CN102010861A

CN102010861A - 日本血吸虫反转座子dna靶序列在血吸虫病诊断中的应用

Info

Publication number: CN102010861A
Application number: CN2010102365327A
Authority: CN
Inventors: 王升跃; 夏超明; 郑华军; 郭俊杰; 许静
Original assignee: Suzhou University; Shanghai Human Genome Research Center
Current assignee: Suzhou University; Shanghai Human Genome Research Center
Priority date: 2009-07-16
Filing date: 2010-07-16
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2030-07-16
Also published as: WO2011006449A1; CN102010861B

Abstract

本发明公开了日本血吸虫反转座子DNA靶序列在血吸虫病诊断中的应用。具体地，本发明提供了具有选自SEQ ID NO：1-25中任一序列所示的核苷酸序列的反转座子。所述反转座子可作为血吸虫病检测标志物。本发明还提供了特异性扩增所述的反转座子序列的引物(对)。

Description

日本血吸虫反转座子DNA靶序列在血吸虫病诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和遗传学领域，更具体地，本发明涉及血吸虫反转座子及其应用。

背景技术

血吸虫病在非洲、亚洲和南美洲发展中国家严重危害人类健康并造成巨大经济损失。日本血吸虫在生态学和生物学方面明显有别于其它血吸虫，是对人体健康危害最为严重、防治难度最大的血吸虫病之一，在中国已有2100多年的历史。解放初期，广泛流行于我国长江流域的12个省、直辖市和自治区，中间宿主钉螺分布面积148亿平方米。近年来，由于经济体制和长江流域生态环境的变化和流动人口的增加，使得钉螺滋生面积扩大，传染源扩散，我国的血吸虫病疫情出现上升趋势，局部地区明显回升，并向城市逐步蔓延。

血吸虫疫情的反复引起了国家的高度重视，国家卫生部已将其列为4个重大传染病之一。2004年2月国务院成立国家血吸虫病防治工作领导小组，提出了“要抓住源头，综合治理，依靠科技进步，坚决遏制血吸虫病疫情回升势头”的要求。2004年5月召开了全国血吸虫病防治会议中提出，“作好血吸虫病防治工作关系到人民的身体健康和生命安全，关系到社会经济发展和社会稳定。”

血吸虫病的诊断长期以来依赖病原体的直接检测，即检查粪便虫卵作为主要确诊手段之一。由于从粪便中排出的虫卵只占产卵总量的17％，多数发生在晚期病人，虽然在虫卵的检查方法上有了许多的改良，但在流行疫区的实际操作中还是较为繁琐和不便，特别是其诊断的敏感性较差，对早期感染、轻度和反复化疗后的病人的漏检率较高。自上世纪20年代以来，免疫技术已应用到血吸虫病的诊断，例如，用皮内反应诊断血吸虫病，取得了较好的效果。随后，经过广泛的研究和不断的改进，目前已有了几十种免疫学检测方法，而且还发展了检测血吸虫循环抗原和循环免疫复合物的新方法，极大地推动了血吸虫免疫学检测方法的深入发展。

由于血吸虫感染宿主的免疫调节作用，导致感染宿主体内的循环抗原、循环抗原抗体免疫复合物和特异抗体的动态很不一致，到目前为止，还缺乏有效的血吸虫病现症感染诊断手段，特别是疗效考核的方法。

近年来，从日本血吸虫全基因组中发掘反转座子的研究越来越引起人们的重视，许多学者已经做了大量的研究。迄今为止，已知的日本血吸虫反转座子极为有限。

发明内容

本发明的目的在于提供一类血吸虫反转座子。

本发明的另一目的在于提供对应于所述的血吸虫反转座子的引物对和试剂盒。

本发明的另一目的在于提供所述的血吸虫反转座子的应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸具有选自SEQ ID NO：1-25中任一所示的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，其作为血吸虫病检测标志物，或者用于所述的多核苷酸作为血吸虫病检测标志物，或用于制备检测血吸虫的试剂盒或DNA芯片。

此外，本发明的反转座子还可用于：血吸虫遗传关系的确定；血吸虫基因的定位；血吸虫各种或各亚种间的保守性分析；血吸虫的进化分析；或血吸虫的品种或地域种群鉴定。

在另一优选例中，所述的血吸虫是日本血吸虫(Schistosoma japonicum)。

在本发明的第三方面，提供一种引物对，所述引物对扩增获得的扩增产物具有选自SEQ ID NO：1-25中任一所示的反转座子序列。

在另一优选例中，所述的引物(对)是扩增SEQ ID NO：19或10所示核苷酸序列或其片段的引物，更佳地，所示引物(对)具有选自SEQ ID NO：26-29所示的序列或SEQ ID NO：30-31所示的序列。

