CN106435023B - 一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒包括一对引物和一条特异性荧光探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明试剂盒能够特异性的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒，并具有较高的灵敏度，抗干扰能力强，广泛性强，重复性优，可以精准评估和诊断母猪猪传染性胃肠炎病毒带毒排毒、仔猪感染情况，还可开展猪传染性胃肠炎疾病的净化和效果评估等，具有十分广泛的应用价值。同时本发明的试剂盒检测过程简便，需要仪器设备简单，检测时间短；结果相对可靠，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；可以相对容易质量控制，易于标准化。

Description

一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光 PCR试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。

背景技术

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的猪腹泻病，是具有高度接触性、高死亡率、危害较大的传染病，可导致2-3周龄以下的仔猪发生严重的腹泻和呕吐，5周龄以上的猪发病率和死亡率较低。本病已广泛存在于欧洲、美洲、亚洲各国，20世纪60年代首次在我国猪群中发现该病。在我国，该病主要以暴发性和地方流行性两种形式发生，2010年以来流行情况及危害程度日趋加深。TGEV经常与猪流行性腹泻病毒(PEDV)及猪轮状病毒(PoRV)发生混合感染，给TGEV的诊断带来了困难。TGEV是成套病毒目冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属具有囊膜的单链正向RNA病毒。TGEV有3种主要的结构蛋白，分别是纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)。

现有技术检测TGEV的方法包括血清学和分子诊断方法，血清学诊断方法包括以下方法：(1)中和试验(SN)。1969年，Carbrey等人建立了中和试验(SN)。病毒感染动物，动物机体的淋巴细胞识别到病毒抗原表面的抗原决定簇后，产生了对应的中和抗体。这些抗体和病毒粒子特异性的结合，进一步阻止病毒粒子对动物机体的入侵和损害。感染TGEV的病猪，血清抗体通常1周后产生，并且抗体在动物体内停留时间久，因此能够用血清SN来检测该病。血清中和试验具有快速检测的特点，然而该方法可能出现假阳性，特异性不强，可对大批量样品进行巧步筛选。(2)免疫荧光法。1979年，钱永清等人建立了用免疫荧光技术诊断TGE的方法，进一步提供了快速栓测TGEV的方法。结果表明，多数接种TGEV的细胞其细胞膜和胞浆中出现黄绿色的巧光，阴性对照组细胞则被染成了红色。(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)。ELISA现已被广泛用于TGEV的检测中，包括间接ELISA、双夹ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA和抗体捕捉ELISA等。外国学者也运用阻断ELISA方法对TGEV和PRCV的抗体进行鉴别诊断，结果与SN结果对比，发现阻断ELISA方法和病毒中和试验的结果具有良好相关性，该ELISA方法具有良好的敏感性和特异性，但目前很少在临床中使用。

分子诊断方法包括以下方法：(1)环介导等温扩增技术。Chen等人针对TGEV N基因保守的核酸片段设计了6种特异性引物，建立了TGEV N基因的LAMP检测方法，该方法具有很高的特异性，与其他病毒无交叉反应，比传统PCR灵敏度离10倍。(2)聚合酶链式反应检测技术(PCR)。李军等人针对TGEV S基因序列设计合成了一对引物，建立了RT-PCR诊断方法并进行了临床应用，并做了平行试验，符合率为89％，证明了建立的该RT-PCR法更敏感，检测结果更优。Paton等人根据TGEV和PRCV的S基因设立了一对引物，建立了RT-PCR法，该方法利用两种病毒S基因扩增产物长度不同，可将二者进行鉴别。同时，与病毒分离和抗原检测ELISA作对比，RT-PCR法具有更高的灵敏度，此方法可以用于进一步确认对经过免疫筛选试验(如FAT、ELISA)的样品。PCR技术大大提高TGEV诊断的敏感性和特异性，但是与实时荧光定量PCR相比，PCR方法灵敏性相对不足，操作过程中也相对易污染。(3)实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR能对病毒进行绝对和相对定量，在多方面发挥作用：用于疾病的检测；实时监测细胞培养病毒含量；用于病毒增殖动态的研讨；对TGEV活疫苗病毒含量进行实时监测以评价疫苗效用。

