CN103352088A - 用于检测禽流感病毒h7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于病毒检测领域，涉及一种用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法。本发明所述的引物对其中一条引物包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述探针包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。本发明试剂盒具有快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短、检测效率高、准确性高、假阳性低等优点，本发明试剂盒可以特异地检测到所有H7亚型的禽流感病毒，对其它亚型的禽流感病毒不具有特异性，为禽流感病毒H7亚型疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

Description

用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测领域，涉及用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

禽流感（avian influenza）是由禽流感病毒（avian influenza virus）引起的一种主要流行于鸡群中的烈性传染病。高致病力毒株可致禽类突发死亡，是国际兽疫局规定的A类疫病，也能感染人。禽流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒属。正粘病毒分为三个属，即A型、B型流感病毒属和C型流感病毒属。根据核蛋白(NP)和基质蛋白(MP)的不同，流感病毒共分3个型，即A，B和C型，每个型内的毒株都有基本相同的NP和MP，也就是说NP和MP具有型特异性。AIV属A型流感病毒，在正粘病毒属中A型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。根据AIV囊膜表面糖蛋白血凝素和神经氨酸酶的不同可以分为好多亚型，目前已分离到17种特异的HA抗原(H1-H17)和10种不同的NA抗原(N1-N10)。禽流感不仅严重危害禽类，而且危害哺乳动物，尤其是可感染人并致人死亡，极大的威胁人类公共卫生安全。2013年3月下旬，人类感染甲型流感H7N9病毒的病例被发现，这是该病毒全球首次感染人类。

目前检测禽流感病毒的诊断技术有鸡胚分离培养、血凝及血凝抑制试验、琼脂扩散实验、神经氨酸酶抑制试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术和RT-PCR技术等。以上几种方法及其不太成熟的试剂盒通常存在灵敏度低、特异性差、耗时、无法区分亚型等诸多问题，不能为我国快速、有效地监控禽流感H7亚型疫情提供强有力的技术支持。

实时荧光定量PCR（FQ-PCR，又称为实时荧光RT-PCR）技术包括探针法、染料法和引物法。探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以Taqman探针为代表，常用的荧光报告基团是FAM、VIC、JOE、HEX等；染料法是采用一种能够与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号换算出PCR反应中的双链DNA数量，常用的染料是SYBR green；引物法是利用荧光标记的引物实现定量，目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记，在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭，在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。

在荧光定量检测中较常用的是Taqman探针法，根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同又可分为常规Taqman探针和Taqman-MGB探针两种。常规的Taqman探针5’端标以荧光发射基团，3’端标以荧光淬灭基团，该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3’端淬灭基团抑制5’发射基团的荧光发射。在PCR的退火期，探针与引物所含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延伸，当到探针处，Taq酶发挥5’-3’外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发光基团远离淬灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50－150bp。但常规的Taqman探针法背景荧光信号强，精确度和分辨率不高。

Taqman-MGB探针法由于在Taqman-MGB探针的3’端连接一个不发光的淬灭基团，同时另增加一个小沟结合物（minor groove binder，MGB）分子，因此相对Taqman探针有三大优势：一是显著提高Tm值，减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高探针和互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。但是现有技术中并无特异性好、敏感性强的用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对和探针。

因此，目前亟需一种特异性好、敏感性强的用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对和探针及试剂盒。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对、探针、试剂盒及检测方法。本发明所述引物对和探针检测禽流感病毒H7亚型的特异性强、灵敏度高。

本发明通过以下技术方案实现的：

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

本发明的一个方面涉及一种引物对，所述引物对由两条引物组成，其中一条引物AIV-H7-F2包含如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，另一条引物AIV-H7-R1包含如SEQID NO：3所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列如下：

5’-GCAGAATAGAATACAGATAGACCCAG-3’（AIV-H7-F2，SEQ ID NO：2）；

5’-CACCGCATGTTTCCATTCTT-3’（AIV-H7-R1，SEQ ID NO：3）。

本发明的另一方面涉及一种探针AIV-H7-P1，其包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，该核苷酸序列如下：

5’-TGGTTTAGCTTCGGGGCAT-3’（AIV-H7-P1，SEQ ID NO：5）。

所述探针带有可检测的标记，为自身淬灭探针，其5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有带有小沟结合物（MGB）的不发光的荧光淬灭基团。