在本发明的第四方面，提供所述的引物对的用途，它们被用于制备检测血吸虫基因组中是否存在对应于本发明第一方面中所述的反转座子的多核苷酸的试剂盒。

在本发明的第五方面，提供一种确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系的方法，所述方法包括：

(1)以所述的反转座子序列作为标记；

(2)用特异性扩增(1)的反转座子序列的引物，分别对所述两种或多种样品中血吸虫的基因组DNA进行扩增，从而获得相应的扩增产物；

(3)比较两种或多种样品中血吸虫的扩增产物的异同，从而确定两种或多种样品中血吸虫之间的遗传关系。

在另一优选例中，通过电泳分析扩增产物的条带数目和/或位置情况，扩增产物的条带数目和/或位置一致性越高，表示两种或多种血吸虫之间的遗传关系越近；扩增产物的条目数目和/或位置差异越大，表示两种或多种血吸虫之间的遗传关系越远。

在本发明的第六方面，提供一种检测试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第三方面中所述的特异性引物对。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有选自下组的材料：PCR扩增试剂，电泳试剂，或序列分析软件。

在本发明的第七方面，提供一种用于遗传分析的多核苷酸集(set)，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO：1-25中任一序列所示的反转座子序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO：1-25中25种所示的反转座子序列。

在本发明的第八方面，提供了一种DNA芯片，所述DNA芯片具有基片以及固定于所述基片上的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-25中任一所示的反转座子或其特异性片段。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就某一大范围(如10-100)的上限可以与另一优选的较小范围(如20-80)的下限20进行组合，从而构成另一范围(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了SjCHGCS19.P1-P2靶序列的示意图。

图2显示了SjCHGCS19.P1-P2靶序列检测敏感性。图中各泳道如下：M：100bp DNA Ladder分子量标准品；1：未稀释的成虫模板DNA；2～9：分别为1∶10～1∶10⁸稀释后的虫体模板DNA；最高检测灵敏度为1∶10⁷(21.47fg/ul)；10.空白对照。

图3显示了SjCHGCS19.P3-P4靶序列巢式PCR检测敏感性。图中各泳道如下：M∶100bp DNA Ladder分子量标准品；1～8：分别为1∶10～1∶10⁸稀释后的虫体模板DNA。最高检测灵敏度为1∶10⁷(21.47fg/ul)。

图4显示了构建TA克隆质粒DNA检测敏感性。图中各泳道如下：M∶100bpDNA Ladder分子量标准品；1～14：为质粒经1∶10～1∶10¹⁴稀释后的DNA检测结果。结果表明，检测灵敏度为2.02个拷贝(对应于1∶10¹¹的稀释度)。

图5显示了SjCHGCS19.P1-P2靶序列检测特异性。图中各泳道如下：M∶100bpDNA Ladder分子量标准品；1：雄虫；2：肝组织；3：肝吸虫。结果表明，扩增条带的大小为303bp，并且与肝吸虫无交叉反应。

图6显示了SjCHGCS19.P1-P2靶序列检测50条尾蚴日本血吸虫感染兔血清DNA的结果。图中各泳道如下：M∶100bp DNA Ladder分子量标准品；1：正常兔血清；2：感染3天；3～9：感染1周～7周；10～18：感染9周～24周(间隔1周检测)；19：阳性对照。

图7显示了SjCHGCS19.P1-P2靶序列检测日本血吸虫感染兔血清DNA的疗效考核结果。图中各泳道如下：M∶100bp DNA Ladder分子量标准品；1：阴性对照(正常兔的血清)；2-18：依次为感染日本血吸虫尾蚴后8周-24周的外周血清；19-21：为吡喹酮治疗后第18周-20周(感染后25周-27周)血清DNA连续3周转阴；22：阳性对照(日本血吸虫成虫)。

图8显示了SjCHGCS10.P1-P3靶序列的检测敏感性。图中各泳道如下：M∶100bp DNA Ladder分子量标准品；1未稀释的成虫模板DNA；2～7：分别为1∶10～1∶10⁷稀释后的虫体模板DNA；最高检测灵敏度为1∶10⁶(214.7fg/ul)8.空白对照。