但是以上血清学诊断方法存在以下缺点：(1)对猪群中存在的免疫耐受现象评估较困难，相对不能更加有效、直观和高精准反映猪群的抗体水平。(2)无法定量，易出现假阳性，且血样采集需要多人协助，且需要特殊设备，采集过程相对比较费时。原因在于：①血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；②血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平；③血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；④血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。

而分子诊断方法，不论普通PCR和荧光PCR方法存在以下缺陷和不足：(1)检测过程复杂，技术要求高，易出现假阳性，环境污染严重；(2)分子诊断对样品组织嗜性要求严格，如：传染性胃肠炎病料需要采集粪便或肠道，采集样品要求严格；(3)该诊断方法仅能评估本样品的情况，而无法同步精准诊断2个猪群的情况等；(4)普通PCR除存在以上缺点外，还无法定量，操作繁琐等。

猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质。通过采用从仔猪脐带血中检测TGEV来评价母猪感染TGEV的情况，同时诊断出生仔猪感染猪传染性胃肠炎的发病情况，更加科学、直接有效诊断方法，采集脐带血诊断是指导产房仔猪腹泻的防控最为有效的诊断方法。当前在规模化猪场出现疑似猪传染性胃肠炎的疫情后，通常诊断方法是送检患病猪的病料，包括患猪肠道淋巴结、肠道内容物和新鲜粪便，利用普通PCR或荧光PCR方法进行检测，根据检测结果，结合该猪场其他情况给出诊断报告并制定疫病防控计划。但是由于目前所用普通PCR或荧光PCR方法存在以上的缺陷，导致诊断结果对猪场疫病防控的指导意义有一定的局限性。

在实际生产中，由于TGEV病毒不能很好的适应细胞，且细胞病变不显著，病毒分离难度大；TGEV感染与PEDV感染的临床症状几乎一样，很难进行临床鉴别诊断；但在脐带血运用荧光PCR检测技术检测TGEV，是疾病的预警、诊断和评估最为有效的诊断方法，而快速精准检测脐带血中的猪传染性肺肠炎病毒难度相对很大，由于1)溶血因素对检测效果影响极大，2)TGEV病毒属于单股正链RNA病毒，易变异，3)无论PCR和荧光PCR技术存在以上方法的缺陷。对于疾病的诊断和防控，需要建立一种快速鉴别检测脐带血猪传染性肺肠炎病毒的方法，不仅可以对母猪疫苗株的安全评价及仔猪疾病的快速准确诊断，及时制定防控计划，具有十分重要的临床意义，而且可根据脐带血检测结果评估猪群TGEV野毒感染状况，开展猪传染性胃肠炎疾病的预警、诊断，达到规模化猪场猪传染性胃肠炎疾病的防控。因此，亟待建立一种可以精准检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于提出一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、抗溶血、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，通过检测脐带血中的TGEV，能同时反映母、仔猪猪传染性胃肠炎病毒带毒和排毒状况，母猪健康状况，评估母猪猪传染性胃肠炎疫苗的免疫效果，有益于对群体猪传染性胃肠炎疾病的预警、诊断和免疫情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的预警、防控工作。

基于上述目的，本发明提供的一种检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

特异性荧光探针：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中，Y＝C/T，FAM为荧光报告基因，TAMRA为荧光淬灭基因。

特异性荧光探针中Y为兼并碱基，使本发明的检测方法的检测范围更广泛。

合理的引物设计和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。

利用本发明的引物和探针建立的实时荧光PCR方法能鉴别猪脐带血中的猪传染性胃肠炎病毒疫苗株和野毒株。采用实时荧光PCR方法鉴别猪脐带血中的猪传染性胃肠炎病毒疫苗株和野毒株，关键是需要针对两者所存在的序列差异片段，设计得到特异性的引物和探针。