所述荧光发射基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种。

本发明还涉及一种组合物，其包含上述引物对和上述的探针。

此外，本发明还提供一种用于检测禽流感病毒H7亚型的试剂盒，其特征在于，包含上述的组合物。

本发明试剂盒还包含RT-PCR反应缓冲液、酶混合液、阳性对照和阴性对照，所述酶混合液包括高效反转录酶和热启动Taq酶，所述阳性对照为采用禽流感病毒H7N2的特异克隆HA区200bp的片段体外逆转录获得；所述阴性对照为经灭活SPF鸡胚尿囊液所得。本发明试剂盒使用该高效反转录酶仅在15分钟内就可从高拷贝基因中生产大量的cDNA，而普通反转录酶则需半小时以上，所述Taq酶为热启动Taq酶。

所述的RT-PCR反应缓冲液为（含MgCl₂和dNTP）。

根据本发明任一项所述的试剂盒，其中，所述引物对与探针溶于一起；所述引物对和探针终浓度分别为600nM和240nM。

本发明还提供上述的试剂盒在检测禽流感病毒H7亚型中的用途。

本发明还涉及一种禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测方法，特征在于，使用本发明所述的引物对和本发明上述的探针。

上述的方法，包括如下步骤：

（1）使用上述的引物对和上述任一的探针；

（2）用荧光发射基团标记探针的5’端，用带有小沟结合物（MGB）的荧光淬灭基团标记探针的3’端，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种；

（3）将用于检测或鉴别禽流感H7亚型的引物对和探针溶于一起，并置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

目前亟需一种特异性好、敏感性强的用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对和探针及试剂盒，但是现有技术中很难找到与GeneBank上所有H7序列比对能完全匹配的探针，同时本领域技术人员也很难设计出这样的探针。现有技术中公开号为CN101736091A和CN1670220A专利申请所公开的探针，与GeneBank上所有H7序列比对不能完全匹配，存在漏检的可能，存在缺陷，导致检测结果不精确。而本发明发明人将探针设计为TaqManMGB探针，此探针是在TaqMan的基础上，发展建立起来的，具有三大特点：一是显著提高Tm值，减少探针设计长度。二是探针3’端标记了自身不发光的淬灭分子，以取代常规可发光的TAMRA等荧光标记，使分辨率得以大大改善。三是探针3’端增加了一个小沟结合物（MinorGroove Binder，MGB），提高探针的退火温度和特异性，使结果更精确，分辨率更高，可用于单核苷酸多态性（SNP）分析及1～2个碱基变异的检测。根据GeneBank上所有H7序列的比对，本发明探针的19个碱基与所有的H7亚型禽流感病毒的基因完全匹配，本发明产品特异性很好，且不容易出现漏检。

本发明的有益效果

包含本发明引物对和探针的试剂盒快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好、检测成本低、时间短（加上核酸提取，仅需1.5小时）、检测效率高、准确性高、假阳性低等。本发明试剂盒可以特异地检测到所有H7亚型的禽流感病毒，对其它亚型的禽流感病毒亚型不具有特异性，为禽流感病毒H7亚型疫情的监测、防控提供强有力的技术支持，有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明阳性样品进行FQ-PCR检测灵敏度扩增曲线图；

图2为本发明阳性对照进行FQ-PCR检测特异性扩增曲线图；

其中，曲线1为禽流感病毒H7亚型阳性对照特异性扩增曲线，曲线2，包含11条曲线，代表禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H9亚型、新城疫病毒、SPF鸡阴性喉气管、心肌、胸肌、脑、肺脏、尿囊液、分泌物及排泄物扩增情况；

图3为本发明阳性样品进行FQ-PCR检测敏感性扩增曲线图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

在本发明中，术语Ct（Cycle threshold）值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

荧光素介绍：

FAM、VIC、JOE、HEX、TAMRA、MGB；

FAM：羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，广泛存在于荧光标记试剂盒，也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。

VIC：绿色荧光蛋白，Greenfluorescent protein，GFP，是源于海洋生物多管水母属(AequoriaVictoria)的一种发光蛋白。

HEX：六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。适用于Argon-ionLaser激发光源，Abs/Em=535/556nm。

JOE：羧基-4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素，Carboxy-4′,5′-dichloro-2′，JOE荧光产量高，pH敏感性弱，适合于标记蛋白。

