CN111647665B - 一种日本血吸虫cfDNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种日本血吸虫cfDNA及其应用。其特征在于，包括四条所述日本血吸虫cfDNA和四组所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物，所述日本血吸虫cfDNA来源于感染日本血吸虫的宿主外周血液，所述日本血吸虫cfDNA核苷酸序列为SEQ NO.1至SEQ NO.4所示，所述检测引物核苷酸序列为SEQ NO.5至SEQ NO.12所示。本发明还公开了一种日本血吸虫cfDNA序列的检测方法。本发明还公开了一种日本血吸虫检测试剂盒。本发明还公开了一种日本血吸虫cfDNA及其应用。本发明提供的四条日本血吸虫cfDNA和检测引物能够有效的在宿主外周血液中检测日本血吸虫感染。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种日本血吸虫cfDNA及其应用。
背景技术
血吸虫病(Schistosomiasis)是一种重要的人兽共患寄生虫病，对人类健康和畜牧业发展造成严重威胁。在我国流行的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)是引起血吸虫病的重要病原。及时有效诊断日本血吸虫感染对于我国血吸虫病的防控具有重要作用。传统的血吸虫检测主要通过从粪便中分离虫卵并在显微镜下检测，该方法耗时且易出现假阳性结果。基于PCR及ELISA检测方法的建立，使检测更加精准，然而，目前存在的日本血吸虫诊断标识分子仍十分有限。cfDNA(circulating cell-free DNA)是外周血液游离的DNA，是肿瘤检测、妊娠诊断等过程中重要的标识分子。
目前，有关日本血吸虫cfDNA作为诊断标识分子的报道十分有限。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种通过高通量测序技术公开日本血吸虫感染宿主后存在于宿主外周血中的特异性cfDNA片段，针对该cfDNA设计引物，采用PCR技术能够快速有效诊断日本血吸虫感染。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是针对存在于宿主外周血中的特异性cfDNA片段，设计引物，采用PCR技术能够快速有效诊断日本血吸虫感染。
为实现上述目的，本发明提供了一种日本血吸虫cfDNA序列，其特征在于，包括四条所述日本血吸虫cfDNA，所述日本血吸虫cfDNA来源于感染日本血吸虫的宿主外周血液，所述日本血吸虫cfDNA核苷酸序列为SEQ NO.1至SEQ NO.4所示。
本发明还提供了一种基于上述日本血吸虫cfDNA序列的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从所述感染日本血吸虫的宿主外周血液中提取cfDNA；
(2)对所述提取cfDNA进行高通量测序；
(3)对所述高通量测序的结果进行生物信息分析。
进一步地，所述步骤(3)中，对所述高通量测序的结果进行生物信息分析包括所述日本血吸虫cfDNA序列和所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物，所述四条日本血吸虫cfDNA对应四组检测引物，所述四组检测引物核苷酸序列为SEQ NO.5至SEQ NO.12所示。
本发明还提供了一种基于上述日本血吸虫cfDNA序列的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取cfDNA：从宿主外周血液中提取cfDNA；
(2)配制PCR体系：将所述提取cfDNA和所述检测引物分别配制PCR管；
(3)PCR扩增反应：将所述配制PCR管置于PCR仪中进行扩增反应；
(4)PCR结果检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增反应结果。
进一步地，所述步骤(1)中，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒完成所述提取cfDNA。
进一步地，所述步骤(2)中，所述PCR扩增反应体系包括2x DreamTaq GreenMaster Mix 12.5μl，上游所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物0.5μl，下游所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物0.5μl，所述提取cfDNA 2μl；所述上游引物和所述下游引物浓度为10μM。
进一步地，所述步骤(3)中，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共循环35次；72℃延伸10分钟；4℃保存。
进一步地，所述步骤(4)中，所述琼脂糖凝胶比例为1.2％-2％。
本发明还提供了一种基于上述日本血吸虫cfDNA序列和所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物在制备日本血吸虫检测产品中的应用。
本发明还提供了一种基于上述日本血吸虫检测产品中的应用制备的一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括所述日本血吸虫cfDNA序列和所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物。
本发明达到了以下有益技术效果：公开了日本血吸虫感染宿主后存在于宿主外周血中的特异性cfDNA片段，针对该cfDNA设计引物，采用PCR技术能够快速有效诊断日本血吸虫感染。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的获得4条日本血吸虫cfDNA的具体步骤示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的感染日本血吸虫小鼠血清28S片段cfDNA PCR检测电泳图；
图3是本发明的一个较佳实施例的感染日本血吸虫小鼠血清R2片段cfDNA PCR检测电泳图；
图4是本发明的一个较佳实施例的感染日本血吸虫小鼠血清S1片段cfDNA PCR检测电泳图；
图5是本发明的一个较佳实施例的感染日本血吸虫小鼠血清S20片段cfDNA PCR检测电泳图；
其中，0-阴性血清cfDNA，1-阳性血清cfDNA，g-日本血吸虫基因组阳性对照，H20-阴性对照。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，均为常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例中所用的材料、仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，获得并鉴定4条日本血吸虫cfDNA并设计特异性检测引物的具体步骤：
