速准确检测是否携带病毒，可结合其它检测方法加以进一步的判定(Ellis JS，Fleming DM，Zambon MC.Multiplex reversetranscription-PCR for surveillance of influenza A and B viruses in England and Walesin 1995and 1996.J Clin Microbiol，1997，35：2076-2082；Magnard C，Valette M，AymardM，et al.Comparison of two nested PCR，cell culture，and antigen detection for thediagnosis of upper respiratory tract infections due to influenza viruses.J Med Virol，1999，59：215-220。)。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。一步法实时荧光RT-PCR技术是实时荧光PCR的一种(Martell，M.J.Gomez，J.Esteban，S.Sauleda，J.Quer，B.Cabot，R.Esteban，and J.Guardia.1999.High-throughput real-time reverse transcription-PCR quantitation of hepatitis Cvirus RNA.J.Clin.Microbiol.37：327-332；Lee CW，Suarez DL.2004.Application ofreal-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 andH7 subtype avian influenza virus.J Virol Methods.119(2)：151-8。)，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处在于前者在反应体系中增加了逆转录酶，同时多了一个逆转录反应步骤；相同之处在于两者在反应体系中均有一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针，探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

传统的RT-PCR由两个单独的反应程序或步骤完成，第一步是通过逆转录酶作用，将RNA逆转录成cDNA；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA为模板进行PCR扩增。与传统的RT-PCR相比较，一步法实时荧光RT-PCR技术具有如下优点：1、将逆转录和PCR扩增两个在不同反应管中分开进行的二个反应程序合并成一个反应程序，在一个PCR反应管中完全闭管完成检测过程，大大节省了反应时间；2、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃普通PCR方法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对检测样品进行准确定量分析，从而有效监测药物治疗的效果；3、将RNA逆转录、DNA扩增与检测三过程融合为一体，可以实时、动态监测RNA扩增的全过程，省掉了PCR产物后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；4、由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；5、由于在普通RT-PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，进一步提高了检测靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在RNA样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。

我国食品与药品管理局(SFDA)已经批准了诸如HIV-1、HCV等病原体的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒的生产与临床应用。因此，通过一步法实时荧光RT-PCR方法开发一种检测AIV-H7的试剂盒在技术上是可行的，它的应用将极大满足AIV-H7快速检测与监测工作的需要。

众所周知，在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在此基础上利用一步法实时荧光RT-PCR技术发明了一种检测AIV-H7的试剂盒，应用于AIV-H7的检测和定量分析。

发明内容

本发明涉及一种实时荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒，特别是涉及以一步法实时荧光RT-PCR反应技术早期、快速诊断H7亚型禽流感病毒感染的试剂盒。本试剂盒可以检测咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等样品中的AIV-H7。

本发明的目的是提供一种使用一步法实时荧光RT-PCR技术来定性及定量检测样品中AIV-H7的试剂盒，特别是涉及AIV-H7的早期感染在实验室诊断中的应用。其基本原理是利用一对寡核苷酸的特异性引物和一条寡聚核苷酸的特异性探针，在逆转录酶(RT酶)、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、RNA酶抑制剂(RNasin)、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg2+等RT-PCR反应缓冲液中，通过DA7600、ABI7500等市售的荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、实时、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测样品中AIV-H7的试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液(即TRIZOL核酸抽提试剂)、RT-PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于RT-PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物AIV-H7-F和反向引物AIV-H7-R的序列分别是：5′-GAATACAGATAGACCCAGTGAAATTGA-3′(SEQ ID NO：1)和5′-GCAAATGAAAACCAATCCCATT-3′(SEQ IDNO：2)。

根据本发明的一个优选实施方案，RT-PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针AIV-H7-P的序列是5′-CATGATGCCCCGAAGCTAAACCATAAG-3′(SEQ ID NO：3)。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中RT-PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶(Taq酶)、(b)逆转录酶(RT酶)、(c)RNA酶抑制剂(RNasin)、(d)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(e)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(f)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，(g)和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于RT-PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为0.38μmol/L、探针浓度为0.20μmol/L；

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于RT-PCR扩增反应液中的镁离子最佳浓度为2.0mmol/L、Taq酶最佳用量为5U/反应、RT酶最佳用量为100U/反应、RNasin最佳用量为20U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳浓度为0.21mmol/L。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于RT-PCR扩增的最佳反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为含有扩增目标片段的体外转录RNA，浓度为1.0×10⁴个EID50。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量参考品为含有扩增目标片段的体外转录RNA，包括4个浓度梯度：1.0×10⁷个EID50、1.0×10⁶个EID50、1.0×10⁵个EID50、1.0×10⁴个EID50。