TGEV感染与PEDV感染的临床症状几乎一样，很难进行临床鉴别诊断；TGEV病毒不能很好的适应细胞，且细胞病变不显著，病毒分离难度大；对于疾病的诊断和防控，需要建立一种快速鉴别诊断TGEV的方法。但是TGEV病毒属于单股正链RNA病毒，近些年来TGEV病毒已发生变异，所以设计检测范围更广泛、特异性更强的引物和探针难度很大。发明人针对TGEV在NCBI公布的全部基因序列，进行基因序列的比对，发现TGEV的三种基因片段(3b基因、N基因和S基因)相对比较保守，然后分别对3b基因、N基因和S基因进行引物和探针的设计，并根据扩增结果最终筛选得到本发明的引物和探针，该引物和探针的广泛性和特异性强，灵敏性好，用于扩增TGEVS基因，检测结果能特异性区分TGEV与猪流行性腹泻病毒(PEDV)。

本发明引物和探针设计在TGEVS基因上，考虑到扩增的TGEV的范围更宽，设计兼并碱基，即本发明的引物和探针含有兼并碱基，因此该引物和探针的广泛性和特异性强，灵敏性好，用于扩增S基因，检测结果能特异性区分TGEV疫苗毒和TGEV野毒，并能够特异性区分TGEV与PEDV。

另外，结合猪胎盘的生理结构，猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，即使母源抗体(如IgG，12nm)都不能通过此胎盘屏障，所以成熟的PEDV粒子，PEDV病毒的直径为60-160nm，很难直接穿越胎盘屏障感染胎儿，也是一道天然的保护屏障。

总之，采用从仔猪脐带血中检测TGEV-S基因来评价母猪猪传染性胃肠炎野毒带毒和排毒状况，仔猪在母猪体内感染状况和反馈母猪的健康状况，是一种更加科学、直接和有效的诊断猪传染性胃肠炎疾病、评估猪传染性胃肠炎疫苗保护力水平和疾病预警方面的方法之一，在规模化猪场的猪传染性胃肠炎病的预警、防控过程中起到更加可靠的科学技术支撑。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:2。

在本发明中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.3～0.5μM。

在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×荧光定量Mixture。

在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O；所述阳性对照为含有猪传染性胃肠炎病毒S基因序列的克隆质粒pEASY-T1-TGEV-S，克隆质粒pEASY-T1-TGEV-S的终浓度为1.0×10⁵copies/μl～1.0×10⁷cop-ies/μl。

在本发明中，优选的，所述猪传染性胃肠炎病毒S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，优选的，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪传染性胃肠炎病毒S基因序列，示的引物序列扩增猪传染性胃肠炎病毒S基因序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-TGEV-S。

进一步的，本发明还提供了所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)使用所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：

0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；

0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；

0.4μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL；

2×荧光定量Mixture：10μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：补足至20μL；

PCR的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸2sec，收集荧光，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应；

(2)结果分析：

根据扩增结果判定：阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤38时，则结果判定成立；Ct值≤40，则判断为猪传染性胃肠炎病毒阳性；无Ct值显示，则判断为猪传染性胃肠炎病毒阴性，猪传染性胃肠炎病毒疫苗免疫成功。

在本发明中，优选的，所述RNA模板采用以下方法制备得到：

(1)取50-100mg猪脐带血置1.5ml EP管中，加入1ml裂解液充分匀浆，室温静置10min；

所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％；

(2)加入0.6ml异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；

(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(4)加入0.5ml异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(6)加入1ml质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速电泳检测RNA完整性。

在本发明中，脐带血溶血对荧光PCR检测会产生影响，使用盐酸胍、SDS、吐温-20和NP-40、异丙醇等核酸提取试剂，可以解决脐带血溶血的问题。

在本发明中，为了防止核酸污染引起假阳性，在荧光PCR扩增体系中加入UNG酶防污染体系，确保了检测结果的真实性。

更进一步的，本发明还提供了所述的试剂盒在制备检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂中的用途。