图9显示了基于SjCHGCS19.P1-P2靶序列通过巢式PCR法检测日本血吸虫病人血清DNA结果。图中各泳道如下：1～22：感染日本血吸虫不同病人血清的DNA模板(条带反应强度与感染度EPG成正相关)；P：阳性对照；N：阴性对照。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过对日本血吸虫基因组和转录组的研究，发现了25种不同类型新的反转座子序列，其中包括18种LTR反转座子(SjCHGCS1～SjCHGCS18)，4种Non-LTR反转座子(SjCHGCS19～SjCHGCS22)和3种Penelope型的反转座子(Sj-pene1ope1～Sj-pene1ope3)。研究表明，这25种新的反转座子在日本血吸虫基因组中的完整序列拷贝数从1个到130个不等，而不完整序列拷贝数(只有反转座子的部分序列)则从15个到6384个不等。如此众多的拷贝数，使得这25种新的反转座子占据整个日本血吸虫基因组的17％。同时发现其中21种反转座子都具有表达活性。提示这些活动性反转座子(mobile elements)可能在血吸虫进化，致病性和寄生性方面起着重要的作用。在此基础上完成了本发明。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”。

如本文所用，所述的“反转座子序列”和“反转座子”可互换使用，均是指具有选自SEQ ID NO：1-25中任一所示的核苷酸序列。

如本文所用，所述的“多核苷酸集”是一种多核苷酸的集合，其中含有SEQID NO：1-25中任一序列所示的多核苷酸。在用于遗传分析时，可以从所述的多核苷酸选出一条或多条所述的多核苷酸，作为反转座子标记物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

引物

根据本发明反转座子两端的序列，可设计一对特异引物，通过PCR技术将反转座子序列扩增出来，利用测序或电泳分析等技术就可获得其长度多态性。

因此，本发明提供了可用于扩增所述的反转座子的引物(对)。所述的引物(对)根据这些反转座子两端的保守序列进行设计。引物的设计方法为本领域技术人员所熟知的方法。通常，可以针对一个反转座子，根据其两端序列设计不同种引物，通过PCR试验确定最合适的引物。更特别的，在设计引物时，采用相近的Tm温度，以便使这些引物能够在高通量的扩增和检测中使用。此外，确保引物扩增的位点的唯一性是必要的。一般而言，18-26bp的寡核苷酸引物具有较好的特异性。

采用所述的引物，可扩增出血吸虫(特别是日本血吸虫)基因组中相应的反转座子。并且，采用相同的引物对，以不同来源的血吸虫的基因组DNA为模板，可获得包含多态性反转座子结构(如反转座子重复次数不同、或长度不同等)的多核苷酸。

应用

本发明的反转座子及其相应的引物具有多种用途，其中包括但不限于用于：血吸虫遗传关系的确定；血吸虫基因的定位；血吸虫各种或各亚种间的保守性分析；血吸虫的进化分析；或血吸虫的品种鉴定。

遗传分析方法

在得知了本发明提供的各反转座子或其对应的特异性引物后，本领域人员可采用多种本领域已知的技术来确定血吸虫的遗传关系(或亲缘关系)，定位血吸虫的基因，对血吸虫各种或各亚种间进行保守性分析，进行血吸虫进化分析，或进行血吸虫的品种鉴定，或血吸虫地域种群鉴定。由于反转座子的PCR扩增是特异性扩增，其稳定性和重现性都较好。

检测PCR扩增后的产物的方法可以采用本领域人员熟知的技术，最常用最简便的方法是采用琼脂糖凝胶电泳技术。通过比较扩增条带的数目和/或大小来确定扩增产物的差异。该方法操作简单，成本低廉。

另一种更为精细的方法是通过测序仪的基因扫描，从而可很好地分辨出PCR产物大小上1-2碱基的差异。基因扫描可采用本领域人员已知的一些软件，例如GenMapper 4.0软件。

检测试剂盒或系统

本发明还提供了一种检测试剂盒或系统，所述的试剂盒或系统中含有：可特异性扩增选自SEQ ID NO：1-25中任一所示的反转座子序列的引物(对)。

此外，所述的试剂盒中还含有各种分析血吸虫遗传关系、定位血吸虫基因、血吸虫各种或各亚种间保守性分析、血吸虫进化分析或血吸虫品种鉴定所需的其它材料。例如可以包含选自下组的材料：PCR扩增试剂，电泳试剂，PCR产物纯化试剂，或序列分析软件。这些试剂均可以是本领域人员常规使用的。

此外，所述的试剂盒中还可含有的使用说明书，以说明所述试剂盒的使用方法，给出较合适的使用条件。

本发明的优点和效果：

1.开发出一类血吸虫特异的反转座子，所述的反转座子有助于阐明日本血吸虫种群之间的遗传差异。

2.针对各反转座子的特异性引物(对)，所述引物扩增效果良好，扩增产物唯一。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1反转座子的获得以及引物设计