TAMRA：全称羧基四甲基罗丹明，即Carboxytetramethylrhodamine，是罗丹明类荧光素衍生物，TAMRA是少数几个能用于标记蛋白的。

ROX：5-和6-羧基-X-罗丹明，校正染料。

Cy3或Cy5，Modification，是新的荧光分子，具有较好的光稳定性、高水溶性和高荧光效率。它们的激发光谱和发射光谱峰值分别为548/562nm与646/664nm。Cy3和Cy5的分子结构和分子量都非常相似，但两者之间的光谱却分得很开，因此，Cy3和Cy5常被用于很多双色实验中，如被广泛应用于基因芯片和蛋白质芯片领域。

NED：2’-氯-5’-氟-7’，8’-苯-1,4-二氯-6-羧基荧光素

MGB：小沟结合物Minor Groove Binder；MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团（NonFluorescent Quencher），本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，使探针设计的成功率大为提高，短的探针比长的更容易设计。

本发明实验材料的来源：

生物材料：

禽流感病毒H7亚型（三株）、禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H9亚型、新城疫病毒，由中国动物疫病预防控制中心惠赠。

申请人声明，以上生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。

本发明试剂的来源及规格：

AgPath-ID^TM One-step RT-PCR Kit，包括RT-PCR反应缓冲液、酶混合液和无菌无核酸酶水，购自ABI life technology公司。

RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司

带有小沟结合物(minor groove binder,MGB)的不发光的荧光淬灭基团由上海基康生物技术有限公司合成。

本发明实时荧光RT-PCR（FQ-PCR）扩增引物和TaqMan MGB探针由上海基康生物技术有限公司合成。

实施例1：特异性引物和探针的筛选试验

1.禽流感病毒H7亚型的引物与探针设计

本发明人设计了针对禽流感病毒H7亚型的多对实时荧光RT-PCR（FQ-PCR）扩增引物和TaqMan MGB探针，由上海基康生物技术有限公司合成。具体序列例如表1所示。

表1：用于禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR筛选的引物和探针

2.禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件

禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的反应体系见表2，反应条件见表3。

表2：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法反应体系

表3：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的反应条件

3.结果判定

（1）结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

（2）结果描述及鉴定

对比不同引物对与探针组合的扩增情况，遵循特异性原则，敏感性原则和最高扩增原则，选定特异性好，敏感性高，可靠性好的猪瘟野毒株检测用引物对与探针最佳组合。

（3）筛选试验方法与结果

引物与探针的优化筛选方法如下：

任意选择一对引物与一条探针进行组合（如引物对AIV-H7-F1/AIV-H7-R1，加上探针AIV-H7-P1；引物对AIV-H7-F1/AIV-H7-R2，加上探针AIV-H7-P1；引物对AIV-H7-F2/AIV-H7-R1，加上探针AIV-H7-P1；等等），以能同时获得最小的Ct值和最高的扩增效率（根据荧光PCR仪提供的“PCR Efficiency”数据报告，数值越高扩增效率越高）为筛选标准，选出最佳引物与探针组合。

通过多次重复、对比试验，选定禽流感病毒H7亚型检测用引物对与探针的最佳组合，组合筛选结果图略，具体序列见表4。

表4：引物对与探针的优选组合

实施例2：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测方法的优化

1.禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计

禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的引物与探针设计参见实施例1，具体序列见表4。

2.禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的反应体系及条件

禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的优化原则是：通过优化以下各个条件使同一样本获得最大的扩增效率和最小的Ct值。

（1）最佳荧光引物浓度的确定：荧光引物浓度在300nM到800nM之间进行筛选。

（2）最佳探针浓度的确定：探针浓度在100nM到500nM之间进行筛选。

（3）反转录酶的用量确定：反转录酶的用量在1U到5U之间进行筛选。

（4）Taq DNA聚合酶的用量确定：Taq DNA聚合酶的用量在1U到5U之间进行筛选。

经过优化，禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR方法的反应体系见表5，反应条件见表6。

表5：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测体系

表6：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测扩增条件

3.结果判定

（1）结果分析条件设定

读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，以显示结果为准。

（2）质控标准

阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线；

阳性对照的Ct值应≤30，且出现特异性扩增曲线。否则，此次实验视为无效。

（3）结果描述及判定

阴性样本无Ct值并且无特异性扩增曲线，表示样本中无禽流感病毒H7亚型。

阳性样本Ct值≤30，且出现特异性扩增曲线，表示样本中有禽流感病毒H7亚型。

待测样品检测结果的判定标准：

无特异性扩增曲线为阴性结果；

有特异性扩增曲线的情况下，样本Ct值≤30判断为阳性，被检样品30＜Ct≤35并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品Ct值＞35时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性。

