CN106498091B - 一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诊断猪猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:4所示。本发明的引物组还可用于制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒包括外套引物、内套引物、阴性对照、阳性对照、2×PCR Mixture。本发明的引物组以及包含该引物组的试剂盒能够特异性地诊断猪脐带血病毒野毒株，并能特异性区分猪瘟疫苗毒和猪瘟病毒野毒，而且能将猪瘟病毒与牛病毒性黏膜腹泻病毒和羊边界病毒区分开来，并具有较高的灵敏度，可重复性好，检测结果真实可靠。该方法检测过程简便，检测时间短，结果判定简单。

Description

一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组 的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。
背景技术
猪瘟病毒(CSFV)是属于黄病毒科、瘟病毒属的成员。猪瘟病毒具有高度传染性和致病性，会引发猪只大量死亡而造成养猪业的严重损失。猪只从感染猪瘟病毒至显示临床症状前，就可能排出大量病毒。若动物耐过急性或亚急性感染，会产生抗体或转为慢性感染病例，后者终其一生会持续性或间歇性的排毒，直到死亡为止。若怀孕母猪感染猪瘟病毒，病毒可穿过胎盘感染胎儿，导致流产、木乃伊胎或死产。如果感染发生在怀孕中期(约第50-70天)，可能产出弱仔或持续性毒血症的仔猪。这些持续性感染的仔猪会因为本身无法产生正常的免疫反应来对抗病毒(免疫耐受)，而成为持续传播病毒的传染源。
目前常用血清学(ELISA)方法诊断猪瘟病毒野毒株，但是血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平；血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增技术作为最基本的基因扩增技术，现在广泛应用于分子生物学的各个领域，在病毒诊断领域也得到了广泛的应用。然而其扩增结果受限于检测对象的模板含量，当模板量很少时，常常获得阴性结果。在猪脐带血猪瘟病毒诊断领域，猪脐带血中的猪瘟病毒量通常很低，使用传统的常规PCR检测技术通常由于其灵敏度不够而出现假阴性结果，无法满足要求。巢式PCR扩增技术是一种建立在常规PCR技术上的新技术，其设计两套PCR引物(巢式引物)对模板进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，以此扩增产物作为模板用内引物进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性(因为与两套引物都互补的模板很少)因而增加了检测的敏感性，同时又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。
胎盘(Placenta)通常是指尿膜绒毛膜与子宫黏膜发生联系所形成的结构，包括两部分，即尿膜绒毛膜的绒毛部分为胎儿胎盘，子宫黏膜部分为母体胎盘。胎儿的血管和子宫血管各自分布到自己的胎盘部分上去，但并不直接相通。脐带血通常是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。
在实际生产中，快速精准检测脐带血中的猪瘟病毒野毒株难度相对很大，急需建立一种快速的脐带血猪瘟病毒野毒株的诊断方法，不仅可以对母猪疫苗株的安全评价及仔猪疾病的快速准确诊断，及时制定防控计划，具有十分重要的临床意义，而且可根据脐带血检测结果评估猪群CSFV野毒感染状况，开展猪瘟疾病的净化，达到规模化猪瘟野毒感染为阴性。因此，亟待建立一种可以精准诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的方法。
巢式PCR连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增，特别在第二轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，引物与引物之间发生连接引起非特异性扩增。因此，采用巢式PCR方法诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株，关键是需要根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计得到特异性引物，并避免引物与引物之间发生连接引起非特异性扩增。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用，利用本发明的引物组所建立的巢式PCR方法具有灵敏度高、特异性好、可重复性好、检测结果快速客观准确等优点，可以快速诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株。
基于上述目的，本发明提供的一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组，所述引物组由内外两套引物组成，外套引物由外套上游引物和外套下游引物组成，内套引物由内套上游引物和内套下游引物组成，各引物的核苷酸序列如下所示：
外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，其为SEQ ID NO:3序列；