将1500条日本血吸虫尾蚴感染新西兰大白兔，28天后，处死兔子，收集血清。采用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒提取cfDNA，对所获得的cfDNA进行高通量测序。对高通量测序的读长(reads)进行生物信息学分析，将所获得的读长定位或比对到兔基因组上，排除兔cfDNA干扰，然后将剩余读长与日本血吸虫基因组比对，去除小于140bp的读长，将剩余读长做Blast，找到包括所述序列SEQ NO.1至SEQNO.4在内的4条日本血吸虫cfDNA片段。
四条日本血吸虫cfDNA序列表：
SEQ NO.1(S1)：
5′-ATCCCAATTCTCTACGGACATACGACATATGTCGGGAGCTAACAATGTAGTTGCTGACGCCTTATCGAGAATACATTCCTTGAATCGTATCCAAGGAATCGACCTTGTTAAACTAGCTCTACTTCAAAGTGAAGATATCGACTTTCATCACGAGTTAGCTGCAACAACGCTCCGACTCCAAACCAAAACGATTGGAAAAGGTAAGAACACTTTAATTTGT-3′。
SEQ NO.2(S20)：
5′-CAGAAGTACATAAACCTTGTGAAGGCTCTTTACTCGAACACTACCAGTCGAGTCAGAGCTTATGGCGAACTGTCATCTGACTTTGCGATCTCAAGTGGTGTCCGTCAAGGCTGCCCACTATCTCCGTTTTTGTTTAATTTTATCATAGACTTGCTACTGGAAGTAACGCTTTCTTCGGCTGAATTTTCTGGGATTGATATCCTTCCAGGAGGTCCACTCATCGACTTAGAATACGCAGACGACATAGTCCTGTTTGGTG-3′。
SEQ NO.3(28S)：
5′-ATAATGGGGTGGGTATGTGTAGACGTTCTTATACGGCGCACGCATTGGAGGTGTGAGGGTCTGCTTGTCAGTGCACTTTCTCAGAGTATTCACCACGACCGGCATTGCTGCCTTTCTACTATGGCCAAACTGATCAGGTTTGACTATTATTGTTGAGCTTGGTTGGGTCGGCAGGTGACTCTTTGGTTCGTAATTAATTATTATGGACCATGAGTGTTACTAACCGGCTGTAGTGGAATTGTGTAGTGTGTCGGAGATGGCGGCTTCACGTGCGTGCTTTGTCCTT-3′。
SEQ NO.4(R2)：
5′-GTGGACTAAGTCATGTTGGTAGATGTAGGCTGCGTGGTTGGGGTCCGCGAGACGAAAGTCACCAATGGTTAGAGACCTTGAACGACATGGCTCAGAATCGTTTGCAATGGCGCAGGTGCATCCACTCTTTGTGTTCTCTCAAAATCTAACCTTCTGAATTCTCTATCTTTCTCCTTTCAAATTTATCTCACTGAATTATACTTTTCAAATCATATCTTCGCTCCCTAATTTTCTGCATTACTGCTAATACTTCTACTATCGC-3′。
针对4种日本血吸虫cfDNA分别获得一组特异性检测引物，如下：
SEQ NO.5(S1 F)：5′-ATCCCAATTCTCTACGGACATACGACATAT-3′
SEQ NO.6(S1 R)：5′-GTCGATATCTTCACTTTGAAGTAGAGCTAG-3′
SEQ NO.7(S20 F)：5′-CTCTTTACTCGAACACTACCAGTCGAGTCA-3′
SEQ NO.8(S20 R)：5′-CGAAGAAAGCGTTACTTCCAGTAGCAAGTC-3′
SEQ NO.9(28S F)：5′-GGGGTGGGTATGTGTAGACG-3′
SEQ NO.10(28S R)：5′-AACCAAAGAGTCACCTGCCG-3′
SEQ NO.11(R2 F)：5′-GAAAGTCACCAATGGTTAGAGACCTTGAACGAC-3′
SEQ NO.12(R2 R)：5′-TGCAGAAAATTAGGGAGCGAAGATATGATTTGA-3′
如图2-图5所示，感染日本血吸虫小鼠血清cfDNA的PCR检测和凝胶电泳图。
第一步：待检血清样品cfDNA提取，取待检血清样品500μl,采用QIAampCirculating Nucleic Acid Kit试剂盒提取cfDNA。提取的cfDNA溶于30μl试剂盒提供的AVE缓冲液中。
第二步：PCR扩增，以所提取的cfDNA为模板，采用cfDNA设计检测引物分别进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为25μl，包括：待检血清样品cfDNA 2μl，DreamTaqGreen MasterMix(2x)12.5μl，0.2μM所示上游引物和0.2μM所示下游引物，用ddH2O补足至25μl。PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟；4℃保存。
第三步：结果分析，PCR扩增结束后，取扩增产物进行1.2％-2％琼脂糖凝胶电泳分析。若结果显示扩增条带与以日本血吸虫基因组为模板扩增出的条带大小一致，则说明样品中检测到日本血吸虫感染。未扩增出条带则说明样品中无日本血吸虫感染。
结果表明采用cfDNA设计的任意一对检测引物均能高效、特异的检测出日本血吸虫感染。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 一种日本血吸虫cfDNA及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 220
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcccaattc tctacggaca tacgacatat gtcgggagct aacaatgtag ttgctgacgc 60
cttatcgaga atacattcct tgaatcgtat ccaaggaatc gaccttgtta aactagctct 120
acttcaaagt gaagatatcg actttcatca cgagttagct gcaacaacgc tccgactcca 180
aaccaaaacg attggaaaag gtaagaacac tttaatttgt 220
<210> 2
<211> 259