1.日本血吸虫成虫样本DNA的抽提

采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法：

1)取单条虫置入200μl提取缓冲液洗涤虫体3次，2000g离心2min分离洗液；

2)吸干洗涤液，加入20μl抽提缓冲液，用RNAase-free的灭菌小碾磨棒，碾磨虫体至匀浆；

3)加入提取缓冲液至终体积50μl；

4)加入0.5μl RNAase(10ug/μl)，5μl SDS(10％)，0.5μl蛋白质消化酶，用枪反复混匀；

5)在复式水浴恒温振荡器中110转/分56℃消化1h；

6)加入等体积50μl苯酚：氯仿：异丙醇为25∶24∶1的混合液，混匀，10000g，离心5min；

7)取上清，加入50μl氯仿：异丙醇为24∶1的混合液，混匀，10000g，离心5min；

8)取上清，加入80μl无水乙醇，混匀，-30℃过夜；

9)加入1ml 70％乙醇，10000g，离心15min；

10)取下层溶液加入10μl ddH₂O，待用。

或采用蛋白酶K消化法：

1)用200μl GNT缓冲液洗涤虫体3次，2000g，离心2min分离洗涤液；

2)吸干洗涤液，加入20μl GNT缓冲液，用一根RNAase-free的灭菌小碾磨棒，碾磨虫体至匀浆；

3)加入40μl GNT缓冲液，旋转10s；

14)加入1μl蛋白酶消化酶，用移液器反复混匀，在复式水浴恒温振荡器中110转/分于56℃消化1h；

5)10000g，离心5min，室温放置，转移上清至一只干净1.5ml EP管中；

6)加入50μl NID缓冲液，振荡30s，置室温3min；

7)旋转混合30s，95℃15min灭活蛋白酶消化酶；

8)10000g，离心5min，取上清至一干净1.5ml EP管中，待用。

2.反转座子的获得

对提取的DNA进行测序，获得基因组序列数据。然后从基因组数据库获取初始数据，经过进一步分析、实验和选择，最后获得25个反转座子，它们的序列依次如SEQ ID NO：1-25所示。

基于SEQ ID NO：1-25所示的序列，采用Primer 5.0软件设计引物，分别合成25对特异性引物。以日本血吸虫样本的全基因组DNA为模板，扩增出相应的对于25种反转座子的扩增产物。

PCR循环条件为：95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。PCR反应体系为：25ng基因组DNA，2个单位的SBS Taq聚合酶，双向引物各10pm，1.25mM MgCl₂，1μl10×反应缓冲液，0.5μl dNTPs(2.5mM，TaKaRa)。

用常规方法对PCR产物进行纯化，然后进行遗传学特征分析，遗传分析方法如下：

(1).对PCR产物进行电泳鉴定

通过电泳分析扩增产物的条带数目和/或位置情况，扩增产物的条带数目和/或位置一致性越高，表示两种血吸虫之间的遗传关系越近；扩增产物的条目数目和/或位置差异越大，表示两种血吸虫之间的遗传关系越远。

(2).样本的基因扫描

PCR产物用ABI 3730XL自动测序仪分离，以ABI Genescan-500LIZ(Applied Biosystems)分子内标测定PCR产物的DNA片段的确切长度。并用ABI 3730XL和GenMapper 4.0软件(Applied Biosystems)进行初始数据处理。

结果：

25种不同类型新的反转座子序列(如表1所示)，其中包括18种LTR反转座子(SjCHGCS1～SjCHGCS18)，4种Non-LTR反转座子(SjCHGCS19～SjCHGCS22)和3种Penelope型的反转座子(Sj-pene1ope1～Sj-pene1ope3)。研究表明，这25种新的反转座子在日本血吸虫基因组中的完整序列拷贝数从1个到130个不等，而不完整序列拷贝数(只有反转座子的部分序列)则从15个到6384个不等。如此众多的拷贝数，使得这25种新的反转座子占据整个日本血吸虫基因组的17％。同时发现其中21种反转座子都具有表达活性。提示这些活动性反转座子(mobileelements)可能在血吸虫进化，致病性和寄生性方面起着重要的作用。