（4）样本检测试验及结果

试验对禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H9亚型、新城疫病毒、SPF鸡阴性喉气管、心肌、胸肌、脑、肺脏、尿囊液、分泌物及排泄物进行扩增，结果只有禽流感病毒H7亚型得到特异性的荧光扩增曲线（图2）。结果显示，本发明的引物对和探针的特异性非常好。

实施例3：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒组成

1.RT-PCR反应缓冲液：每个反应包括反应缓冲液（含MgCl₂和dNTP）12.5μL，分装至1mL血清管，750μL/管，-20℃保存；

2.荧光探针和引物：每个反应包括引物（AIV-H7-F1和AIV-H7-R2）和探针AIV-H7-P1终浓度分别为600nM和240nM，-20℃保存；

3.酶混合液：每个反应包括高效反转录酶和热启动Taq酶，-20℃保存；

4.无菌无核酸酶水：分装至0.5mL血清管，600μL/管，：-20℃保存；

5.阳性对照：禽流感病毒H7亚型H7N2的特异克隆HA区约200bp的片段体外逆转录获得，Ct值<30，-20℃保存。

6.阴性对照：SPF鸡胚尿囊液，经灭活后得到，-20℃保存。

7.裂解液：45mL/瓶，室温保存。

8.洗液1：45mL/瓶，室温保存。

9.70%乙醇：42mL/瓶，室温保存。

10.洗液2：55mL/瓶，室温保存。

11.洗脱液：10mL/瓶，室温保存。

12.吸附柱和收集管：室温保存。

实施例4：实施例3制备的试剂盒的使用方法

1 样品制备

1.1 样品采集：病死或扑杀禽，取喉气管、脑、胸肌、心肌和肺等病变部与健康部交界处组织；待检活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%甘油生理盐水中。2～8℃保存，送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。）

1.2 样品处理：每份样品分别处理。

1.2.1 组织样品处理：取组织病变部与健康部交界处组织称取组织0.02g于研磨器中研磨，加入生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中。

1.2.2 全血样品处理：待血凝后取血清100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

1.2.3 阳性对照处理：取阳性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

1.2.4 阴性对照处理：取阴性对照100μL，置1.5mL灭菌离心管中。

2 操作步骤

2.1 病毒RNA的提取

2.1.1 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600μL（使用前1mL裂解液中加入10μL β-巯基乙醇），充分颠倒混匀，加入700μL 70%乙醇，立即混匀。

2.1.2 吸取700μL1.1中液体加入吸附柱中，12000rpm离心15s，弃去收集管中的液体，套上收集管；将1.1中剩余液体，继续加入到吸附柱中，12000rpm离心15s，弃去收集管中的液体，套上收集管。

2.1.3 向吸附柱中加入700μL洗液1，12000rpm离心15s，弃去收集管中液体，套上收集管。

2.1.4 向吸附柱中加入500μL洗液2，12000rpm离心15s，弃去收集管中液体，套上收集管。

2.1.5 向吸附柱中再加入500μL洗液2，12000rpm离心2min，弃去收集管和收集管中液体。

2.1.6 将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在吸附柱的膜中央加入洗脱液50μL（移液器枪头请勿接触到膜），室温静置1min，12000rpm离心1min，获得总RNA。

其中，所述已处理的样品是指经过将待检样品的组织研磨、匀浆后离心，取上清液；如果待检样品是全血则待血凝后取血清。

3 实时荧光RT-PCR操作

3.2.1 反应体系配制

设被检样品RNA、阴性对照和阳性对照总和为N，则反应体系配制如下：

无菌无核酸酶水      4.4（N+1）μL

RT-PCR反应缓冲液    12.5（N+1）μL

酶混合液            1（N+1）μL

荧光探针            2.1（N+1）μL

将以上配制的反应体系充分混匀后，分装每个反应管中各20μL。

3.2.2 扩增

分别取2.1.6中已溶解的病毒RNA5μL，加入相应反应管中，混匀并作好标记，在荧光PCR仪上进行以下反应：45℃ 10min，95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 45s，在每个循环第二步（60℃ 45s）收集FAM荧光信号，共40个循环。（报告基团“FAM”，淬灭基团“NONE”）。