内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’，其为SEQ ID NO:4序列。
上述引物序列中简并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基。
本发明还提供了所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。
进一步的，本发明还提供了一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物组。
在本发明中，优选的，外套上游引物和外套下游引物的摩尔比为1:1；内套上游引物和内套下游引物的摩尔比为1:1。
在本发明中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×PCR Mixture。
在本发明中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪瘟病毒E2基因片段的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671，阳性对照pEASY-T1-CSFV671质粒的终浓度范围为1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。
在本发明中，优选的，所述猪瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，目的片段为272bp。
在本发明中，优选的，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪瘟病毒E2基因片段，回收片段与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-CSFV671。
进一步的，本发明还提供了所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。
更进一步的，本发明还提供了所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
a.采集经猪瘟疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血，同窝仔猪的脐带血混合后作为样品；
b.提取步骤a中的样品的RNA；
c.以步骤b得到的RNA为模板，使用逆转录试剂盒通过逆转录，得到cDNA；
d.以步骤c得到的cDNA为模板，采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；
e.以步骤d得到的第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的引物序列经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；
f.采用琼脂糖凝胶电泳法对第二轮PCR扩增产物进行分析：①有扩增产物，扩增产物长度为272bp，且阴性对照和阳性对照均成立，则表明所检测的脐带血样品中有猪瘟病毒野毒感染；②没有扩增产物，且阴性对照和阳性对照均成立，则表明所检测的脐带血样品中没有猪瘟病毒野毒感染，猪瘟疫苗免疫成功。
在本发明中，优选的，第一轮PCR扩增时，PCR反应体系以25μL计为：
10umol/LSEQ ID NO:1所示的上游引物：0.5μL；
10umol/LSEQ ID NO:2所示的下游引物：0.5μL；
2×PCR Mixture：12.5μL；
200ng/μL的cDNA模板：2μL；
ddH2O：补足至25μL；
第二轮PCR扩增时，PCR反应体系以25μL计为：
10umol/LSEQ ID NO:3所示的上游引物：0.5μL；
10umol/LSEQ ID NO:4所示的下游引物：0.5μL；
2×PCR Mixture：12.5μL；
第一轮PCR扩增产物的稀释液：2μL；
ddH2O：补足至25μL；
所述第一轮PCR扩增产物的稀释液为第一轮PCR扩增产物用ddH2O做10倍稀释得到的稀释液；
第一轮PCR和第二轮PCR反应条件均为：95℃预变性5min；94℃变性20Sec，57℃退火30Sec，72℃延伸30Sec，共35个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保护，结束反应。
猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，即就是不会存在猪瘟基因即猪瘟也就不存在，而采用脐带血猪瘟疫苗评估，能更加科学有效直接的评价猪瘟疫苗的使用效果。目前市场上使用的猪瘟主要为猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)、猪瘟乳兔组织活疫苗(组织苗)、猪瘟脾淋活疫苗(组织苗)，猪群免疫疫苗后，抗原很快会在母猪体内被识别和清除且不会通过血胎屏障在仔猪脐带血中存在，本发明主要通过检测脐带血中是否含有猪瘟病毒，进而评估判断的疫苗的质量和免疫的效果，精准确定母猪免疫保护力。
在巢式PCR扩增中，第一轮PCR扩增后出现的非特异性扩增和过量的外侧引物均会带入第二轮PCR反应再扩增大约35个循环。使得原本电泳检测不到的非特异性扩增被指数倍地放大到电泳检测水平进而影响后续实验。在巢式PCR中若外侧引物与内侧引物在第二轮PCR时发生连接也会造成非特异性扩增。当然内侧引物的自然连接有时也是引起非特异性扩增的原因。
