CN106048094A - 猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量pcr检测试剂盒及引物和探针 - Google Patents

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Abstract

本发明一种用于检测猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物、TaqMan探针。本发明建立了针对gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR方法，能够快速鉴别伪狂犬病野毒株(同时含有gB基因和gE基因)与基因缺失株(仅含有gB基因)，并可对病毒拷贝数进行精确定量。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高，将在猪伪狂犬病毒的检测、毒株鉴定及疫苗生产中发挥作用。

Description

猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量PCR检 测试剂盒及引物和探针
技术领域
本发明属于动物病原检测领域，涉及鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的方法，特别涉及一种用于鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR检测方法及其专用引物、TaqMan探针、检测试剂盒以及所述引物、探针在检测猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株中gB基因和gE基因中的应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)引起的B类传染病(OIE认定)，分布广泛，危害严重，可以感染不同年龄段的猪，但以妊娠母猪和哺乳仔猪感染最为严重，导致妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎，哺乳仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭死亡，死亡率高达100％。目前，伪狂犬病已成为对全球养猪业危害最大的传染病之一，每年给养猪业造成了巨大的经济损失。
伪狂犬病毒属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科，基因组为双链DNA分子，大小约150kb，成熟病毒粒子携带50余种蛋白，其gB、gE、gG、gI、TK等毒力基因是其复制非必需基因，其编码的蛋白为非必需糖蛋白，缺失这些基因后，其复制扩增及抗原性并不受任何影响，但毒力却大大降低。gE基因是伪狂犬的主要毒力相关基因，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的首选缺失基因。目前，欧美等发达国家应用gE基因缺失疫苗及其配套的鉴别诊断方法已实现了伪狂犬的净化，中国也已广泛使用gE基因缺失弱毒疫苗用于伪狂犬的预防和控制。gB基因是伪狂犬病毒复制所必需的基因，在野毒株与基因缺失株中均存在。
目前，国内外常用的实验室诊断伪狂犬病毒的方法主要包括病毒分离、兔体接种实验、抗体诊断、病原学诊断、分子生物学诊断等几大类，其中分子生物学诊断中的实时荧光定量PCR检测技术以其快速、简便、准确等优点成为快速发展的检测手段。
实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的，该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[Heid CA,Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.1996Oct；6(10):986-94.]。实时荧光定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。与常规PCR相比该技术可快速、灵敏的检测病毒RNA和DNA以及细菌DNA，目前该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、以及动物病原体的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定等领域[Jozefczuk J,Adjaye J.Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression.Methods Enzymol.2011；500:99-109.]。目前针对gB基因和gE基因建立的双重qPCR检测方法较少，Ma等根据PRV gB和gE基因分别设计引物和探针，建立了诊断PRV野毒株的荧光定量PCR方法，该方法对PRV野毒株具有良好的扩增效果，而对疫苗缺失株及其他常见猪病原的检测均为阴性[文献1：Development ofreal-time polymerase chain reaction assays for rapid detection anddifferentiation of wild-typep seudorabies and gene-deleted vaccine viruses，MaW，LagerKM，Richt JA，et al.J Vet DiagnInvest，2008，20(4):440－447.]。马兴杰等针对gB、gE和gG建立了的鉴别诊断PRV强弱毒的纳米PCR检测方法并组装了试剂盒，试验结果表明，该试剂盒具有较高的灵敏性、特异性及可重复性，检验结果可靠[文献2：鉴别猪伪狂犬病毒gE/gB/gG的纳米PCR及荧光定量PCR方法的建立及评价，马兴杰，中国农业科学院学位论文]。虽如此，由于病毒变异的风险客观存在，更丰富的检测技术有助于防范病毒变异所导致的检测失利，本发明利用自主设计的引物和探针建立了猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的鉴定、检测方法，与其它学者的引物和探针具有差异性。
发明内容
本发明的第一个目的是提供用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物与TaqMan探针，以实现猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的鉴别。
本发明所提供的用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物为：
用于检测gB基因的上游引物(gB-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，用于检测gB基因的下游引物(gB-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