本发明提供的一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒可以检测出AIV-H7的最低浓度为1.0×10³个EID50，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明针对AIV-H7基因组保守基因片段设计特异引物和探针，可检测出AIV-H7，但不能检测出非AIV-H7病原体，如新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、AIV-H5、AIV-H9等，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的实时荧光RT-PCR检测试剂盒可以检测咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等样品中的AIV-H7；可为灵敏、快速早期诊断AIV-H7感染提供可靠的实验证据；同时由于能准确定量，所以可对疗效进行有效监测。

附图说明

图1显示线性与灵敏度参考品的检测结果图。针对模板数为1.0×10²～1.0×10⁸个EID50的线性与灵敏度参考品进行实时荧光RT-PCR检测分析，检测结果表明，当病毒量为1.0×10³个EID50时，检测样品的Ct值在32左右，即检测灵敏度可到达1.0×10³个EID50。

图2显示定量参考品扩增结果的标准曲线图。针对模板数为1.0×10⁴～1.0×10⁷个EID50的定量参考品进行实时荧光RT-PCR检测分析，绘制得到的标准曲线斜率(Slope)为-3.5177，在Y轴截距(Intercept)为43.0125，相关系数的平方(R²)＝0.9910。

图3显示3个阳性参考品的检测结果图。3个阳性参考品的荧光扩增曲线有明显指数增长期，并与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为20.70、23.73、28.38，可明确判定为阳性。

图4显示10个阴性参考品的检测结果图。10个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与阈值线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。10个阴性参考品分别为与AIV-H7感染有相似症状的8种病毒样品(新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、AIV-H5、AIV-H9)以及2份正常禽类的咽喉拭子和泄殖腔拭子样品。

图5显示3个临床阳性标本的扩增曲线。3个标本的Ct值分别是22.58、24.41、27.50，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：H7亚型禽流感病毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genbank数据库已有的AIV-H7核酸序列以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以AIV-H7基因组的基质蛋白编码基因(M基因)的保守片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件，人工设计多对引物和探针。

2、样本的选择：根据国内外相关文献报道表明，可以选择咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等样品。

3、反应体系的建立与优化

样品的准备：以病毒培养鉴定为阳性的3份AIV-H7样品作为阳性参考品；以病毒培养鉴定为阴性的10份非AIV-H7样品作为阴性参考品，分别为8种病毒样品(新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、AIV-H5、AIV-H9)以及2份正常禽类的咽喉拭子和泄殖腔拭子样品。分别用TRIZOL提取上述阳性参考品与阴性参考品的RNA，待用。

引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3)。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.20μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的引物和从0.10μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.38μmol/L、探针浓度为0.20μmol/L。

Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为5U/反应。

RT酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从50U(酶单位)至400U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为100U/反应。

RNasin用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNasin用量为20U/反应。

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.21mmol/L。

反应温度的优化：根据酶的活性和寡多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

4、灵敏度实验：将浓度为1.0×10⁹个EID50的灭活AIV-H7培养上清，10倍梯度稀释成1.0×10⁸个EID50、1.0×10⁷个EID50、1.0×10⁶个EID50、1.0×10⁵个EID50、1.0×10⁴个EID50、1.0×10³个EID50、1.0×10²个EID50作为线性与灵敏度参考品，进行实时荧光RT-PCR检测分析，当病毒量为1.0×10³个EID50时，检测样品的Ct值在32左右，即检测灵敏度可到达1.0×10³个EID50(如附图1所示)。

5、标本检测：以咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等作为待检标本，分别用TRIZOL提取标本的RNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明：本试剂盒可以很灵敏的检测出临床标本中的AIV-H7。

实施例2：H7亚型禽流感病毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：RNA提取液(50ml/管)1管、RT-PCR扩增反应液(20μl/管)24管、阴性质控品(100μl/管)1管、阳性质控品(100μl/管)1管、定量参考品(50μl/管)4管。

2、标本采集、运送和保存

2.1适用样本类型：咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等。

2.2样品采集与前处理(注意无菌操作)

2.2.1活禽样品——取咽喉拭子、泄殖腔拭子或新鲜粪便拭子，具体采集方法如下：

1)咽喉拭子：采取时要将拭子深入喉头及上腭裂来回刮3～5次，取咽喉分泌液；

2)泄殖腔拭子：将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便；对于易造成损伤的小珍禽，直接用拭子沾取适量新鲜粪便；