本发明应用qPCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒的工作原理：由于猪属于上皮绒毛胎盘，母猪和胎儿独立血液循环系统，之间存在血胎盘屏障的缘故，正常的“脐带血”是不含病原体和抗体物质的即无存在任何各种病原的相关的基因片段，因此可通过检测“脐带血”中是否存在猪TGEV来判断带毒不发病母猪的情况，评价母猪的免疫水平及带毒情况，评估仔猪感染猪TGEV情况。具体步骤为：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取：按商业试剂盒说明书操作；(4)qPCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行qPCR反应；(5)判定结果。

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下有益效果：

(1)采用本发明设计的引物和探针所建立的实时荧光PCR方法可对仔猪脐带血中的猪传染性胃肠炎病毒野毒感染情况做诊断，从而可以评价母猪猪传染性胃肠炎疫苗的保护力，而且可以预测和预警仔猪感染猪传染性胃肠炎病毒野毒的状况，为疾病防控提供有效的科学依据。

(2)本发明的的实时荧光PCR方法更能直接，有效、综合评价疫苗免疫母猪后的效果，与传统的血清学抗体检测评估相比更具有优势，该法也是血清学抗体评估疫苗效果的有效的补充，是非常好的疫苗评估质量、免疫效果和免疫程序优化的有力工具，可进一步推广和临床应用。

(3)使用本发明的的实时荧光PCR方法进行仔猪脐带血检测，即可鉴别猪传染性胃肠炎病毒野毒株和猪传染性胃肠炎病毒疫苗株，根据鉴别结果制定相应的防控策略，最终达到最终净化该病的目的。

(4)本发明的实时荧光PCR方法具有特异性强、灵敏度高、抗干扰能力强、广泛性强、可重复性好等优点。该方法检测过程中需要仪器设备相对简单，不需要电泳仪、凝胶成像系统及其分析软件；检测过程简便，检测时间短，做一次病原检测仅需要3小时；结果相对可靠，不需要电泳，空气中气溶胶相对较少，不易污染；技术操作要求低，可以在基层大量推广；可以相对容易质量控制，易于标准化。

附图说明

图1为本发明检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的流程图；

图2为本发明样品中模板RNA的非变性琼脂糖电泳图；其中，M：Marker，泳道1-6：样品中模板RNA；

图3为本发明阳性对照10倍稀释的梯度标准曲线；

图4为本发明敏感性检测结果图；

图5为本发明特异性检测结果图；

图6为本发明重复性检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

实施例1

本发明诊断猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的流程图如图1所示。具体包括以下步骤：(1)样品采集；(2)样品处理；(3)RNA提取；(4)qPCR：利用本发明设计的特异性引物和探针进行qPCR反应；(5)判定结果。

1.样品采集

(1)脐带血样品采集

a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；

b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；

注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；

c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；

d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。

(2)病料样品(扁桃体、肾脏、肺脏和淋巴结等)

A、剖解取内脏：将患病猪剖解，取出完整的上述内脏，放置在同一个干净塑料袋内。

B、记录：将装有内脏的塑料袋密封，贴标签并记录发病猪的日龄、体重、品种、临床症状等信息。

C、将采集的病料样品集中送至实验室，并附上所记录的信息。

2.样品中模板RNA提取

具体步骤如下：

(1)取50-100mg猪脐带血置1.5ml EP管中，加入1ml裂解液充分混匀，室温静置10min；

裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS，其在裂解液中的质量分数为0.1-0.2％；③吐温20，其在裂解液中的质量分数为1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的质量分数为1-2％；

(2)加入0.6ml异丙醇和10μL磁珠(购自赛默飞公司)，振荡15s，静置2min；

(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(4)加入0.5ml异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(6)加入1ml质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速电泳检测RNA完整性。

本发明在RNA提取环节中，使用盐酸胍、SDS、吐温－20，NP－40，异丙醇和质量百分比浓度为70％的乙醇溶液等洗涤，可以有效降低去除溶血的干扰，获得高质量的核酸。