合理的引物设计是成功应用巢式PCR技术的关键。在巢式PCR引物设计的过程，不仅要考虑引物与模板的特异性结合，还要避免四条巢式引物间形成二聚体。实验因素也可能影响巢式PCR扩增结果，如引物浓度过高、退火温度过低、循环次数过多等。提高退火温度能降低引物与模板间的非特异性结合，也能抑制引物间的自连接，对两类非特异性扩增均有减少的作用。但有时过高的退火温度会影响引物与目的片段的匹配，从而降低PCR反应扩增效率导致产物量下降甚至得不到产物。
基于以上因素，发明人从众多设计的巢式PCR引物组中筛选得到本发明的引物组，该引物组能特异性与模板结合，并且引物之间不会自连接形成二聚体，具有较高的特异性。同时发明人对巢式PCR反应条件进行优化，选择了合适的引物浓度、退火温度、循环数等，扩增得到特异性的猪瘟病毒目的片段。
利用本发明的引物组建立的巢式PCR方法能鉴别猪脐带血中的猪瘟病毒疫苗株和野毒株。采用巢式PCR方法鉴别猪脐带血中的猪瘟病毒疫苗株和野毒株，关键是需要针对两者所存在的序列差异片段，设计得到特异性的引物组。
本发明引物组设计在CSFV开放性阅读框(ORF)上，该引物组含有兼并碱基，因此该引物组的广泛性和特异性强，用于扩增E2基因，检测结果能特异性区分CSFV疫苗毒和CSFV野毒，而且能将猪瘟病毒与牛病毒性黏膜腹泻病毒和羊边界病毒区分开来。
另外，结合猪胎盘的生理结构，猪属于上皮绒毛胎盘，猪胎盘生理正常的结构即血胎屏障，胎盘屏障的存在使正常的脐带血内不存在任何病原和抗体等大分子物质，即使母源抗体(如IgG，12nm)都不能通过此胎盘屏障，是一道天然的保护屏障。
总之，采用从仔猪脐带血中检测CSFV E2基因片段来评价母猪猪瘟野毒带毒和排毒状况，仔猪在母体内感染状况和反馈母猪的健康状况，是一种更加科学、直接和有效的诊断猪瘟疾病、评估猪瘟疫苗保护力水平和疾病预警方面的方法之一，在规模化猪场的猪瘟疾病的净化过程中起到更加可靠的技术支撑。
本发明巢式PCR检测方法的工作原理：猪属于上皮绒毛胎盘，母猪和胎儿独立血液循环系统，之间存在血胎盘屏障的缘故，正常的“脐带血”是不含病原体和抗体物质的即无存在任何各种病原的相关的基因片段，因此，可通过检测“脐带血”中是否存在猪瘟病毒基因来判断母猪免疫猪瘟疫苗后能否有效保护母猪不排毒，仔猪不感染猪瘟病毒，母猪排毒情况即为阳性，进而评价猪瘟疫苗的免疫效果和免疫程序是否合理。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)采用本发明设计的引物组所建立的巢式PCR方法可对仔猪脐带血中的猪瘟病毒野毒感染情况做诊断，从而可以评价母猪猪瘟疫苗的保护力，而且可以预测和预警仔猪感染猪瘟病毒野毒的状况，为疾病防控提供有效的科学依据。
(2)本发明的的巢式PCR方法更能直接，有效、综合评价疫苗免疫母猪后的效果，与传统的血清学抗体检测评估相比更具有优势，该法也是血清学抗体评估疫苗效果的有效的补充，是非常好的疫苗评估质量、免疫效果和免疫程序优化的有力工具，可进一步推广和临床应用。
(3)使用本发明的巢式PCR方法进行仔猪脐带血检测，即可鉴别猪瘟病毒野毒株和疫苗株，还可以将猪瘟病毒与牛病毒性黏膜腹泻病毒和羊边界病毒区分开来，根据鉴别结果制定相应的防控策略，最终达到最终净化该病的目的。
(4)本发明的巢式PCR方法具有特异性强、灵敏度高、可重复性好等优点。该方法检测过程简便，检测时间短，结果判定精准简单。
附图说明
图1为本发明诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的流程图；
图2为本发明实施例A猪场脐带血样品巢式PCR扩增产物琼脂糖电泳图；其中，M：DL2000 DNAMarker，1-6：1#脐带血样品-6#脐带血样品，+：阳性对照，-：阴性对照；
图3为本发明实施例B猪场家脐带血样品巢式PCR扩增产物琼脂糖电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-20：1#脐带血样品-20#脐带血样品，+：阳性对照，-：阴性对照；
图4为本发明实施例C猪场脐带血样品巢式PCR扩增产物琼脂糖电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-14：1#脐带血样品-14#脐带血样品，+：阳性对照，-：阴性对照；
图5为本发明实施例试剂盒特异性试验的PCR扩增产物琼脂糖电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker，+：阳性对照，1-8泳道：分别为CSFV-C、PRRSV、CSFV、TGE、PED、PoRV、BVDV和BDV病毒样品，9-10泳道：为2株CSFV野毒分离株的样品；
图6为本发明实施例试剂盒灵敏度试验的PCR扩增产物琼脂糖电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker，1：阳性对照，2：阴性对照，3-10：分别为质粒pEASY-T1-CSFV671的1-107拷贝数的样品；
图7为本发明实施例试剂盒重复性试验的PCR扩增产物琼脂糖电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-6为CSFV病毒不同批次提取并反转录的cDNA模板。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1