3)将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0ml PBS的离心管中，编号备用。

2.2.2内脏或肌肉样品——用无菌镊剪夹取待检样品2.0g于研钵中充分研磨，再加10mlPBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入10ml PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌离心管中3,000rpm离心10min，取上清液转入离心管中，编号备用。

2.2.3血清或血浆——用无菌注射器直接吸取(不少于400μl)至无菌离心管中，编号备用。

2.3保存与运送：采集或处理的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(最多冻融3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

3、检测步骤

(1)RNA提取

A.取N个(N＝1管阴性质控品+待测样本数)灭菌的1.5ml离心管，作好标记。

B.每管分别加入600μl Trizol试剂，然后分别加入200μl的阴性质控品或待测样品上清液(充分混匀后吸取)，充分振荡混匀15s，室温静置3～5分钟；

C.每管加入200μl氯仿，上下颠倒混匀10秒后，12,000rpm离心4分钟；

D.小心吸取无色上层液体(注意不可触及中间絮状层)，转移至新灭菌的1.5ml离心管，然后加入10μl RNA提取液A(充分混匀后吸取)，充分吸打混匀，8,000rpm离心1分钟后，小心弃去所有液体；

E.加入溶液C(确认已加入无水乙醇)800μl，充分吸打混匀，8,000rpm离心1分钟，尽可能将液体去除干净(避免触及沉淀颗粒)；

F.将离心管敞开盖，摆在通风橱中风干15分钟(也可使用开放式加热器于60℃干燥5分钟，需防止样本交叉污染)，然后加入30μl DEPC H₂O，吸打混匀管中沉淀，得到白色的悬浊液，可直接用于检测，也可存于-70℃待用。

(2)RT-PCR反应与结果分析

分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量参考品各5μl，加入PCR反应管中进行RT-PCR扩增。RT-PCR循环条件是：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

反应结束后保存检测数据文件。根据RT-PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的定量参考品标准曲线达到最佳(即相关系数的平方(R²)＞0.97)(参见附图2所示)。由附图3可以看出，3个阳性参考品的荧光扩增曲线有明显指数增长期，并与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为20.70、23.73、28.38；在附图4中，由于10个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与阈值线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。最后由仪器自动分析计算出未知标本的测定数值。

实施例3：应用H7亚型禽流感病毒一步法实时荧光RT-PCR检测试剂盒定量检测临床样品

所有实验过程在哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室完成，临床样品由哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室提供，包括咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本等样品类型；标本RNA提取、RT-PCR反应与结果分析参照实施例2进行。

RT-PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的定量参考品标准曲线达到最佳(即相关系数的平方(R²)＞0.97)，然后分析临床样品。临床样品的检测结果如附图5所示：3个临床阳性标本扩增曲线的Ct值分别是22.58、24.41、27.50，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性；参照同一次试验中定量参考品的标准曲线图(如附图2所示)可以判定3个临床阳性标本的AIV-H7浓度分别为：6.42×10⁵个EID50、1.94×10⁵个EID50、2.56×10⁴个EID50。

序列表

<110>中山大学达安基因股份有限公司

<120>一种实时荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

gaatacagatagacccagtgaaattga

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

gcaaatgaaaaccaatcccatt

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。

<400>3

catgatgccccgaagctaaaccataag

Claims (9)

1.一种检测样品中H7亚型禽流感病毒存在的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有RNA提取液、RT-PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中RT-PCR扩增反应液包括耐热DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、脱氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，两末端分别结合有荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针，其特征在于RT-PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别为：

正向引物AIV-H7-F：5’-GAATACAGATAGACCCAGTGAAATTGA-3’；

反向引物AIV-H7-R：5’-GCAAATGAAAACCAATCCCATT-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR扩增反应液中所使用的寡核苷酸探针AIV-H7-P的序列为：5’-CATGATGCCCCGAAGCTAAACCATAAG-3’。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR扩增反应液中正向引物浓度为0.38μmol/L、反向引物浓度为0.38μmol/L、寡核苷酸探针浓度为0.20μmol/L。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR扩增反应液中耐热DNA聚合酶的浓度为5U/反应。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR扩增反应液中逆转录酶的浓度为100U/反应。

6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR扩增反应液中RNA酶抑制剂的浓度为20U/反应。

7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于RT-PCR扩增反应液中脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的浓度为0.21mmol/L。

8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于用于RT-PCR扩增的反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环。

9.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测的样品可选自但不局限于咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或脏器样本、血清或血浆等样品。

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