依据上述方法提取6份随机脐带血样品总RNA，RNA经非变性琼脂糖电泳后均能形成3条清晰条带，分别为28S、18S与5.8/5S，条带间拖带不明显，不见明显蛋白和DNA污染，表明RNA提取完整，结果见图2。

RNA经核酸蛋白检测仪检测，浓度均能达到175ng/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之间，表明RNA纯度高、完整性好，具体数据见表1。

表1 RNA质量检测结果

样品编号	体积(μl)	浓度(ng/μl)	总量(μg)	A260/A280	质量评价
						001	50	260	13.0	1.90	合格
002	50	258	12.9	1.92	合格
						003	50	238	11.9	1.93	合格
004	50	210	10.5	1.91	合格
						005	50	175	8.8	1.96	合格
006	50	318	15.9	1.95	合格

3.引物和荧光探针的的筛选

采用实时荧光PCR方法检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒，其引物和探针设计是关键。TGEV感染与PEDV感染的临床症状几乎一样，很难进行临床鉴别诊断；TGEV病毒不能很好的适应细胞，且细胞病变不显著，病毒分离难度大；TGEV病毒属于单股正链RNA病毒，病毒的直径为60-160nm。近些年来TGEV病毒已发生变异，所以设计检测范围更广泛、特异性更强的引物和探针难度很大。发明人针对TGEV病毒的3种基因片段(3b基因、N基因和S基因)进行三组引物和探针的设计，具体见表2，并根据扩增结果进行三组引物和探针的对比。

表2

为了使扩增的TGEV基因的范围更宽，设计兼并碱基，根据扩增结果进行比较分析，最终选择敏感性非常好的第三组引物和探针，用于扩增TGEV的S基因。最终筛选到的特异性引物和特异性荧光探针序列如下：

上游扩增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’(SEQ ID NO:1)；

下游扩增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’(SEQ ID NO:2)；

特异性荧光探针：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA(SEQ ID NO:3)，其中，Y＝C/T，FAM为荧光报告基因，TAMRA为荧光淬灭基因。

上述引物和特异性荧光探针由华大基因合成并进行标记，用于扩增猪传染性胃肠炎病毒S基因序列，目的片段为134bp左右，猪传染性胃肠炎病毒S基因的核苷酸序列如下所示。

GCTGAAGGTGCTATTATATGCATTTGCAAGGGCTCACCACCTACTACCACCACAGAATCTAGTTTGACTTGCAATTGGGGTAGTGAGTGCAGGTTAAACCATAAGTTCCCTATATGTCCTTCTAATTCAGAGGC(SEQ ID NO:4)。

4.阳性对照质粒的构建与制备

(1)按照商业试剂盒操作说明书提取猪传染性胃肠炎病毒RNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增猪传染性胃肠炎病毒S基因序列，反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性15Sec，58℃退火2Sec，62℃延伸20Sec，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；

(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit胶回收试剂盒回收，然后酶切后与同样酶切的pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-T1-TGEV-S。

克隆质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒。根据蛋白核酸测定仪测定A260和A280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数，克隆质粒终浓度为1.0×10⁵copies/μl～1.0×10⁷copies/μl。

5.本发明试剂盒的成分

上游扩增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’(SEQ ID NO:1)；

下游扩增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’(SEQ ID NO:2)；

特异性荧光探针：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA(SEQ ID NO:3)，其中，Y＝C/T，FAM为荧光报告基因，TAMRA为荧光淬灭基因。