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagaagtaca taaaccttgt gaaggctctt tactcgaaca ctaccagtcg agtcagagct 60
tatggcgaac tgtcatctga ctttgcgatc tcaagtggtg tccgtcaagg ctgcccacta 120
tctccgtttt tgtttaattt tatcatagac ttgctactgg aagtaacgct ttcttcggct 180
gaattttctg ggattgatat ccttccagga ggtccactca tcgacttaga atacgcagac 240
gacatagtcc tgtttggtg 259
<210> 3
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataatggggt gggtatgtgt agacgttctt atacggcgca cgcattggag gtgtgagggt 60
ctgcttgtca gtgcactttc tcagagtatt caccacgacc ggcattgctg cctttctact 120
atggccaaac tgatcaggtt tgactattat tgttgagctt ggttgggtcg gcaggtgact 180
ctttggttcg taattaatta ttatggacca tgagtgttac taaccggctg tagtggaatt 240
gtgtagtgtg tcggagatgg cggcttcacg tgcgtgcttt gtcctt 286
<210> 4
<211> 262
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtggactaag tcatgttggt agatgtaggc tgcgtggttg gggtccgcga gacgaaagtc 60
accaatggtt agagaccttg aacgacatgg ctcagaatcg tttgcaatgg cgcaggtgca 120
tccactcttt gtgttctctc aaaatctaac cttctgaatt ctctatcttt ctcctttcaa 180
atttatctca ctgaattata cttttcaaat catatcttcg ctccctaatt ttctgcatta 240
ctgctaatac ttctactatc gc 262
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcccaattc tctacggaca tacgacatat 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcgatatct tcactttgaa gtagagctag 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctctttactc gaacactacc agtcgagtca 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgaagaaagc gttacttcca gtagcaagtc 30
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggggtgggta tgtgtagacg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaccaaagag tcacctgccg 20
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaagtcacc aatggttaga gaccttgaac gac 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgcagaaaat tagggagcga agatatgatt tga 33
Claims (9)
1.一种日本血吸虫cfDNA序列组合，其特征在于，包括四条所述日本血吸虫cfDNA，所述日本血吸虫cfDNA来源于感染日本血吸虫的宿主外周血液，所述日本血吸虫cfDNA核苷酸序列为SEQ NO.1至SEQ NO.4所示。
2.一种扩增权利要求1所述四条日本血吸虫cfDNA的引物组合，其特征在于，所述引物核苷酸序列为SEQ NO.5至SEQ NO.12所示。
3.一种日本血吸虫检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的日本血吸虫cfDNA序列组合和如权利要求2所述的引物组合。
4.如权利要求1所述的日本血吸虫cfDNA序列组合和如权利要求2所述的引物组合在制备外周血中日本血吸虫检测试剂盒中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
a)提取cfDNA：从宿主外周血液中提取cfDNA；
b)配制PCR体系：将所述提取cfDNA和所述检测引物分别配制PCR管；
c)PCR扩增反应：将所述配制PCR管置于PCR仪中进行扩增反应；
d)PCR结果检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测所述PCR扩增反应结果。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤a)中，采用QIAamp CirculatingNucleic Acid Kit试剂盒完成所述提取cfDNA。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤b)中，所述PCR扩增反应体系包括2xDreamTaq Green Master Mix 12.5μl，上游所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物0.5μl，下游所述日本血吸虫cfDNA的PCR检测引物0.5μl，所述提取cfDNA2μl；所述上游引物和所述下游引物浓度为10μM。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤c)中，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共循环35次；72℃延伸10分钟；4℃保存。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤d)中，所述琼脂糖凝胶比例为1.2％-2％。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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