本发明人对LTR，Non-LTR和penelope型的反转座子也进行了结构分析。在18种LTR反转座子中，除SjCHGCS8，SjCHGCS10和SjCHGCS14外，剩余15种LTR反转座子都在两端具有长末端重复序列(LTR)，长度从190bp到1236bp不等；所有的18种LTR反转座子都具有完整的polyprotein编码框；除SjCHGC5和SjCHGC8外，剩余16种LTR反转座子在polyprotein编码框中，都能区分出蛋白酶(Protease)，反转录酶(Reverse Transcriptase)，RNA酶H(RNaseH)和整合酶(Integrase)的编码基因；SjCHGC5中只能鉴定出蛋白酶的编码序列，SjCHGC8中则是无法鉴定出蛋白酶的编码序列。4种Non-LTR和3种penelope型的反转座子中，只有SjCHGCS22没有完整的polyprotein编码框，而Sj-pene1ope2的两端则发现有一段长137bp的反向重复序列。

基于对这25种新的日本血吸虫反转座子序列的精确分析，本发明人认为这些新发现的反转座子序列可作为潜在的血吸虫病检测标志物，并且可从中寻找与日本血吸虫的致病性和免疫逃避等相关的靶点，可利用这些反转座子作为基因治疗的载体，帮助研究抗血吸虫病的疫苗以及药物。

实施例2

基于反转座子SjCHGCS 19的检测方法和应用

诊断在血吸虫病防治活动中始终处于中心位置。迄今为止，病原学检查，即从流行区人的粪便中查见虫卵，仍是血吸虫病惟一的确定诊断途径和手段。某种病原体感染机体时，把它们的基因也带入人体，理论上讲，只要病原体存在，机体内就会有其核酸物质存在。针对表1中所列出的日本血吸虫基因组中的25个反转座子，在本实施例中选用反转座子SjCHGCS 19(SEQID NO：19)作为代表进行深入研究。

结果表明，反转座子SjCHGCS 19多核苷酸适合作为血吸虫病检测标志物，也适合用于制备检测血吸虫的试剂盒或DNA芯片。

例如，将SjCHGCS 19P1-P2片段(303bp)及其SjCHGCS19P3-P4片段(607bp)(S19P1引物：AAGGCGTTTGACAGCGTAG(SEQ ID NO：26)；S19P2引物：ATCATCCGCGAAGTCCAG(SEQ ID NO：27)；S19P3引物：CCAAATCGCAACACTACGC(SEQ ID NO：28)；S19P4引物：ATCGGATTCTCCTTGTTCAT(SEQ ID NO：29))作为靶序列(图1)，应用巢式PCR法检测日本血吸虫特异性DNA显示出极高的敏感性和特异性，其中敏感性可提高至2拷贝(图2、图3和图4)，并且与肝吸虫无交叉反应(图5)。

进一步对感染日本血吸虫动物模型血清DNA检测结果表明，从感染50条尾蚴日本血吸虫后3天的家兔血清中即可扩增出分子量为303bp的日本血吸虫特异性DNA片段(图6)。此外，还检测了感染1500条，500条，200条，100条和30条尾蚴日本血吸虫感染的兔的血清DNA，均获得了与图6一致的结果。因此，本发明方法非常适用于早期检测。

此外，对经吡喹酮治疗后的血清样本检测结果显示，本发明的反转座子具有较好的疗效考核价值，血清中日本血吸虫DNA于治疗后17周转阴而其特异性抗体仍维持在高水平(图7)。

此外，应用SjCHGCS19.P1-P2靶序列对日本血吸虫病慢性病人的血清进行DNA检测，结果如表1和图9所示。

表1巢式PCR法对日本血吸虫病病人血清DNA检测结果

注：100例病人血清来自湖南省血吸虫病疫区，均为EPG检测阳性。

令人特别感兴趣的是，如图9所示，感染日本血吸虫不同病人血清的DNA的扩增条带反应强度与感染度EPG成正相关。

实施例3

基于反转座子SjCHGCS 10的检测方法和应用

与实施例2类似，在本实施例中选用反转座子SjCHGCS 10(SEQ ID NO：10)作为代表进行深入研究。

日本血吸虫反转座子SjCHGCS10.P1-P3靶序列检测敏感性结果如图8所示，其最高检测灵敏度为1∶10⁶(214.7fg/ul)。其中引物为SjCHGCS 10.P1：GCCAGTGGGCATCTCCTT(SEQ ID NO：30)；SjCHGCS10.P3：CGGGCTGGCAATCAGTAA(SEQID NO：31)。

此外，应用SjCHGCS10.P1-P3靶序列对日本血吸虫病慢性病人的血清进行DNA检测。与实施例2的检测结果类似，阳性检出率也高达92％以上，并且DNA的扩增条带反应强度也与感染度EPG成正相关。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。