阳性对照：含有猪传染性胃肠炎病毒S基因序列的克隆质粒pEASY-T1-TGEV-S；

阴性对照：无DNA酶的ddH₂O；

2×荧光定量Mixture(含UNG酶系统)。

在本发明中，为了防止核酸污染引起假阳性，在荧光PCR扩增体系中加入UNG酶防污染体系，确保了检测结果的真实性。

6.标准曲线的制作

对克隆质粒进行10倍梯度稀释，使其为：10⁸-10¹copies/μl，每个梯度重复三次进行实时荧光定量PCR。根据扩增结果制作标准曲线。图3为本发明阳性对照10倍稀释的梯度制作标准曲线图，其中该标准曲线的参数如下：斜率：-3.31921，截距：41.79840，相关系数：-0.99970，扩增效率：1.00114。制作标准曲线的相关系数R2大于0.99，斜率位于-3.3－-3.4之间，PCR扩增效率E位于1.0－1.1之间。

7.诊断猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒

本发明的实时荧光PCR反应体系和实时荧光PCR的反应条件如下：

(1)实时荧光PCR反应体系以20μL计为：

0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；

0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；

0.4μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL；

2×荧光定量Mixture(TOYOBO Mixture)：10μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：补足至20μL。

混匀后盖好管盖，转移到扩增区。

同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照克隆质粒：2μL，其余组分相同；阴性对照无DNA酶的ddH₂O：2μL，其余组分相同。

(2)实时荧光PCR的反应条件

95℃预变性1min；94℃变性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸20Sec，收集荧光，共45个循环；然后25℃延伸10Sec，最后4℃保护，结束反应。

8.结果分析：

根据扩增结果判定：每次试验的过程都要加入阳性对照及阴性对照。在阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤38时，则结果判定成立，即阳性结果出现典型的扩增曲线；并且制作的标准曲线如图3所示，R2大于0.99，斜率位于-3.3－-3.4之间，PCR扩增效率E位于1.0－1.1之间。

若Ct值≤40，则判断为猪传染性胃肠炎病毒阳性，即仔猪脐带血中感染猪传染性胃肠炎病毒野毒，表明母猪存在排毒现象，疫苗保护力存在一定不足，建议加强免疫接种或调整免疫程序；若无Ct值显示，则判断为猪传染性胃肠炎病毒阴性，即仔猪脐带血中没有感染猪传染性胃肠炎病毒，表明猪传染性胃肠炎疫苗免疫母猪保护力很好，且仔猪无感染猪传染性胃肠炎病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。若阳性对照Ct值>38或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。

实施例2灵敏度研究

以阳性对照克隆质粒评价本发明的试剂盒的灵敏度，将克隆质粒进行10倍梯度稀释，检测范围为10⁸-10¹copies/μl。结果表明，该方法的检测范围为10⁸-10¹copies/μl，在此范围的猪传染性胃肠炎病毒含量可以得到可靠的结果，即该方法的灵敏度可以检测到10个拷贝的猪传染性胃肠炎病毒病毒含量的样品。检测结果见图4。

实施例3特异性研究

为了检测本发明试剂盒的特异性，利用本发明的试剂盒检测猪细小病毒，猪轮状病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪圆环病毒，猪流行性腹泻病毒，猪乙型脑炎病毒，猪伪狂犬病毒等7种病毒。

检测结果表明：本发明的试剂盒仅对仔猪脐带血中TGEV S基因进行扩增，表明本发明试剂盒能特异性扩增TGEV，而不与其它核酸发生交叉反应。检测结果见图5。

实施例4重复性研究

选用阳性对照克隆质粒10⁶、10⁵、10⁴个copies/μl,对每个浓度的样本做3个重复，结果不同核酸浓度的检测Ct值标准差≤0.13和≤0.09，变异系数≤0.46％，具有较好的重复性。检测结果见表3和图6。

表3实时荧光PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的重复性试验

质粒拷贝数(copies/μl)	10<sup>6</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>4</sup>
				Ct1	21.43	24.81	28.16
Ct2	21.6	24.96	28.27
				Ct3	21.49	25.03	28.42
Ct mean	21.51	24.93	28.28
				SD	0.09	0.11	0.13
CV	0.40％	0.45％	0.46％