用于检测gE基因的上游引物(gE-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：3所示，用于检测gE基因的下游引物(gE-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。
由上述引物衍生的引物序列也属于本发明内容。所述衍生序列是指在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
本发明所提供的用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，用于检测gB基因的TaqMan探针(PRV-gB)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示；用于检测gB基因的TaqMan探针(PRV-gE)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
由上述TaqMan探针序列的衍生序列也属于本发明内容。所述衍生序列是指在SEQID NO：5和SEQ ID NO：6的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。
所述PRV-gB的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA；所述PRV-gE的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。
为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。
本发明的第二个目的是提供用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的试剂盒。
本发明所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
具体来讲，所述试剂盒包括以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL(购于TakaRa公司)，gB-F(20μM)0.5μL，gB-R(20μM)0.5μL，gE-F(20μM)0.5μL，gE-R(20μM)0.5μL，PRV-gB(10μM)1μL，PRV-gE(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。
为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪伪狂犬病野毒株基因组DNA和猪伪狂犬病毒基因缺失株基因组DNA或分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE，所述阴性对照为不含猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
本发明的第三个目的是提供一种用上述双重实时荧光定量PCR检测试剂盒及双重实时荧光定量PCR技术对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行定性、定量检测的方法。
利用本发明所提供的试剂盒对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测，可包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE作为标准品，分别10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝(copies)/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在上述引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在上述引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；
3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对gB基因和gE基因定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含猪伪狂犬病毒gB基因和gE基因的拷贝数，实现定量检测。
利用以上检测结果，本发明提供一种鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的方法，在上述步骤后还包括：
4)结果判定：
结果判定方法1：阳性对照样品CT值＜38，阴性对照样品CT值≥38时检测成立，待测样品CT值＜38时判定结果为阳性，CT值≥38时则判定结果为阴性，若样品中检测到猪伪狂犬病毒的gB基因和gE基因均为阳性，则判定样品为猪伪狂犬病野毒株；若样品中检测到gB基因为阳性，gE基因为阴性，则判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株；
结果判定方法2：根据荧光信号的变化，对待测样品中的gB基因和gE基因进行定性检测，同时出现gB基因和gE基因的荧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病野毒株，只出现gB基因荧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株。
在上述方法中，所述步骤2)中的待测样品主要包括：血清、病毒细胞培养物。
所述步骤1)和步骤2)中的25μL双重实时荧光定量PCR反应体系可包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL(购于TakaRa公司)，gB-F(20μM)0.5μL，gB-R(20μM)0.5μL，gE-F(20μM)0.5μL，gE-R(20μM)0.5μL，PRV-gB(10μM)1μL，PRV-gE(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。引物稀释为20ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。TaqMan探针稀释为10ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。
所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光定量PCR反应条件可为：先95℃预变性2min；然后95℃变性15s，60℃退火30s，共45个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