本发明试剂盒用于诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株感染的流程图如图1所示。具体包括以下步骤：(1)脐带血样品采集；(2)脐带血样品处理、核酸RNA的提取及cDNA的反转录；(3)检测脐带血全血中猪瘟病毒E2基因片段；(4)根据检测结果，整理分析猪瘟病毒E2基因片段数据；(5)评估猪猪瘟疫苗的免疫效果。
1.脐带血中猪瘟病毒总RNA的提取
(1)脐带血的采集
脐带血采集包括以下步骤：
a.取干净的青霉素瓶和瓶塞，清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用；
b.当仔猪出生时，将每头母猪分娩的所有仔猪的“脐带血”都挤到一个干净的青霉素瓶中，每头仔猪3-5滴即可，将其“脐带血”挤到青霉素瓶，密封；
注意事项：①必须要采集同窝母猪产的所有的仔猪，避免同窝母猪所产仔猪的个体差异造成漏检；②可以双人操作，也可以单独操作，若仔猪脐带血不便挤出，可以将脐带剪成几段再操作即可；③若母猪分娩出现木乃伊，死胎时，同窝仔猪脐带血重点检测；④弱仔的脐带血可以另外单独再收集一份，重点检测；
c.脐带血收集完后盖好瓶塞，用标签纸或者医用白胶布在青霉素瓶做好标记，注明采集时间、母猪耳号、胎次等信息；
d.将收集的脐带血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷冻保存，送至实验室检测，并附上采集脐带血样品的数量、母猪耳号、需要检测项目的清单。
(2)提取脐带血中猪瘟病毒的总RNA
取脐带血样品200μL，加入1mL trizol，涡旋，混匀，静置5min；50℃水浴消化3h，加入200μL的三氯甲烷，混匀后12000r/min离心15min，取上清，吸取上层液相600μL于一个新的无RNA酶的离心管中，在上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10min沉淀DNA；12000r/min离心10min，沉淀用70％乙醇清洗1次，7500r/min离心5min，沉淀自然干燥10min，30μL的DEPC水溶解RNA。
2.cDNA的逆转录
cDNA逆转录使用Thermo逆转录试剂盒，逆转录体系如下所示：
名称 体积
RevertAid RT 1μL
Ribolock RNase Inhibitor 1μL
dNTP Mixture 2μL
Oligo(dT) 1μL
5×Reaction buffer 4μL
RNA 4μL
DEPC水 加DEPC水至20ul
在PCR仪进行如下操作，42℃，30分钟，70℃，5分钟，4℃，∞，取出逆转录扩增产物，进行巢式PCR扩增实验。
3.引物组的设计
采用巢式PCR方法诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株感染，其内外引物组设计是关键。在GenBank基因库中查找CSFV野毒株的基因序列，然后进行序列比对，找出保守序列区域，并且CSFV疫苗株、牛病毒性黏膜腹泻病毒以及羊边界病毒不具有该保守序列，最终选取猪瘟病毒E2基因保守区域，并设计内外特异性引物组，序列如下：
外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’(SEQ ID NO:1)；
外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’(SEQ ID NO:2)；
内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’(SEQ ID NO:3)；
内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’(SEQ ID NO:4)。
上述引物序列中简并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基。
上述引物由华大基因合成，用于扩增猪瘟病毒E2基因272bp片段，序列如下所示：
TCRWCAACCAAYGAGATAGGGCCACTAGGGGCTGAAGGTCTCACTACCACTTGGAAAGAATACAACCACGGCCTGCAGCTGGACGACGGGACCGTCAGGGCCATTTGCACTGCAGGGTCTTTCAAAGTTACAGCACTTAATGTGGTTAGTAGGAGGTACCTAGCATCATTACATAAGAGGGCTTTGCCCACCTCAGTTACATTTGAACTCCTATTTGATGGGACCACCCCAGCAGTTGAGGAAA TGGGAGATGACTTYGGRTTYGGRCTGTG(SEQ ID NO:5)。
4.阳性对照质粒的构建与制备
(1)按照商业试剂盒操作说明书提取猪瘟病毒RNA；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作为特异性引物扩增猪瘟病毒E2基因序列，反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性15Sec，60℃退火2Sec，62℃延伸20Sec，共45个循环；然后25℃延伸10sec，最后4℃保护，结束反应。PCR产物于2％的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定；