实施例5准确性研究

同时采用本发明的试剂盒以及普通PCR对各10份已知阳性和阴性样品进行检测以及对未知的临床73份仔猪脐带血进行检测，检测结果见表4和表5。

(1)已知阳性和阴性样品各10份的临床验证

表4采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较

(2)未知的临床73份脐带血检测结果

表5采用本发明试剂盒以及普通PCR对临床样品进行检测结果的比较

从表4和表5中可以看出：本发明实时荧光PCR检测阳性样品与普通PCR检测阳性样品的结果100％符合，但实时荧光PCR检测比普通PCR检测更敏感，且临床症状表现是一致的。

综上可见，本发明设计的一对特异性引物和一条荧光探针以及构成的试剂盒可以快速诊断猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒，并能鉴别猪传染性胃肠炎病毒疫苗株和野毒株，同时能与猪流行性腹泻病毒区分开来，而且该检测方法简单、快速、抗干扰能力强、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒在制备检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂中的用途，该试剂盒包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：

上游扩增引物：5’-GCTGAAGGTGCTATTATATGC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游扩增引物：5’-GCCTCTGAATTAGAAGGAC-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

特异性荧光探针：FAM-5’-CTCACCACCTAYTACCACCAC-3’-TAMRA，其为SEQ ID NO:3序列，其中，Y＝C/T，FAM为荧光报告基因，TAMRA为荧光淬灭基因；

该试剂盒的检测结果能特异性区分猪传染性胃肠炎病毒疫苗毒和猪传染性胃肠炎病毒野毒，并能够特异性区分猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒；

所述猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的RNA模板采用以下方法制备得到：

(1)取50-100mg猪脐带血置1.5mlEP管中，加入1ml裂解液充分匀浆，室温静置10min；

所述裂解液的成分及配比如下：①盐酸胍4-6M；②十二烷基磺酸钠SDS 0.1-0.2％；③吐温20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％；

(2)加入0.6ml异丙醇和10μL磁珠，振荡15s，静置2min；

(3)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(4)加入0.5ml异丙醇，将EP管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

(5)将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(6)加入1ml质量百分比浓度为70％的乙醇溶液，轻轻洗涤沉淀；将EP管放入磁力架吸附1-2min，弃掉液体；

(7)晾干，加入适量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速电泳检测RNA完整性。

2.根据权利要求1所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为3:3:2。

3.根据权利要求2所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.3～0.5μM。

4.根据权利要求1所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×荧光定量Mixture。

5.根据权利要求4所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH₂O；所述阳性对照为含有猪传染性胃肠炎病毒S基因序列的克隆质粒pEASY-T1-TGEV-S，克隆质粒pEASY-T1-TGEV-S的终浓度为1.0×10⁵copies/μl～1.0×10⁷copies/μl。

6.根据权利要求5所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎病毒S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示的引物序列扩增猪传染性胃肠炎病毒S基因序列，示的引物序列扩增猪传染性胃肠炎病毒S基因序列酶切后与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-TGEV-S。

8.根据权利要求1所述的检测猪脐带血猪传染性胃肠炎病毒的Taqman实时荧光PCR试剂盒的用途，其特征在于，使用方法包括以下步骤：

(1)使用权利要求1-7任一项所述的实时荧光PCR试剂盒进行PCR扩增时，实时荧光PCR反应体系以20μL计为：

0.3μM的SEQ ID NO:1所示的上游扩增引物：0.6μL；

0.3μM的SEQ ID NO:2所示的下游扩增引物：0.6μL；

0.4μM的SEQ ID NO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL；

2×荧光定量Mixture：10μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：补足至20μL；

PCR的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性15Sec，58℃退火45Sec，62℃延伸2sec，收集荧光，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应；

(2)结果分析：

根据扩增结果判定：阴性对照扩增无Ct值，阳性对照扩增Ct值≤38时，则结果判定成立；Ct值≤40，则判断为猪传染性胃肠炎病毒阳性；无Ct值显示，则判断为猪传染性胃肠炎病毒阴性，猪传染性胃肠炎病毒疫苗免疫成功。

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