本发明提供了一种鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒与检测方法。本发明的试剂盒中含有两对引物和两条探针，引物和探针分别针对猪伪狂犬病病毒的gB基因和gE基因的保守区设计。本发明通过建立针对gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR方法，能够鉴别伪狂犬病野毒株(同时含有gB基因和gE基因)与基因缺失株(仅含有gB基因)，并可对病毒拷贝数进行精确定量。本发明可为疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗提供有力依据，确保疫苗接种的安全性和合理性，对猪伪狂犬疫苗的生产具有指导作用。本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强，将在猪伪狂犬病毒的检测及疫苗生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为gB、gE基因双重实时荧光定量PCR检测gB基因的标准品扩增曲线；
图2为gB、gE基因双重实时荧光定量PCR检测gB基因的标准品标准曲线；
图3为gB、gE基因双重实时荧光定量PCR检测gE基因的标准品扩增曲线；
图4为gB、gE基因双重实时荧光定量PCR检测gE基因的标准品标准曲线；
图5为gB、gE基因双重实时荧光定量PCR检测特异性实验的扩增曲线；
图6为gB、gE基因实时荧光定量PCR引物与探针筛选的扩增曲线。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物由华大基因公司合成，TaqMan探针由Takara公司合成。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、设计对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针
从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得猪伪狂犬病野毒株的gB基因(GenBank号：NC_006151)和gE基因(GenBank号：AF207700)的序列，用DNA Man软件进行比对后，根据引物设计原则，分别对gB基因和gE基因各设计3对引物对用于PCR扩增，通过电泳结果各自筛选到引物特异性高、扩增效果好的引物对，确定gB基因特异性的引物对序列为自5’端第17211-17574位碱基，gE基因特异性的引物对序列为自5’端第443-1357位碱基；在此基础上再用Primer Express 6.0软件对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株在该片段范围进行双重实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针，各设计2对引物探针，并通过单重荧光定量PCR进行优选，最终确定最优的gB基因特异性的引物探针序列为自5’端第17411-17543位碱基，gE基因特异性的引物探针序列为自5’端第1060-1143位碱基。
引物和探针优选过程：分别对所设计的2对gB基因和gE基因(gB1、gB2；gE1、gE2)荧光定量引物与探针进行单重实时荧光定量PCR，所用反应体系与反应条件如下：
1)25μL单重实时荧光定量PCR反应体系可包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL(购于TakaRa公司)，上游引物F(20μM)0.5μL，下游引物R(20μM)0.5μL，探针(10μM)1μL，RNA-free H2O8.5μL。引物稀释为20ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。TaqMan探针稀释为10ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。
2)单重实时荧光定量PCR反应条件可为：先95℃预变性2min；然后95℃变性15s，60℃退火30s，共45个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
反应结束后比较CT值和平台期所能达到的扩增值，筛选出较好的gB基因和gE基因荧光定量引物与探针。实时荧光定量PCR扩增曲线见图6。
经过优选，本发明确定的对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株进行双重实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针序列如下：
gB基因上游引物(gB-F)：5’-GGATCTCGCTGTAGTCCAGGAG-3’(SED ID NO：1)
gB基因下游引物(gB-R)：5’-GAGGTGCCCGAGACGATCAG-3’(SED ID NO：2)；
gE基因上游引物(gE-F)：5’-CTCGTGATGACCCACAAAGG-3’(SED ID NO：3)
gE基因下游引物(gE-R)：5’-CTTGATGACCGTGACGTACTC-3’(SED ID NO：4)；
gB基因TaqMan荧光探针(PRV-gB)：5’-(FAM)TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA(TAMRA)-3’(SED ID NO：5)
gE基因TaqMan荧光探针(PRV-gE)：5’-(ROX)CGCCACCTGGGACTACACGCT(BHQ2)-3’(SED ID NO：6)。
PRV-gB的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA；PRV-gE的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。
实施例2、用本发明的引物及TaqMan探针对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测
一、提取待测样品的基因组DNA
对灭活的猪伪狂犬野毒株与基因缺失株的细胞培养物以及收集的12份临床疑似血清病料提取基因组DNA，具体方法包括以下步骤：
(1)分别取200μL灭活的伪狂犬野毒株与基因缺失株细胞培养物以及临床血清加入到1.5mL离心管中，加入1mL DNAzol裂解液振荡混匀，静置10分钟裂解；
(2)12000rpm离心10分钟，取上清约800μL至新的1.5mL离心管中，加入500μL无水乙醇，轻轻混匀静置5分钟，使DNA析出；
(3)12000rpm离心10分钟，弃上清，加入800μL 75％乙醇洗涤DNA沉淀，轻轻混匀后12000rpm离心5分钟；
(4)重复上一步骤；
(5)弃上清，待离心管中残留液体晾干后，加入20μL无酶水溶解DNA沉淀，-20℃冻存备用。
二、猪伪狂犬病毒gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立