(2)PCR产物的纯化、克隆及序列分析：PCR产物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA GelExcraction Kit胶回收试剂盒回收，然后酶切后与同样酶切的pEASY-T1克隆载体进行连接，连接后转化Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培养基平板上，37℃培养12h-18h。经蓝白斑筛选后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1质粒提取试剂盒提取质粒，然后用引物进行扩增和测序，测序后比对成功的克隆质粒命名pEASY-T1-CSFV671。
克隆质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒。根据核酸蛋白检测仪计测定A260和A280值计算质粒浓度，并换算为质粒拷贝数，克隆质粒终浓度为1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。
5.本发明试剂盒的成分
外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’(SEQ ID NO:1)；
外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’(SEQ ID NO:2)；
内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’(SEQ ID NO:3)；
内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’(SEQ ID NO:4)；
其中简并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基；
阳性对照：含有猪瘟病毒E2基因片段的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671；
阴性对照：无DNA酶的ddH2O；
2×PCR Mixture。
6.采用巢式PCR技术扩增猪瘟病毒E2基因272bp片段
(1)第一轮PCR扩增步骤：以步骤2中的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，反应体系如下(25μL)：
10umol/L的外套上游引物：0.5μL；
10umol/L的外套下游引物：0.5μL；
2×PCRMixture：12.5μL；
cDNA模板：2μL；
加ddH2O补足25uL。
其中，外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’；其中简并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基。
按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪中进行扩增。PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性20Sec，57℃退火30Sec，72℃延伸30Sec，35个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保护，结束反应。
(2)第二轮PCR扩增步骤：取猪瘟外套扩增产物用水做10倍稀释(即1μL PCR扩增产物至9μL水，也可使用灭菌ddH2O来稀释PCR扩增产物)，按外套引物的体系和反应条件进行第二轮PCR扩增。
其中内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’；其中简并碱基R表示A或G碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基。
同时设有阳性对照和阴性对照，阳性对照和阴性对照与待测样品同时进行巢式PCR扩增。阴性对照为无DNA酶的ddH2O；阳性对照为含有外套引物特异性扩增片段(猪瘟病毒E2基因片段)的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671，阳性对照pEASY-T1-CSFV671质粒的终浓度范围为1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。
取10μL第二轮PCR扩增产物跑1.5％琼脂糖胶，观察跑胶结果。在扩增猪瘟病毒E2基因片段，目的片段为272bp，则判断为阳性即CSFV存在，否则为阴性，即检测不到CSFV病毒存在。
7.检测结果的判定
待测样品扩增得到272bp左右的目的片段，同时阴性对照和阳性对照均成立，即阴性对照没有检测到目的片段，阳性对照检测到目的片段，则判断为阳性，即仔猪脐带血中感染猪瘟病毒野毒，表明母猪存在排毒现象，疫苗保护力存在一定不足，建议加强免疫接种或调整免疫程序；若待测样品没有扩增得到272bp左右的目的片段，同时阴性对照和阳性对照均成立，即阴性对照没有检测到目的片段，阳性对照检测到目的片段，则判断为阴性，即仔猪脐带血中没有感染猪瘟病毒野毒，表明猪瘟疫苗免疫母猪保护力很好，且仔猪无感染猪瘟病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。
实施例2
A厂家母猪猪场，猪瘟疫苗均在生产前21天免疫接种，母猪的选择随机分组，为了进一步评估猪瘟疫苗对母猪的保护力效果和仔猪感染情况，故采集6窝分娩母猪的仔猪脐带血，按照实施1所述的方法进行猪脐带血猪瘟病毒野毒株的诊断，评估猪瘟疫苗的免疫效果，仔猪感染猪瘟病毒的情况。结果如图2所示。