4 结果判定

4.1 结果分析条件设定

阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。

4.2 结果描述及判定

阳性对照Ct值≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，实验结果成立；

无特异性扩增曲线为阴性结果；

有特异性扩增曲线的情况下，被检样品Ct值≤30并出现特定的扩增曲线为AIV-H7阳性；被检样品30＜Ct≤35并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品Ct值＞35时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，应为阴性。

实施例5：实施例3制备的试剂盒的效果验证

1.特异性试验

按照实施例3制备20130409、20130411、20130416三个批号的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，分别禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H9亚型、新城疫病毒、SPF鸡阴性喉气管、心肌、胸肌、脑、肺脏、尿囊液、分泌物及排泄物进行特异性试验，检测结果均为阴性（图2）。以上结果充分证明该试剂盒具有很好的特异性。

2.灵敏度试验

禽流感病毒H7N2亚型（血凝价为256），根据实施例4RNA提取方法进行提取，对得到的RNA进行10^-1到10^-7梯度稀释，检测其灵敏度，结果见表7及图1。

表7：禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏度结果

由Ct值可知10^-1－10^-6间的Ct值与模板拷贝数的对数呈线性关系，相邻两个模板浓度间的Ct值相差约3.3，与理论上计算的模板浓度相差10倍，Ct值相差3.3相符。

3.敏感性实验

按照实施例3制备的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，对不同来源的三株禽流感病毒H7N2亚型，根据实施例4RNA提取方法进行提取，检测结果均为阳性，结果见图3。

4.重复性试验

使用20130409、20130411、20130416三个批次的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，按照实施例4的使用方法对禽流感病毒H7N2亚型及2个10倍连续稀释的RNA分别进行3次重复检测，以确定此方法的批内重复性；3批试剂盒对同样的稀释样品进行检测，以确定此方法的批间重复性。结果见表8。

表8：三批试剂盒重复性试验结果

检测结果显示：批内变异系数及批间变异系数分别为0.39%－2.50%和0.65%－2.00%，均小于5%，说明20130409、20130411、20130416这3批试剂具有很好的批间可重复性。

5.稳定性试验

使用20130409、20130411、20130416三个批次的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，按照实施例4的使用方法对3个样本，每月进行一次检测，每批做3个重复，持续6个月，检测试剂盒的稳定性。结果显示：20130409、20130411、20130416三个批号的禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，6个月内的Ct值变化不大，说明禽流感病毒H7亚型实时荧光RT-PCR检测试剂盒在6个月内具有很好的稳定性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种检测禽流感病毒H7亚型的引物对，其特征在于，引物对包含如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

2.一种检测禽流感病毒H7亚型的探针，其特征在于，所述探针包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，其为自身淬灭探针，该探针5’端标记有荧光发射基团，3’端标记有带有小沟结合物MGB的不发光的荧光淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的探针，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种。

5.包含权利要求1所述的引物对和权利要求2～4任一所述的探针的组合物。

6.一种用于检测禽流感病毒H7亚型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求5所述的组合物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含RT-PCR反应缓冲液、酶混合液、阳性对照和阴性对照，所述酶混合液包括反转录酶和热启动Taq酶，所述阳性对照为采用禽流感病毒H7N2的特异克隆HA区200bp的片段体外逆转录获得；所述阴性对照为经灭活SPF鸡胚尿囊液所得。

8.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，将引物对和探针溶于一起；所述引物对和探针终浓度分别为600nM和240nM。

9.一种禽流感病毒H7亚型实时荧光PCR检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物对和权利要求2～4任一所述的探针。

10.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）使用权利要求1所述的引物对和权利要求2～4任一所述的探针；

（2）用荧光发射基团标记探针的5’端，用带有小沟结合物MGB的不发光的荧光淬灭基团标记探针的3’端，所述荧光发射基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5中的一种；

（3）将用于检测禽流感病毒H7亚型的引物和探针溶于一起，并置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

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