1、PCR扩增猪伪狂犬病毒gB基因和gE基因
对步骤一提取的猪伪狂犬病毒野毒株基因组DNA进行PCR扩增，分别得到猪伪狂犬病毒gB基因(引物为gB-F和gB-R)和gE基因(引物为gE-F和gE-R)的目的片段，25μL反应体系如下：
表1 gB基因和gE基因的PCR扩增体系
试剂名称 体积(μL)
Green master mix(购自Promega公司) 12.5
上游引物(20μM) 0.5
下游引物(20μM) 0.5
DNA模板 2.0
RNA-free H2O 9.5
2、标准品制备
将纯化回收的猪伪狂犬病毒gB基因和gE基因目的片段分别克隆至pGEM-T载体(购自Promega公司)中，构建成重组质粒，并筛选阳性重组质粒送华大基因公司测序，验证质粒构建知否成功。测序结果表明获得了序列正确的分别携带gB基因和gE基因的重组质粒，分别命名为pGEM-gB和pGEM-gE。
3、双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立
对测序正确的分别携带gB基因和gE基因重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE用Nanodrop测定浓度，并计算各标准品的拷贝数，按照10倍梯度将gB基因和gE基因标准品分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，每个样品做2个重复，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测。
双重实时荧光定量PCR的反应体系(25μL)如下：
表2 gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR反应体系
试剂名称 体积(μL)
Premix Ex Taq(Probe qPCR)(购自TakaRa公司) 12.5
gB-F(20μM) 0.5
gB-R(20μM) 0.5
gE-F(20μM) 0.5
gE-R(20μM) 0.5
PRV-gB(10μM) 1.0
PRV-gE(10μM) 1.0，
DNA模板 2.0
RNA-free H2O 6.5
双重实时荧光定量PCR的反应条件为：先95℃预变性2min；然后95℃变性15s，60℃退火30s，45个循环。
标准品的双重实时荧光定量PCR扩增曲线如图1(gB基因)和图3(gE基因)所示，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线，图中八组线条从左向右对应的标准品浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL。检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线，标准曲线如图2(gB基因)和图4(gE基因)所示，相关系数分别为R2＝0.998与R2＝0.993，误差较小，标准曲线可用，由标准曲线得到的线性方程为：
y＝-0.998x+37.806(gB基因)和y＝-0.993x+42.716(gE基因)。
4、猪伪狂犬病临床血清病料的双重实时荧光定量PCR检测
用本发明建立的猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量PCR检测试剂与方法，对所收集的12份临床疑似血清病料进行检测，分别以灭活的猪伪狂犬病野毒株细胞培养物和基因缺失株细胞培养物为阳性对照，以无酶水为阴性对照，根据gB基因和gE基因双重实时荧光定量PCR检测结果，对临床样本所感染的猪伪狂犬病毒的类型进行判定，并对所感染病毒的拷贝数进行定量。
结果如表3所示，所检测的12份疑似血清中有2份血清判定为阴性(不含gB基因和gE基因，即未感染猪伪狂犬病毒)，10份血清判定为阳性(感染猪伪狂犬病毒)，其中4份血清为猪伪狂犬病野毒株感染(含gB基因和gE基因)，6份血清为猪伪狂犬病基因缺失株感染(仅含gB基因，缺失gE基因)。
表3 疑似血清病料的双重实时荧光定量PCR检测结果
实施例3、本发明检测方法的特异性实验
按照实施例2所述方法对猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)提取RNA并进行反转录，对猪圆环病毒2型(PCV2)、鼻气管炎病毒(IBR)直接提取DNA，同时以灭活的猪伪狂犬病野毒株细胞培养物为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的特异性。
检测结果如图5所示，阳性对照gB基因和gE基因的CT值分别为20/21(＜38)，结果阳性；阴性对照CT值为41/40(≥38)，试验成立；而猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、鼻气管炎病毒(IBR)的CT值均>38，且未出现特定的扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测出猪伪狂犬病野毒株。
实施例4、本发明检测方法的灵敏度实验
按照实施例2所述，将gB基因和gE基因标准品按照10倍梯度分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的灵敏度。
结果gB基因和gE基因的扩增曲线如图1和图3所示，显示gB基因和gE基因的双重实时荧光定量PCR检测均可以检测至1×101copies/μL，灵敏度较高，与文献2检测灵敏度相当。
实施例5：鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒
基于实施例1和2，本发明所提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
具体来讲，该试剂盒包括以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL(购于TakaRa公司)，gB-F(20μM)0.5μL，gB-R(20μM)0.5μL，gE-F(20μM)0.5μL，gE-R(20μM)0.5μL，PRV-gB(10μM)1μL，PRV-gE(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。
为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为猪伪狂犬病野毒株基因组DNA和猪伪狂犬病毒基因缺失株基因组DNA或分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE；阴性对照为不含猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
试剂盒中各试剂的使用可参考实施例2的内容。

Claims (10)