从图2中可以看出，阳性对照扩增出272bp条带，阴性对照无272bp条带扩增，样品1-6的脐带血中均无特异性272bp条带扩增，表明样品1-6的脐带血中不存在猪瘟病毒，母猪不存在猪瘟病毒的排毒和仔猪感染现象，母猪健康水平高，进一步表明母猪的猪瘟疫苗免疫效果且免疫程序很好。B厂家猪瘟疫苗相对还是很好的能够有效阻断猪瘟病毒通过血胎屏障侵袭胎儿，这与我国对猪瘟的防控采用全群免疫有关。
实施例3
B厂家母猪猪场，猪瘟疫苗均在生产前21天免疫接种，母猪的选择随机分组，为了进一步评估猪瘟疫苗对母猪的保护力效果和仔猪感染情况，故采集20窝分娩母猪的仔猪脐带血，按照实施1所述的方法进行猪脐带血猪瘟病毒野毒株的诊断，评估猪瘟疫苗的免疫效果，仔猪感染猪瘟病毒的情况。结果如图3所示。
从图3中可以看出，阳性对照扩增出272bp条带，阴性对照无272bp条带扩增，样品1-20的脐带血中均均无特异性272bp条带扩增，表明样品1-20的脐带血中不存在猪瘟病毒，母猪不存在猪瘟病毒的排毒和仔猪感染现象，母猪健康水平高，进一步表明母猪的猪瘟疫苗免疫效果且免疫程序很好。B厂家猪瘟疫苗相对还是很好的能够有效阻断猪瘟病毒通过血胎屏障侵袭胎儿，这与我国对猪瘟的防控采用全群免疫有关。
实施例4
C厂家母猪猪场，猪瘟疫苗均在生产前21天免疫接种，母猪的选择随机分组，为了进一步评估猪瘟疫苗对母猪的保护力效果和仔猪感染情况，故随机采集14窝分娩母猪的仔猪脐带血，按照实施1所述的方法进行猪脐带血猪瘟病毒野毒株的诊断，评估猪瘟疫苗的免疫效果，仔猪感染猪瘟病毒的情况。结果如图4所示。
从图4中可以看出，阳性对照扩增出272bp条带，阴性对照无272bp条带扩增，编号3、8、10、11、13的脐带血样品中扩增出272bp条带，表明3、8、10、11、13的脐带血样品的脐带血中存在猪瘟病毒，表明母猪存在猪瘟病毒的排毒和仔猪可能感染的现象，进一步表明母猪的猪瘟疫苗免疫效果存在问题，建议C场加强母猪的猪瘟疫苗免疫或调整免疫程序，对仔猪做好猪瘟疫苗紧急免疫以防疾病的发生。
实施例5特异性研究
分别提取猪瘟病毒野毒株(CSFV-S)、疫苗株C株(CSFV-C)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGE)、猪流行性腹泻病毒(PED)、轮状病毒(PoRV)、牛病毒性黏膜腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)的核酸为模板，以实施例1所述的方法进行巢式PCR分析，验证SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4所示的上游引物和下游引物的特异性。
结果如图5所示，从图5中可以看出，本发明PCR方法能特异性扩增出猪瘟病毒野毒株CSFV-S，而其它常见病毒，如CSFV-C、PRRSV、CSFV、TGE、PED、PoRV、BVDV和BDV病毒样品均未扩增出基因片段，且设计合成的引物对之间以及引物与其他病毒之间无交叉反应，表明本发明使用的引物特异性高，适合作为巢式PCR引物。
实施例6灵敏度研究
用实施例1所述的方法对10倍梯度稀释的阳性对照质粒pEASY-T1-CSFV671为模板进行检测。结果见图6，图6表明，该PCR方法对阳性对照的DNA模板的最低检出量约为1000个拷贝。
实施例7重复性研究
提取不同批次猪瘟病毒野毒株的基因组RNA，按照实施例1所述的方法进行样品处理，得到的cDNA用本发明的试剂盒进行特异性扩增，产物经1％琼脂糖电泳后观察，评价不同批次样品的扩增重复性好坏，结果见图7，结果表明本发明的试剂盒对不同批次的样品均能有效扩增，扩增重复性较好。
综上可见，本发明设计巢式PCR特异性引物组以及构成的试剂盒可以快速诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株，与猪瘟病毒疫苗株、牛病毒性黏膜腹泻病毒和羊边界病毒及其它常见猪病无非特异性扩增。该检测方法简单、快速、特异性好、灵敏度高、可重复性好，检测结果真实可靠。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>湖南新南方养殖服务有限公司
<120>一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
<130> FI160459-ND
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
agrccagactggtggccntayga 23
<210> 2
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
ttyaccacttctgttctca 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
tcrwcaaccaaygagatagg g 21
<210>4
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400>4
cacagyccraayccraagtcatc 23
<210>5
<211>272
<212> DNA
<213>CSFV E2基因序列
<400>5
tcrwcaaccaaygagatagggccactaggggctgaaggtctcactaccacttggaaagaa 60
tacaaccacggcctgcagctggacgacgggaccgtcagggccatttgcactgcagggtct 120
ttcaaagttacagcacttaatgtggttagtaggaggtacctagcatcattacataagagg 180