1.用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物，是基于猪伪狂犬病野毒株的gB基因的特异性保守序列自5’端第17411-17543位碱基和gE基因的特异性保守序列自5’端第1060-1143位碱基作为检测序列，通过软件设计得到。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于：用于检测gB基因的上游引物(gB-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，用于检测gB基因的下游引物(gB-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；用于检测gE基因的上游引物(gE-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：3所示，用于检测gE基因的下游引物(gE-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO：4所示。
3.用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(OF-P)，是基于猪伪狂犬病野毒株的gB基因的特异性保守序列自5’端第17411-17543位碱基和gE基因的特异性保守序列自5’端第1060-1143位碱基作为检测序列，通过软件设计得到。
4.根据权利要求3所述的TaqMan探针(OF-P)，其特征在于：用于检测gB基因的TaqMan探针(PRV-gB)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示，用于检测gB基因的TaqMan探针(PRV-gE)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
5.根据权利要求4所述的TaqMan探针(OF-P)，其特征在于：所述PRV-gB的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为TAMRA；所述PRV-gE的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2；为防止PCR扩增时被延伸，所述探针的3’端已经磷酸化处理。
6.用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括权利要求1或2和权利要求3或4或5所述的用于对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行双重实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针。
7.根据权利要求4所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量PCR反应液PremixEx Taq(Probe qPCR)12.5μL(购于TakaRa公司)，gB-F(20μM)0.5μL，gB-R(20μM)0.5μL，gE-F(20μM)0.5μL，gE-R(20μM)0.5μL，PRV-gB(10μM)1μL，PRV-gE(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。
8.根据权利要求6或7所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为猪伪狂犬病野毒株基因组DNA和猪伪狂犬病毒基因缺失株基因组DNA或分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE，所述阴性对照为不含猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
9.权利要求6或7或8所述的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒的应用，该应用为对猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的gB基因和gE基因进行定性、定量检测，检测包括以下步骤：
1)建立标准曲线：将分别携带猪伪狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重组质粒pGEM-gB和pGEM-gE作为标准品，分别10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝(copies)/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1所述引物和权利要求2或3所述TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在所述引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；
3)用得到的CT值或荧光信号的变化实现对gB基因和gE基因定性检测，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含猪伪狂犬病毒gB基因和gE基因的拷贝数，实现定量检测；
所述步骤1)和步骤2)中的25μL双重实时荧光定量PCR反应体系包括：模板2μL，实时荧光定量PCR反应液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，gB-F(20μM)0.5μL，gB-R(20μM)0.5μL，gE-F(20μM)0.5μL，gE-R(20μM)0.5μL，PRV-gB(10μM)1μL，PRV-gE(10μM)1μL，RNA-freeH2O 6.5μL；双重实时荧光定量PCR反应条件为：先95℃预变性2min；然后95℃变性15s，60℃退火30s，共45个循环。
10.一种鉴别猪伪狂犬病野毒株与基因缺失株的方法，在权利要求9所述步骤后还包括：
4)结果判定：
结果判定方法1：阳性对照样品CT值＜38，阴性对照样品CT值≥38时试验成立，待测样品CT值＜38时判定结果为阳性，CT值≥38时则判定结果为阴性，若样品中检测到猪伪狂犬病毒的gB基因和gE基因均为阳性，则判定样品为猪伪狂犬病野毒株；若样品中检测到gB基因为阳性，gE基因为阴性，则判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株；
结果判定方法2：根据荧光信号的变化，对待测样品中的gB基因和gE基因进行定性检测，同时出现gB基因和gE基因的荧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病野毒株，只出现gB基因荧光扩增曲线判定样品为猪伪狂犬病毒基因缺失株。
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