gctttgcccacctcagttacatttgaactcctatttgatgggaccaccccagcagttgag 240
gaaatgggagatgacttyggrttyggrctgtg 272

Claims (5)

1.诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括引物组，所述引物组由内外两套引物组成，外套引物由外套上游引物和外套下游引物组成，内套引物由内套上游引物和内套下游引物组成，各引物的核苷酸序列如下所示：
外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，其为SEQ ID NO:1序列；
外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’，其为SEQ ID NO:2序列；
内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，其为SEQ ID NO:3序列；
内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’，其为SEQ ID NO:4序列；
其中，兼并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基；
所述试剂盒的检测结果能特异性区分CSFV疫苗活毒株C株和CSFV野毒，而且能将猪瘟病毒与牛病毒性黏膜腹泻病毒和羊边界病毒区分开来；
所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×PCR Mixture；
所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪瘟病毒E2基因片段的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671，阳性对照pEASY-T1-CSFV671质粒的终浓度范围为1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl；所述猪瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.根据权利要求1所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的应用，其特征在于，外套上游引物和外套下游引物的摩尔比为1:1；内套上游引物和内套下游引物的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的应用，其特征在于，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪瘟病毒E2基因片段，回收片段与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-CSFV671。
4.根据权利要求1-3任一项所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：
a.采集经猪瘟疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血，同窝仔猪的脐带血混合后作为样品；
b.提取步骤a中的样品的RNA；
c.以步骤b得到的RNA为模板，使用逆转录试剂盒通过逆转录，得到cDNA；
d.以步骤c得到的cDNA为模板，采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；
e.以步骤d得到的第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的引物序列经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；
f.采用琼脂糖凝胶电泳法对第二轮PCR扩增产物进行分析：①有扩增产物，扩增产物长度为272bp，且阴性对照和阳性对照均成立，则表明所检测的脐带血样品中有猪瘟病毒野毒感染；②没有扩增产物，且阴性对照和阳性对照均成立，则表明所检测的脐带血样品中没有猪瘟病毒野毒感染，猪瘟疫苗免疫成功。
5.根据权利要求4所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的应用，其特征在于，第一轮PCR扩增时，PCR反应体系以25μL计为：
10umol/LSEQ ID NO:1所示的上游引物：0.5μL；
10umol/LSEQ ID NO:2所示的下游引物：0.5μL；
2×PCR Mixture：12.5μL；
200ng/μL的cDNA模板：2μL；
ddH2O：补足至25μL；
第二轮PCR扩增时，PCR反应体系以25μL计为：
10umol/LSEQ ID NO:3所示的上游引物：0.5μL；
10umol/LSEQ ID NO:4所示的下游引物：0.5μL；
2×PCR Mixture：12.5μL；
第一轮PCR扩增产物的稀释液：2μL；
ddH2O：补足至25μL；
所述第一轮PCR扩增产物的稀释液为第一轮PCR扩增产物用ddH2O做10倍稀释得到的稀释液；
第一轮PCR和第二轮PCR反应条件均为：95℃预变性5min；94℃变性20Sec，57℃退火30Sec，72℃延伸30Sec，共35个循环；然后72℃延伸10min，最后4℃保护，结束反应。
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